7.8K Views
•
11:39 min
•
June 9th, 2019
DOI :
June 9th, 2019
•0:04
Title
1:18
Cell Culture on Day 1
4:37
Preparation of Reagents and Pre-washing Centrifugal Filter Units
6:17
Cell Culture on Day 2
7:24
Extraction of Metabolites from Cultured Cells and Ultrafiltration of Cell Extracts
8:55
Results: Diamide Treatment
10:42
Conclusion
Transcript
Formålet med denne artikkelen er å gi en detaljert, trinnvis visuell protokoll for å trekke ut vandige metabolitter fra kultiverte kreftceller for påfølgende metabolomanalyse. Den største fordelen med denne teknikken er dens enkelhet og pålitelighet for å trekke ut metabolitter fra tilhengerceller. Men fremfor alt er det godt optimalisert for metabolomanalyse ved hjelp av kapillær elektroforese-massespektrometri eller CEMS.
Metabolomics er en kraftig teknikk for å identifisere biomarkører eller oppdage tidlig stadium kreft og forutsi kjemoterapi respons på kreftpasienter. Vi bruker kreftceller i denne demonstrasjonen. Denne teknikken kan imidlertid også brukes til å høste metabolitter fra andre tilslutninger som fibroblaster i iPS-celler.
Metabolittkonsentrasjoner normaliseres basert på antall levedyktige celler. Så forsiktig utarbeidelse av kultur, dette er nøkkelen for å oppnå gode reproduserbare data. Å demonstrere prosedyren vil være Ami Maruyama, en tekniker fra laboratoriet mitt.
Til å begynne, plate HCC827 og PC-9 celler i 100-millimeter retter som inneholder 10 milliliter RPMI-1640 medium supplert med 10% fostervin serum. Legg rettene i en inkubator på 5% karbondioksid og 37 grader Celsius i 24 timer til kultur. Etter inkubasjon vipper du forsiktig de 100 millimeter kulturrettene for å aspirere cellekulturmediene.
Vask celler på hver tallerken ved hjelp av to milliliter fosfatbufret saltløsning uten kalsium og magnesium. Rock forsiktig hver tallerken slik at PBS-løsningen helt dekker overflaten av parabolen, og vipp deretter oppvasken for å aspirere vaskebufferen. Varm 0,25% trypsin-EDTA løsning til 37 grader Celsius.
Med en fem milliliter serologisk pipette, tilsett to milliliter av den oppvarmede trypsin-EDTA-løsningen til hver tallerken. Stein forsiktig hver tallerken slik at trypsinen helt dekker overflaten av parabolen. Inkuber kulturretter på 37 grader Celsius i ca fem minutter.
Deretter legger du til fire milliliter av det forhåndsoppvarmede komplette vekstmediet til hver tallerken. Og forsiktig pipette flere ganger for å re-suspendere cellene i medium. Overfør hver celle suspensjon til en egen 15-milliliter konisk rør.
Sentrifuge på 800 ganger g i fem minutter. Kast den overnaturlige og re-suspendere hver celle pellet i to milliliter av den forvarmede komplett vekst medium. Bland 10 mikroliter av cellefjæringen med 10 mikroliter på 0,4 % trypanblå oppløsning, i et 1,5 milliliter mikrorør.
Legg 10 mikroliter av blandingen inn i et celletellingskammer, skyv gjennom kapillærhandling. Sett inn kammerlysbildet i den automatiserte celletelleren, og trykk på opptaksknappen for å ta bildet og vise resultatene av det totale antallet og prosent levedyktigheten til cellene. Hvis det totale cellenummeret er over 0,5 millioner celler per milliliter, legg til ytterligere vekstmedium til det 15-milliliter koniske røret for å oppnå ønsket cellekonsentrasjon.
Nå legger du til to til fem milliliter av kulturen til hver 100 millimeter cellekulturrett for å frø omtrent en til 2 1 / 2 millioner celler per tallerken. Inkuber kulturrettene i 5% karbondioksid ved 37 grader Celsius i 18 timer. Først, i en 15-milliliter volumetrisk kolbe, fortynne en kommersiell intern standardløsning som inneholder L-Methionine sulfon og D-Camphor-10-sulfonic acid 1, 000 ganger i ultrapure vann.
Oppløs mannitol i ultrapure vann for å forberede en 0,05 gram per milliliter mannitolløsning i ultrapure vann som vaskebuffer. Deretter, inn i filterkoppen til hver sentrifugalfilterenhet, pipette 250 mikroliter ultrapure vann. Cap filterenhetene tett, og sentrifuge på 9, 100 ganger g ved fire grader Celsius i fem minutter.
Kontroller volumet på hver filtrat. Hvis det har oppsamled betydelig filtrat i løpet av det første korte spinnet, kan filterenheten være defekt. Kast filterenheten og bruk en ny filterenhet i stedet.
Lukk lokkene på filterenhetene tett og sentrifuge igjen ved 9, 100 ganger g ved fire grader Celsius i 30 minutter. Pass på at det ikke er noe ultrarent vann igjen i noen av filterkoppene, og fjern det filtrerte ultrapure vannet i hvert oppsamlingsrør med en pipette. Plasser filterkoppene tilbake i oppsamlingsrørene, og bruk sentrifugalfilterenhetene innen en time for å unngå skade ved tørking.
Ta ut 100-millimeter kulturretter fra inkubatoren og aspirer cellekulturmediet fra hver tallerken. Tilsett 10 milliliter PBS kulturmedium med eller uten 250 mikromolardiamid til hver tallerken, og ta vare på å ikke forstyrre cellelaget. Inkuber kulturretter på 37 grader Celsius i 30 minutter.
Etter inkubasjon, aspirer cellekulturmediet fra hver 100 millimeter kulturrett. Litt vippe parabolen, og forsiktig legge til to milliliter av 5% mannitol vaskebuffer til kanten av hver tallerken for å vaske cellene, ta vare på ikke å forstyrre cellelaget. Aspirer vaskebufferen fra hver kulturrett, og vask cellene igjen ved å vippe parabolen litt og forsiktig legge til 10 milliliter vaskebuffer per tallerken.
Deretter aspirerer vaskebufferen helt fra kanten av hver kulturrett. Nå legger du til 800 mikroliter med 99,7% metanol per kulturrett, og forsiktig rock hver kulturrett frem og tilbake, for å dekke hele overflaten. La oppvasken stå ved romtemperatur i 30 sekunder.
Tilsett sakte 550 mikroliter av den fortynnede interne standardløsningen per tallerken ved å senke tuppen av pipetten i metanol og forsiktig pipettering opp og ned, flere ganger. Rock forsiktig hver kulturrett frem og tilbake for å dekke hele overflaten, og la oppvasken stå ved romtemperatur i 30 sekunder. Deretter overfører du den ekstraherte løsningen fra hver kulturrett til et separat 1,5-milliliter mikrocentrifugerør.
Sentrifuger rørene på 2, 300 ganger g ved fire grader Celsius i fem minutter. Overfør 700 mikroliter av hver supernatant til to sentrifugalfilterenheter, med 350 mikroliter per enhet. Sentrifuger filterrørene ved 9, 100 ganger g ved fire grader Celsius i ca. to timer, til det ikke er væske igjen i filterkoppene.
Fjern filterkoppene, og lukk lokkene på oppsamlingsrørene tett. I denne studien vokste HCC827- og PC-9-cellene likt i tre timer. CEMS-analyse indikerer forskjell mellom diamidbehandlede celler og PBS-behandlede celler for begge cellelinjene.
Blant disse var flere mellomprodukter i pentosefosfatbanen og i øvre glykose signifikant høyere i de diaamidbehandlede forholdene, mens noen trikarboksylic syklus mellomprodukter var lavere under de behandlede forholdene. Metabolomprofiler av intracellulære metabolitter viste henholdsvis 175 og 150 differensialmetabolitter i HCC827- og PC-9-celler. Etter diaamidbehandling økte nivået av gluklonsyre og oksidert glukose 12 ganger i HCC827-celler og 10 ganger i PC-9-celler.
Tilsvarende økte nivået av glukose 6-fosfat, en fosforylert glukose i det første hexokinasekatalyserte glykoseproduktet, også 6,3- og 3,5 ganger i HCC827- og PC-9-celler. I tillegg økte nivåene av 6-fosfosfat, det første mellomliggende i pentosefosfatbanen, dramatisk 89 ganger i HCC827-celler og 231 ganger i PC-9-celler. I motsetning endret nivåene av andre glykolytiske mellomprodukter som fruktose 6-fosfat ikke i diamid eksperimentell tilstand.
Totale nikotinamimid adenin dinucleotid fosfatnivåer var nesten like mellom diamidbehandling og PBS kontrollforhold. Bruk av 5% mannitol løsning, annet enn PBS, som vaskebuffer for vaskeceller er svært viktig for CEMS analyse, fordi saltbaserte buffere forstyrrer analysen og påvirker målingen negativt. Denne protokollen er uegnet for å trekke ut hydrofobe metabolitter som lipider, så vi må utvikle en protokoll for praktisk utpakking av både hydrofile og hydrofobe metabolitter for mer omfattende metabolomanalyse.
Denne teknikken realiserer en enkel ekstraksjon av metabolitter fra nesten alle tilhengere celler, og dermed gjelder for en rekke forskning som kreft, stamceller, farmakologi, ernæring, og kosmetisk vitenskap.
Formålet med denne artikkelen er å beskrive en protokoll for ekstraksjon av vandige metabolitter fra kultivert tilhenger celler for metabolomic analyse, spesielt, kapillær elektroforese-masse massespektrometri.
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved