7.8K Views
âą
11:39 min
âą
June 9th, 2019
DOI :
June 9th, 2019
âą0:04
Title
1:18
Cell Culture on Day 1
4:37
Preparation of Reagents and Pre-washing Centrifugal Filter Units
6:17
Cell Culture on Day 2
7:24
Extraction of Metabolites from Cultured Cells and Ultrafiltration of Cell Extracts
8:55
Results: Diamide Treatment
10:42
Conclusion
Transcript
Syftet med denna artikel Àr att ge en detaljerad, stegvis visuella protokoll för att extrahera vattenhaltiga metaboliter frÄn odlade cancerceller för efterföljande metabolom analys. Den största fördelen med denna teknik Àr dess enkelhet och tillförlitlighet för att extrahera metaboliter frÄn anhÀngare celler. Men framför allt, det Àr vÀl optimerad för metabolomanalys med hjÀlp av kapillÀr-masspektrometri eller CEMS.
Metabolomik Àr en kraftfull teknik för att identifiera biomarkörer eller upptÀcka tidig cancer och förutsÀga kemoterapi svar pÄ cancerpatienter. Vi anvÀnder cancerceller i denna demonstration. Emellertid, denna teknik kan ocksÄ tillÀmpas för att skörda metaboliter frÄn andra anhÀngare celler sÄsom fibroblaster i iPS-celler.
Metabolitkoncentrationerna normaliseras baserat pÄ antalet livskraftiga celler. SÄ noggrann förberedelse av kultur, Àr detta nyckeln för att erhÄlla bra reproducerbara data. Demonstrera förfarandet kommer att Ami Maruyama, en tekniker frÄn mitt laboratorium.
Till att börja, plattan HCC827 och PC-9 celler i 100-millimeters rÀtter som innehÄller 10 milliliter av RPMI-1640 medium kompletteras med 10%fetala nötkreatur serum. Placera disken i en inkubator pÄ 5%koldioxid och 37 grader Celsius i 24 timmar till kultur. Efter inkubationen, försiktigt luta 100-millimeters kultur rÀtter att aspirera cellkultur media.
TvÀtta celler pÄ varje matrÀtt med hjÀlp av tvÄ milliliter fosfatbuffrad saltlösning utan kalcium och magnesium. Försiktigt klippa varje matrÀtt sÄ att PBS lösningen helt tÀcker ytan av skÄlen, sedan luta disken att aspirera tvÀtt buffert. Varm 0,25%trypsin-EDTA-lösning till 37 grader Celsius.
Med en fem-milliliter serologisk pipetten, tillsÀtt tvÄ milliliter av den uppvÀrmda trypsin-EDTA lösningen till varje matrÀtt. Försiktigt klippa varje matrÀtt sÄ att trypsin helt tÀcker ytan av skÄlen. Inkubera kulturrÀtterna vid 37 grader Celsius i cirka fem minuter.
TillsĂ€tt sedan fyra milliliter av det förvĂ€ttade kompletta tillvĂ€xtmediet till varje matrĂ€tt. Och försiktigt pipettera flera gĂ„nger för att Ă„ter upphĂ€va cellerna i medium. Ăverför varje cellupphĂ€ngning till ett separat 15-milliliter koniskt rör.
Centrifugera vid 800 gÄnger g i fem minuter. Kassera supernatanten och ÄteruppstÀng varje cellpellets i tvÄ milliliter av det förvuppverade kompletta tillvÀxtmediet. Blanda 10 mikroliter av cellupphÀngningen med 10 mikroliter av 0,4%trypan blÄ lösning, i en 1,5-milliliter microtube.
Ladda 10 mikroliter av blandningen i en cellrÀkningskammare glida genom kapillÀrverkan. SÀtt in kammarrutskan i den automatiserade cellrÀknaren och tryck pÄ infÄngstknappen för att fÄnga bilden och visa resultatet av cellernas totala antal och procentiga bÀrbarhet. Om det totala celltalet Àr över 0,5 miljoner celler per milliliter, tillsÀtt ytterligare tillvÀxtmedium till det koniska röret pÄ 15 milliliter för att erhÄlla önskad cellkoncentration.
Nu, tillsÀtt tvÄ till fem milliliter av kulturen till varje 100-millimeters cellodling skÄlen att utsÀde ungefÀr en till 2 1/2 miljoner celler per skÄlen. Inkubera kulturrÀtterna i 5%koldioxid vid 37 grader Celsius i 18 timmar. Först, i en 15-milliliter volymetrisk kolv, spÀd en kommersiell intern standardlösning som innehÄller L-Metionin sulfon och D-Kamfer-10-sulfonsyra 1, 000-faldigt i ultrarent vatten.
Lös upp mannitol i ultrarent vatten för att förbereda en 0,05 gram per milliliter mannitollösning i ultrarent vatten som tvÀttbuffert. Sedan, i filterkoppen pÄ varje centrifugalfilterenhet, pipetter 250 mikroliter av ultrarent vatten. Kapa filterenheterna tÀtt, och centrifug vid 9, 100 gÄnger g vid fyra grader Celsius i fem minuter.
Kontrollera volymen pÄ varje filtrat. Om betydande filtrat har samlats under det första korta spinnet kan filterenheten vara defekt. Kassera filterenheten och anvÀnd en ny filterenhet i stÀllet.
StÀng filtrenas locken tÀtt och centrifugera igen vid 9, 100 gÄnger g vid fyra grader Celsius i 30 minuter. Se till att inget ultrarent vatten finns kvar i nÄgon av filterkopparna, och ta bort det filtrerade ultrapurevattnet i varje uppsamlingsrör med en pipett. Placera tillbaka filterkopparna i sina uppsamlingsrör och anvÀnd centrifugalfilterenheterna inom en timme för att undvika skador vid torkning.
Ta ut 100-millimeters kulturrÀtter frÄn inkubatorn och aspirera cellodlingsmediet frÄn varje matrÀtt. TillsÀtt 10 milliliter PBS odlingsmedium med eller utan 250 mikromolardiamid till varje matrÀtt, var noga med att inte störa cellskiktet. Inkubera kulturrÀtterna vid 37 grader Celsius i 30 minuter.
Efter inkubation, aspirera cellodlingsmediet frÄn varje 100-millimeters odlingsfat. NÄgot luta skÄlen, och försiktigt lÀgga till tvÄ milliliter av 5%mannitol tvÀtt buffert till kanten av varje matrÀtt för att tvÀtta cellerna, var noga med att inte störa cellskiktet. Aspirera tvÀttbufferten frÄn varje odlingsfat och tvÀtta cellerna igen genom att luta skÄlen nÄgot och försiktigt lÀgga till 10 milliliter tvÀttbuffert per fat.
Sedan, helt aspirera tvÀttbufferten frÄn kanten av varje odlingsfat. Nu, tillsÀtt 800 mikroliter av 99,7%metanol per kultur skÄlen, och försiktigt rock varje kultur skÄlen fram och tillbaka, för att tÀcka hela sin yta. LÄt disken vara i rumstemperatur i 30 sekunder.
TillsÀtt lÄngsamt 550 mikroliter av den utspÀdda interna standardlösningen per fat genom att doppa pipettens spets i metanolen och försiktigt pipettera upp och ner, flera gÄnger. Försiktigt klippa varje kultur skÄlen fram och tillbaka för att tÀcka hela sin yta, och lÄt disken i rumstemperatur i 30 sekunder. Sedan överför du den extraherade lösningen frÄn varje odlingsfat till ett separat 1,5-milliliter mikrocentrifugrör.
Centrifugera rören vid 2, 300 gĂ„nger g vid fyra grader Celsius i fem minuter. Ăverför 700 mikroliter av varje supernatant till tvĂ„ centrifugalfilterenheter, med 350 mikroliter per enhet. Centrifugera filterrören vid 9, 100 gĂ„nger g vid fyra grader Celsius i ungefĂ€r tvĂ„ timmar, tills ingen vĂ€tska finns kvar i filterkopparna.
Ta bort filterkopparna, och stÀng tÀtt locken pÄ uppsamlingsrören. I denna studie, HCC827 och PC-9 celler vÀxte lika i tre timmar. CEMS-analys indikerar skillnad mellan diamidbehandlade celler och PBS-behandlade celler för bÄda cellinjerna.
Bland dessa var flera intermediÀrer i pentophosphate vÀgen och i övre glykolys betydligt högre i diamid-behandlade villkor, medan nÄgra tricarboxylic cykel intermediÀrer var lÀgre i de behandlade villkoren. Metabolom profiler av intracellulÀra metaboliter visade 175 och 150 differential metaboliter i HCC827 och PC-9 celler, respektive. Efter diamidbehandling ökade nivÄn av glukonsyra och oxiderad glukos 12-faldig i HCC827-celler och 10-faldigt i PC-9-celler.
PÄ samma sÀtt ökade ocksÄ nivÄn av glukos 6-fosfat, en fosforylerat glukos i den första hexokinas-katalyserade glykolysprodukten, 6,3- och 3,5-faldiga i HCC827 respektive PC-9- celler. Dessutom ökade nivÄerna av 6-fosfoglukonat, den första intermediÀren i pentose fosfatvÀgen, dramatiskt 89-faldigt i HCC827 celler och 231-faldigt i PC-9 celler. DÀremot Àndrades inte nivÄerna av andra glykolytiska intermediÀrer som fruktos 6-fosfat i det experimentella diamidvillkoret.
Totala nikotinamid adenin dinukleotid fosfat nivÄer var nÀstan likvÀrdig mellan diamid behandling och PBS kontroll villkor. Att anvÀnda 5%mannitollösning, andra Àn PBS, som tvÀttbuffert för tvÀttceller Àr mycket viktigt för CEMS-analys, eftersom saltbaserade buffertar stör analysen och pÄverkar mÀtningen negativt. Detta protokoll Àr olÀmpligt för att utvinna hydrofoba metaboliter som lipider, sÄ vi mÄste utveckla ett protokoll för bekvÀmt utvinna bÄde hydrofila och hydrofoba metaboliter för mer omfattande metabolomanalys.
Denna teknik inser en enkel utvinning av metaboliter frÄn nÀstan alla anhÀngare celler, och dÀrmed, Àr tillÀmplig för en mÀngd olika forskning sÄsom cancer, stamceller, farmakologi, nutrition, och kosmetisk vetenskap.
Syftet med denna artikel Àr att beskriva ett protokoll för extraktion av vattenhaltiga metaboliter frÄn odlade anhÀngare celler för metabolomiska analys, sÀrskilt kapillÀr elektrofores-masspektrometri.
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved