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April 28th, 2019
DOI :
April 28th, 2019
•0:04
Title
1:20
Automated Synthesis of [11C]SNAP-7941 for Preclinical Use
4:40
Quality Control (QC) of [11C]SNAP-7941
5:55
Real-Time Kinetic Assay
8:02
Results: Evaluation of [11C]SNAP-7941 Interactions Towards the Permeability Glycoprotein 1 (P-gp) Transporter
8:44
Conclusion
Transcript
कार्बन-11 रेडियोलाबेलिंग अणु को बदले बिना पॉजिट्रॉन उत्सर्जन टोमोग्राफी या पीईटी के लिए छोटे यौगिकों का उपयोग करने की अनुमति देता है। यह रिसेप्टर अभिव्यक्ति के स्तर की जांच के लिए आवश्यक है । कार्बन-11 रेडियोलाबेलिंग का लाभ यह है कि हम वास्तविक समय में मेलेनिन-ध्यान केंद्रित हार्मोन रिसेप्टर की ओर स्नैप के बाइंडिंग का मूल्यांकन करने के लिए पीईटी का उपयोग कर सकते हैं।
एक मेलानिन केंद्रित हार्मोन रिसेप्टर विरोधी के रूप में स्नैप इस रिसेप्टर और मोटापे और मधुमेह की तरह चयापचय की स्थिति के साथ अपने सहयोग की एक बेहतर समझ में योगदान देगा । रक्त-मस्तिष्क बाधा पर व्यक्त किए गए एफफ्लक्स ट्रांसपोर्टर केंद्रीय रिसेप्टर अभिव्यक्ति इमेजिंग के लिए रेडियोफार्मास्यूटिकल्स के उपयोग में काफी बाधा डाल सकते हैं। इसलिए विट्रो में निशान का मूल्यांकन करना महत्वपूर्ण है।
स्नैप का स्वचालित रेडियोसिंथेसिस मोटे तौर पर एक आसानी से मूल्यांकन योग्य मिथाइल समूह के साथ रेडियोलेबल कम आणविक वजन यौगिकों पर लागू होता है। एक बार स्थापित होने के बाद इस प्रक्रिया को अन्य यौगिकों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। प्रदर्शन में सहायता वरिष्ठ पीएचडी छात्रों सारा Pfaff और थेरेसा बल्बर होगा ।
कार्बन-11 स्नैप संश्लेषण शुरू करने के लिए उपयुक्त अभिकर् ती और सामग्रियों के साथ एक स्वच्छ कार्बन-11 स्वचालित संश्लेषण मॉड्यूल की स्थापना की। मॉड्यूल कंप्यूटर पर स्नैप संश्लेषण प्रक्रिया शुरू करें जो सिस्टम चेक और कंडीशनिंग के साथ शुरू होगा। मॉड्यूल सी-11 डिलीवरी के लिए तैयार होने से करीब 30 से 40 मिनट पहले साइक्लोट्रॉन पर सी-11 कार्बन डाई ऑक्साइड टारगेट का चयन करें और बीम को 65 माइक्रोएम्पर्स पर शुरू करें।
एक बार मॉड्यूल प्रसव के लिए तैयार है भीतरी खिड़की और बाहरी दरवाजे बंद करो। पुष्टि करें कि सीओ 2 ट्रैप कम से कम 40 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा हो गया है और मीथेन ट्रैप ठंडा होने लगा है। एक बार साइक्लोट्रॉन ने सीओ 2 ट्रैप के माध्यम से लक्ष्य से रास्ता खोलने के लिए मॉड्यूल सॉफ्टवेयर में सी-11 CO2 क्लिक ओके के लगभग 120 गीगाबेक्वेरेल का उत्पादन किया है।
साइक्लोट्रॉन कंप्यूटर मॉड्यूल के लिए सी-11 CO2 वितरित करना शुरू करते हैं। मॉड्यूल कंप्यूटर पर गतिविधि हस्तांतरण की निगरानी करें और यह सुनिश्चित करें कि यह तीन मिनट के बाद मीथेन में CO2 की कमी के लिए आय । प्रक्रिया की निगरानी के रूप में जिसके परिणामस्वरूप मीथेन मीथेन जाल में निकाल दिया है और आयोडीन ओवन के माध्यम से परिसंचरण द्वारा मिथाइल आयोडाइड में परिवर्तित हो गया है ।
रूपांतरण अनुक्रम के अंत में प्रतीक्षा करें क्योंकि उपउत्पादों को मिथाइल आयोडाइड जाल से निकास के लिए निकाल दिया जाता है और फिर पुष्टि करते हैं कि रिएक्टर ओके पर क्लिक करके गतिविधि प्राप्त करने के लिए तैयार है। मिथाइल आयोडाइड जाल से जारी किया जाता है, मिथाइल ट्राइप्लेट ओवन के माध्यम से निकाल दिया और रिएक्टर में फंस के रूप में प्रणाली की निगरानी करें। जब रिएक्टर पठारों में गतिविधि इस बात की पुष्टि करती है कि ट्रैपिंग पूरी हो गई है। रुको जब प्रतिक्रिया मिश्रण तीन मिनट के लिए ७५ डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया करता है ।
फिर सिस्टम की निगरानी करें क्योंकि प्रतिक्रिया मिश्रण को 35 डिग्री सेल्सियस से नीचे ठंडा किया जाता है और 1.5 मिलीलीटर पानी के साथ बुझाया जाता है। सिस्टम की निगरानी करें क्योंकि प्रतिक्रिया मिश्रण एचपीएलसी इंजेक्शन लूप में लोड किया जाता है और अर्ध-तैयारी एचपीएलसी कॉलम में इंजेक्ट किया जाता है। क्रोमेटोग्राफी आय के रूप में यूवी और गामा डिटेक्टर निशान देखो।
जब उत्पाद शिखर मैन्युअल रूप से मॉड्यूल में राउंड बॉटम कलेक्शन फ्लास्क में उत्पाद एकत्र करना शुरू कर देता है। मैन्युअल रूप से अंत संग्रह जब गामा सिग्नल प्रति सेकंड लगभग 400 मायने रखता है। गोल नीचे फ्लास्क में तरल पदार्थ का स्तर देखें क्योंकि उत्पाद हीलियम दबाव में एक ठोस चरण निष्कर्षण कारतूस पर लोड किया जाता है।
एक बार फ्लास्क खाली हो जाता है और तरल एसपीई कारतूस के माध्यम से पारित हो जाता है, तो कारतूस पर फंसे उत्पादों को धोना शुरू करने के लिए ठीक क्लिक करें। फिर उत्पाद संग्रह शीशी में गतिविधि की निगरानी करें क्योंकि उत्पाद को पहले कारतूस से शीशी में निकाला जाता है और फिर 0.9% खारा समाधान के साथ पतला किया जाता है। देखो के रूप में उत्पाद समाधान हीलियम दबाव के तहत बाँझ फिल्टर के माध्यम से उत्पाद शीशी को हस्तांतरित किया जाता है ।
जब स्थानांतरण पूरी तरह से उत्पाद उत्पादन वाल्व बंद हो जाता है। जब रेडियोट्रेसर उत्पाद शीशी में आता है पूर्ण रेडियोधर्मी उपज को मापने । फिर गुणवत्ता नियंत्रण के लिए एक छोटी शीशी में ट्रेसर के 100 माइक्रोलीटर स्थानांतरित करने के लिए एक लीड परिरक्षित सिरिंज का उपयोग करें।
गुणवत्ता नियंत्रण नमूना को परिरक्षित गुणवत्ता नियंत्रण कार्य क्षेत्र में लाएं। क्यूसी नमूने के 40 माइक्रोलीटर को गैस-तंग सिरिंज में खींचें, इसे विश्लेषणात्मक कॉलम से लैस एक तैयार एचपीएलसी उपकरण में लोड करें और उत्पाद को इंजेक्ट करें। एचपीएलसी रन के दौरान अन्य गुणवत्ता नियंत्रण माप करें।
एक बार एचपीएलसी रन रेडियोधर्मिता डिटेक्टर से क्रोमोग्राम में सभी चोटियों को एकीकृत करने के लिए निर्धारित करने के लिए कि क्या स्नैप रेडियो रासायनिक शुद्धता से अधिक है ९५% से अधिक है यूवी क्रोमाटोग्राम में चोटियों को एकीकृत करने के लिए उत्पाद की रासायनिक शुद्धता का निर्धारण । विशिष्ट गतिविधि की गणना करने के लिए यूवी उत्पाद पीक के तहत क्षेत्र का उपयोग करें। एक बार उत्पाद के उपयोग के लिए आवश्यकताओं को पूरा करने की पुष्टि की गई है वास्तविक समय गतिज प्रयोग प्रयोगशाला के लिए रेडियो ट्रेसर जारी ।
प्रयोग से कम से कम 30 मिनट पहले तैयार जंगली प्रकार या संक्रमित कोशिकाओं को डीपीबीएस के साथ धोएं और सीरम मुक्त विकास माध्यम के दो मिलीलीटर जोड़ें। संक्रमित कोशिकाओं को अवरुद्ध करने के लिए डाइमिथाइल सल्फॉक्साइड में रेसमिक वेरापामिल हाइड्रोक्लोराइड के 20.4 मिलीमोलर समाधान के 0.98 माइक्रोलीटर जोड़ें। 30 मिनट के लिए एक तिरछे विमान पर कोशिकाओं को इनक्यूबेट।
फिर वास्तविक समय परख साधन और संबंधित कंप्यूटर चालू करें। नियंत्रण सॉफ्टवेयर खोलें और एक लक्ष्य चुनें। पदों की संख्या को दो, डिटेक्शन समय को तीन सेकंड तक, डिटेक्शन देरी का समय दो सेकंड और पहले चरण का नाम बेसलाइन पर सेट करें ।
नीचे की ओर सेल पोल के साथ डिवाइस के इच्छुक समर्थन में सेल कल्चर डिश डालें। सुनिश्चित करें कि सेल पोल सेल कल्चर मीडियम में कवर किया गया है। 10 मिनट का बैकग्राउंड माप शुरू करें और फाइलनाम और पथ सेट करें।
मिनट के लिए समय पैमाने और कार्बन-11 के लिए nuclide संग्रह निर्धारित करें । पृष्ठभूमि, लक्ष्य और पृष्ठभूमि घटाया लक्ष्य डेटा दिखाने के लिए ग्राफ कॉन्फ़िगर करें। एक बार रेडियो ट्रेसर दिया गया है और उपयोग के लिए मंजूरी दे दी है, परख के लिए एक छोटा सा नमूना ले लो ।
रेडियो ट्रेसर समाधान की आवश्यक मात्रा की गणना करें और एक पिपेट तैयार करें। साधन सॉफ्टवेयर में रन को रोकें और डिश रोटेशन को रोकने के लिए प्रतीक्षा करें। डिवाइस के ढक्कन को खोलें, समर्थन को 90 डिग्री बाईं ओर घुमाएं, तैयार पिपेट के साथ रेडियो ट्रेसर जोड़ें और डिवाइस को अपनी प्रारंभिक स्थिति में वापस करें।
डिवाइस के ढक्कन को बंद करें और तुरंत प्रयोग फिर से शुरू करें। प्रयोग को समाप्त करने से पहले 20 मिनट तक चलने दें। प्रक्रिया और कोशिकाओं में स्नैप तेज का मूल्यांकन करने के लिए डेटा का विश्लेषण ।
अब इस प्रक्रिया को डीएमएसओ-इलाज कंट्रोल सेल कल्चर डिश और वाइल्ड टाइप सेल लाइन के लिए दोहराया जा सकता है । वास्तविक समय गतिज परख गैर पीजीपी जंगली प्रकार की कोशिकाओं को व्यक्त करने के साथ प्रदर्शन किया गया, पीजीपी व्यक्त कोशिकाओं को पूर्व एक पीजीपी अवरोधक के रूप में verapamil के साथ अवरुद्ध, और अनब्लॉक पीजीपी कोशिकाओं । गैर-उपचारित कोशिकाओं और वाहन-उपचारित कोशिकाओं के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं देखा गया था।
कार्बन-11 स्नैप तेजी से जंगली प्रकार की कोशिकाओं में संचित जबकि पीजीपी-एक्सप्रेसिंग कोशिकाओं में कोई संचय नहीं देखा गया । वेरापामिल के साथ पीजीपी एफ्लक्स ट्रांसपोर्टर को पूर्व-अवरुद्ध करने के परिणामस्वरूप पीजीपी कोशिकाओं में जंगली प्रकार की कोशिकाओं के बराबर स्नैप संचय हुआ। वास्तविक समय गतिज माप के साथ संयोजन में यह सेट-अप कम आणविक वजन यौगिकों के फार्माकोकिनेटिक्स की व्यापक समझ को सक्षम बनाता है और इसलिए रेडियोफार्मास्युटिकल्स के पूर्व-नैदानिक विकास के लिए अत्यधिक महत्वपूर्ण है।
समय और संगठन एक सफल कार्बन-11 रेडियोसिंथेसिस के लिए मुख्य तत्व हैं, बाद में वास्तविक समय गतिज प्रयोगों के साथ कार्बन-11 का आधा जीवन केवल 20 मिनट है। कार्बन के एक छोटे से आधे जीवन के कारण-11 इस प्रक्रिया के कई भागों को एक साथ किया जाता है। इसमें शामिल हर किसी के लिए यह महत्वपूर्ण है कि वे अपनी भूमिका के दायरे और समय को समझें ।
उत्पाद सुरक्षा और विकिरण संरक्षण दोनों रेडियोफार्मास्युटिकल्स की तैयारी के लिए महत्वपूर्ण हैं। ऑपरेटर के विकिरण जोखिम को सीमित करने के लिए सभी प्रयोगों को यथोचित रूप से प्राप्त करने योग्य या ALARA सिद्धांत के रूप में कम का पालन करना चाहिए।
यहाँ, हम की पूरी तरह से स्वचालित रेडियो लेबलिंग के लिए एक प्रोटोकॉल का प्रतिनिधित्व करते हैं [11C]SNAP-7941 और पी-जी पी पर इस पीईटी-ट्रेसर की वास्तविक समय गतिजता का विश्लेषण व्यक्त करने और गैर-एक्सप्रैक्टेड कोशिकाओं.
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