탄소-11 방사성 라벨링은 분자를 변경하지 않고 양전자 방출 단층 촬영 또는 PET에 작은 화합물을 사용할 수 있습니다. 이것은 수용체 발현 수준을 조사하기 위해 필수적입니다. 탄소-11 방사성 라벨링의 장점은 PET를 사용하여 멜라닌 농축 호르몬 수용체를 향해 SNAP의 결합 운동학을 실시간으로 평가할 수 있다는 것입니다.
멜라닌 농축 호르몬 수용체 길항제로서 SNAP는 이 수용체의 더 나은 이해와 비만과 당뇨병과 같은 대사 조건과의 연관성에 기여할 것입니다. 혈액-뇌 장벽에서 발현된 Efflux 수송기는 중앙 수용체 발현 이미징을 위한 방사성 의약품의 사용을 크게 방해할 수 있습니다. 따라서 시험관 내에서 추적을 평가하는 것이 중요합니다.
SNAP의 자동화된 방사선 합성은 쉽게 평가할 수 있는 메틸 군을 가진 방사성 표지저저분자화합물에 광범위하게 적용됩니다. 일단 이 절차는 그밖 화합물에 적응될 수 있습니다 설치되면. 시연을 돕는 것은 수석 박사 과정 학생 사라 Pfaff와 테레사 발버가 될 것입니다.
탄소-11 SNAP 합성을 시작하려면 적절한 시약 및 재료로 깨끗한 탄소-11 자동 합성 모듈을 설치합니다. 시스템 검사 및 컨디셔닝으로 시작하는 모듈 컴퓨터에서 SNAP 합성 프로세스를 시작합니다. 모듈이 C-11 전달을 준비하기 약 30~40분 전에 사이클로트론에서 C-11 이산화탄소 표적을 선택하고 65마이크로앰퍼에서 빔을 시작합니다.
모듈이 배달준비가 되면 내부 창과 외부 도어를 닫습니다. CO2 트랩이 섭씨 40도 이상으로 냉각되었으며 메탄 트랩이 냉각되기 시작했는지 확인합니다. 사이클로트론은 C-11 CO2의 약 120기가벡렐을 생산하면 모듈 소프트웨어에서 확인을 클릭하여 CO2 트랩을 통해 대상으로부터 경로를 엽니다.
사이클로트론 컴퓨터에서 모듈에 C-11 CO2를 제공하기 시작합니다. 모듈 컴퓨터에서 활동 전송을 모니터링하고 3분 후에 CO2를 메탄으로 감소시키는 지 확인합니다. 생성된 메탄이 메탄 트랩으로 플러시되고 요오드 오븐을 통해 순환하여 메틸 요오드로 변환될 때 공정을 모니터링한다.
전환 시퀀스의 끝에서 byproducts가 메틸 요오드 트랩에서 배기로 플러시되는 것으로 기다린 다음 원자로가 OK를 클릭하여 활동을 받을 준비가 되어 있는지 확인합니다. 메틸 요오드가 트랩에서 방출되고 메틸 트리플랫 오븐을 통해 플러시되어 반응기에 갇히면서 시스템을 모니터링합니다. 반응기 고원의 활성이 포획이 완료된 것을 확인합니다. 반응 혼합물이 섭씨 75도에서 3분 동안 반응하는 동안 기다립니다.
그런 다음 반응 혼합물이 섭씨 35도 이하로 냉각되고 1.5 밀리리터의 물로 담금질될 때 시스템을 모니터링합니다. 반응 혼합물이 HPLC 주입 루프에 로드되고 반 준비 HPLC 컬럼에 주입될 때 시스템을 모니터링한다. 크로마토그래피가 진행됨에 따라 UV 및 감마 검출기 추적을 시청하십시오.
제품 피크가 수동으로 나타나기 시작하면 모듈의 원형 바닥 컬렉션 플라스크에서 제품을 수집하기 시작합니다. 감마 신호가 초당 약 400 카운트 이하로 떨어지면 수동으로 수집을 종료합니다. 제품이 헬륨 압력하에서 고체 위상 추출 카트리지에 로드될 때 원형 하단 플라스크의 유체 레벨을 시청하십시오.
플라스크가 비어 있고 액체가 SPE 카트리지를 통과하면 확인을 클릭하여 카트리지에 갇힌 제품을 세척하기 시작합니다. 그런 다음 제품이 카트리지에서 유리병으로 먼저 출화한 다음 0.9% 식염수 용액으로 희석됨에 따라 제품 수집 유리병의 활동을 모니터링합니다. 제품 용액이 헬륨 압력하에서 멸균 필터를 통해 제품 바이알로 전송되는 것을 지켜보십시오.
전송이 완료되면 제품 출력 밸브를 닫습니다. 방사성 추적자가 제품 유리병에 도착하면 절대 방사성 수율을 측정합니다. 그런 다음 납 차폐 주사기를 사용하여 트레이서의 100 마이크로리터를 작은 유리병으로 전송하여 품질 관리를 합니다.
품질 관리 샘플을 차폐 된 품질 관리 작업 영역으로 가져옵니다. QC 샘플의 40 마이크로리터를 가스가 단단한 주사기에 넣고 분석 컬럼이 장착된 준비된 HPLC 기기에 적재하고 제품을 주입합니다. HPLC 실행 중에 다른 품질 관리 측정을 수행합니다.
HPLC 실행이 완료되면 SNAP 무선 화학 순도가 95% 이상인지 여부를 결정하기 위해 방사능 검출기로부터 크로마토그램의 모든 피크를 통합하여 제품의 화학순도를 결정합니다. UV 제품 피크 아래 영역을 사용하여 특정 활동을 계산합니다. 제품이 사용 요건을 충족하는 것으로 확인되면 무선 트레이서를 실시간 운동 실험 실험실로 방출한다.
실험 전에 적어도 30분 전에 준비된 야생 형 또는 DPBS로 감염된 세포를 세척하고 혈청없는 성장 배지의 2 밀리리터를 추가합니다. 전염된 세포를 차단하기 위해 디메틸 설프리산화물의 racemic verapamil 염산염의 20.4 밀리머 용액의 0.98 마이크로리터를 첨가한다. 경사 평면에서 30분 동안 셀을 배양합니다.
그런 다음 실시간 분석 기기와 관련 컴퓨터를 켭니다. 제어 소프트웨어를 열고 하나의 대상을 선택합니다. 위치 수를 2초로 설정하고, 감지 시간을 3초로, 감지 지연 시간을 2초로 설정하고, 첫 번째 단계의 이름을 기준선으로 설정합니다.
세포 배양 접시를 하단에 세포극을 가진 장치의 기울어진 지지대에 삽입합니다. 세포극이 세포 배양 배지로 덮여 있는지 확인합니다. 10분 배경 측정을 시작하고 파일 이름과 경로를 설정합니다.
시간 규모를 분으로 설정하고 핵종 수집을 탄소-11로 설정합니다. 배경을 표시하도록 그래프를 구성, 대상 및 배경 빼기 대상 데이터. 무선 추적자가 배달되고 사용을 위해 승인되면 분석에 대한 작은 샘플을 가져 가라.
필요한 무선 트레이서 솔루션 볼륨을 계산하고 파이펫을 준비합니다. 악기 소프트웨어에서 실행을 일시 중지하고 접시 회전이 중지 될 때까지 기다립니다. 장치의 뚜껑을 열고 지지도를 왼쪽으로 90도 돌리고 준비된 파이펫으로 무선 추적기를 추가하고 장치를 초기 위치로 반환합니다.
장치의 뚜껑을 닫고 즉시 실험을 다시 시작합니다. 실험을 종료하기 전에 20 분 동안 실행하십시오. 데이터를 처리하고 분석하여 셀의 SNAP 섭취량을 평가합니다.
이제 시술은 DMSO 처리 된 대조군 세포 배양 접시 및 야생 형 세포주에 대해 반복 될 수 있습니다. 실시간 운동 분석술은 야생형 세포를 발현하는 비PGP, PGP 발현 세포를 PGP 억제제로서 베라파밀로 미리 차단하고, 차단되지 않은 PGP 세포를 통해 수행하였다. 비처리 된 세포와 차량 처리 세포 사이에는 유의한 차이가 관찰되지 않았습니다.
탄소-11 SNAP는 PGP 발현 세포에서 축적이 관찰되지 않은 상태에서 야생 형 세포에서 급속히 축적되었다. verapamil을 가진 PGP efflux 수송기를 사전 차단하는 것은 야생 형 세포의 것과 비교되는 PGP 세포에 있는 SNAP 축적 귀착되었습니다. 실시간 운동 측정과 함께 이 설정은 저분자 화합물의 약동학에 대한 폭넓은 이해를 가능하게 하며, 따라서 방사성 의약품의 전임상 개발에 매우 중요합니다.
타이밍과 조직은 탄소-11의 반감기가 불과 20분이기 때문에 후속 실시간 운동 실험을 통해 성공적인 탄소-11 방사성 합성의 주요 성분입니다. 탄소 -11의 짧은 반감기로 인해이 절차의 많은 부분이 동시에 수행됩니다. 관련된 모든 사람이 자신의 역할의 범위와 시기를 이해하는 것이 중요합니다.
제품 안전과 방사선 보호는 방사성 의약품의 제조를 위한 핵심입니다. 모든 실험은 작업자의 방사선 노출을 제한하기 위해 합리적으로 달성 가능한 또는 ALARA 원칙만큼 낮게 따라야 합니다.
