Karbon-11 radiolabeling gjør at små forbindelser kan brukes til positronutslipptomografi eller PET uten å endre molekylet. Dette er avgjørende for å undersøke reseptoruttrykksnivåer. Fordelen med karbon-11 radiolabeling er at vi kan bruke PET til å direkte evaluere SNAPS bindinger kinetikk mot melanin-konsentrerende hormonreseptoren i sanntid.
SNAP som en melanin-konsentrerende hormonreseptor antagonist vil bidra til en bedre forståelse av denne reseptoren og dens tilknytning til metabolske forhold som fedme og diabetes. Efflux transportører uttrykt ved blod-hjerne barrieren kan betydelig hemme bruken av radiofarmaka for sentrale reseptor uttrykk imaging. Derfor er det viktig å evaluere spor in vitro.
Den automatiserte radiosyntesen til SNAP gjelder bredt for radiomerkede lavmolekylære forbindelser med en lett tilgjengelig metylgruppe. Når etablert denne prosedyren kan tilpasses for andre forbindelser. Bistå i demonstrasjonen vil være senior ph.d.-studenter Sarah Pfaff og Theresa Balber.
For å starte karbon-11 SNAP syntese sette opp en ren karbon-11 automatisert syntese modul med de riktige reagenser og materialer. Start SNAP-synteseprosessen på moduldatamaskinen som begynner med systemkontroller og kondisjonering. Omtrent 30 til 40 minutter før modulen vil være klar for C-11 levering, velg C-11 karbondioksid målet på syklotronen og start strålen på 65 mikroampere.
Når modulen er klar for levering lukke det indre vinduet og ytre døren. Bekreft at CO2-fellen har avkjølt til minst 40 grader Celsius og at metanfellen har begynt å kjøle seg ned. Når syklotronen har produsert ca 120 gigabecquerels av C-11 CO2 klikk OK i modulprogramvaren for å åpne banen fra målet gjennom CO2-fellen.
På syklotron datamaskinen begynne å levere C-11 CO2 til modulen. Overvåk aktivitetsoverføringen på moduldatamaskinen og sørg for at den går videre til reduksjon av CO2 til metan etter tre minutter. Overvåk prosessen etter hvert som det resulterende metan skylles til metanfellen og omdannes til metyljodid ved sirkulasjon gjennom jodovnen.
På slutten av konverteringssekvensen venter du når biprodukter skylles fra metyljodidfellen til eksos, og bekreft deretter at reaktoren er klar til å motta aktivitet ved å klikke OK. Overvåk systemet når metyljodiden slippes ut fra fellen, skylles gjennom metyltriflateovnen og fanges i reaktoren. Når aktiviteten i reaktorplatåene bekrefter at fangsten er fullført. Vent mens reaksjonsblandingen reagerer på 75 grader Celsius i tre minutter.
Deretter overvåker systemet som reaksjonsblandingen avkjøles til under 35 grader Celsius og slukkes med 1,5 milliliter vann. Overvåk systemet når reaksjonsblandingen lastes inn i HPLC-injeksjonssløyfen og injiseres i den halvforberedende HPLC-kolonnen. Se på UV- og gammadetektorsporene etter hvert som kromatografien fortsetter.
Når produkttoppen begynner å vises manuelt, begynner du å samle produktet i den runde bunnoppsamlingskolben i modulen. Avslutt oppsamlingen manuelt når gammasignalet faller under ca. 400 tellinger per sekund. Se væskenivået i den runde bunnkolben når produktet lastes på en fast faseekstraksjonskassett under heliumtrykk.
Når kolben er tom og væsken har passert gjennom SPE-kassetten, klikker du OK for å begynne å vaske produktene som er fanget på sylinderampullen. Overvåk deretter aktiviteten i hetteglasset med innsamling av produkter, da produktet først eluted fra sylinderampullen inn i hetteglasset og deretter fortynnes med 0,9 % saltoppløsning. Se på når produktløsningen overføres til hetteglasset med produktet gjennom sterilt filter under heliumtrykk.
Når overføringen er fullført, lukker du produktutgangsventilen. Når radiotraceren kommer inn i produktet måle det absolutte radioaktive utbyttet. Bruk deretter en blyskjermet sprøyte til å overføre 100 mikroliter av tracer til et lite hetteglass for kvalitetskontroll.
Ta kvalitetskontrollprøven til et skjermet kvalitetskontrollarbeidsområde. Tegn opp 40 mikroliter av QC-prøven i en gasstett sprøyte, legg den inn i et forberedt HPLC-instrument utstyrt med en analytisk kolonne og injiser produktet. Utfør andre kvalitetskontrollmålinger under HPLC-kjøringen.
Når HPLC-løpet er ferdig, integrerer du alle topper i kromatrammet fra radioaktivitetsdetektoren for å finne ut om snap-radioens kjemiske renhet er større enn 95 % Integrer toppene i UV-kromatrammet for å fastslå produktets kjemiske renhet. Bruk området under UV-produkttoppen til å beregne den spesifikke aktiviteten. Når produktet er bekreftet for å oppfylle kravene til bruk slipp radio tracer til sanntid kinetisk eksperiment lab.
Minst 30 minutter før eksperimentet vasker den forberedte villtypen eller trans infiserte celler med DPBS og legger til to milliliter serumfri vekstmedium. For å blokkere trans infiserte celler tilsett 0,98 mikroliter av en 20,4 millimolar løsning av racemisk verapamilhydroklorid i dimetylsulfoksid. Inkuber cellene på et skråplan i 30 minutter.
Slå deretter på sanntidsanalyseinstrumentet og den tilknyttede datamaskinen. Åpne kontrollprogramvaren, og velg ett mål. Sett antall posisjoner til to, registreringstiden til tre sekunder, forsinkelsestiden for gjenkjenning til to sekunder og navnet på den første fasen til opprinnelig plan.
Sett cellekulturfatet inn i den skrånende støtten til enheten med cellestangen på undersiden. Kontroller at cellestangen er dekket av cellekulturmedium. Start en 10-minutters bakgrunnsmåling og angi filnavn og bane.
Sett tidsskalaen på minutter og nuklidsamlingen til karbon-11. Konfigurer diagrammet for å vise bakgrunns-, mål- og bakgrunnsstredde måldataene. Når radio tracer er levert og godkjent for bruk, ta en liten prøve for analysen.
Beregn det nødvendige volumet av radio tracer løsning og forberede en pipette. I instrumentprogramvaren pause løpe og vente på parabolen rotasjon å stoppe. Åpne lokket på enheten, vri støtten 90 grader til venstre, legg til radio tracer med den klargjorte pipetten og sett enheten i startposisjon.
Lukk lokket på enheten og gjenoppta eksperimentet umiddelbart. La eksperimentet kjøre i 20 minutter før du avslutter det. Behandle og analysere dataene for å evaluere SNAP-opptak i cellene.
Nå kan prosedyren gjentas for DMSO-behandlet kontrollcellekulturrett og vill type cellelinje. Kinetiske analyser i sanntid ble utført med ikke-PGP som uttrykte ville typeceller, PGP-uttrykkende celler som var forhåndsblokkert med verapamil som PGP-hemmer, og ublokkerte PGP-celler. Det ble ikke observert signifikant forskjell mellom ikke-behandlede celler og kjøretøybehandlede celler.
Carbon-11 SNAP akkumuleres raskt i ville typeceller, mens det ikke ble observert akkumulering i PGP-uttrykkende celler. Forhåndsblokkering av PGP effluxtransportøren med verapamil resulterte i SNAP-akkumulering i PGP-cellene som kan sammenlignes med ville typeceller. I kombinasjon med kinetiske målinger i sanntid gir dette oppsettet en bred forståelse av farmakokinetikken til lavmolekylære forbindelser og er derfor svært viktig for preklinisk utvikling av radiofarmaka.
Timing og organisering er hovedingrediensene for en vellykket karbon-11 radiosyntese med påfølgende sanntid kinetiske eksperimenter som halveringstiden av karbon-11 er bare 20 minutter. På grunn av en kort halveringstid av karbon-11 utføres mange deler av denne prosedyren samtidig. Det er viktig for alle involverte å forstå omfanget og tidspunktet for sin rolle.
Både produktsikkerhet og strålebeskyttelse er nøkkelen til fremstilling av radiofarmaka. Alle eksperimenter må følge det så lave som rimelig oppnåelig eller ALARA-prinsippet for å begrense operatørens strålingseksponering.