7.2K Views
•
09:50 min
•
April 28th, 2019
DOI :
April 28th, 2019
•0:04
Title
1:20
Automated Synthesis of [11C]SNAP-7941 for Preclinical Use
4:40
Quality Control (QC) of [11C]SNAP-7941
5:55
Real-Time Kinetic Assay
8:02
Results: Evaluation of [11C]SNAP-7941 Interactions Towards the Permeability Glycoprotein 1 (P-gp) Transporter
8:44
Conclusion
Transcript
Радиолабелирование углерода-11 позволяет использовать небольшие соединения для позитронно-эмиссионной томографии или ПЭТ без изменения молекулы. Это необходимо для изучения уровней экспрессии рецепторов. Преимущество радиозабелки углерода-11 заключается в том, что мы можем использовать ПЭТ для непосредственной оценки привязки SNAP кинетики к рецептору гормона концентрации меланина в режиме реального времени.
SNAP как меланин-концентрации гормона рецептора антагонист будет способствовать лучшему пониманию этого рецептора и его связь с метаболическими условиями, как ожирение и диабет. Транспортеры Efflux, выраженные при геммоумперате, могут значительно затруднить использование радиофармацевтических средств для визуализации экспрессии центральных рецепторов. Поэтому важно оценить следы in vitro.
Автоматизированный радиосинтез SNAP широко применим к радиозабеле с низким молекулярным весом соединений с легко поддаются оценке метиловой группы. После создания эта процедура может быть адаптирована для других соединений. Помощь в демонстрации будут старшие аспиранты Сара Пфафф и Тереза Балбер.
Для начала синтеза углерода-11 SNAP создала чистый модуль синтеза углерода-11 с соответствующими реагентами и материалами. Запустите процесс синтеза SNAP на модуле компьютера, который начнется с проверки системы и кондиционирования. Примерно за 30-40 минут до того, как модуль будет готов к поставке C-11, выберите цель двуокиси углерода C-11 на циклотроне и запустите луч на 65 микроамперах.
Как только модуль будет готов к доставке, закройте внутреннее окно и внешнюю дверь. Подтвердите, что ловушка CO2 остыла по крайней мере до 40 градусов по Цельсию и что метановая ловушка начала охлаждаться. После того, как циклотрон произвел около 120 гигабеккерелей C-11 CO2 нажмите OK в программном обеспечении модуля, чтобы открыть путь от цели через ловушку CO2.
На циклотроне компьютер начинает доставлять c-11 CO2 к модулю. Мониторинг передачи активности на компьютере модуля и убедитесь, что он переходит к сокращению СО2 до метана через три минуты. Мониторинг процесса, как в результате метана смывается в ловушку метана и преобразуется в йодид метила путем циркуляции через йодную печь.
В конце последовательности преобразования подождите, как побочные продукты смываются из ловушки метил йодида, чтобы исчерпать, а затем подтвердить, что реактор готов к получению деятельности, нажав OK. Мониторинг системы, как метил йодид высвобождается из ловушки, промытый через метил трифлат печь и в ловушке в реакторе. Когда активность на плато реактора подтвердит, что захват завершен. Подождите, пока реакция смеси реагирует на 75 градусов по Цельсию в течение трех минут.
Затем следите за системой, как реакция смесь охлаждается ниже 35 градусов по Цельсию и затухают с 1,5 миллилитров воды. Мониторинг системы, как реакция смесь загружается в цикл впрыска HPLC и вводится в полу-подготовительной колонке HPLC. Следите за следами УФ- и гамма-детекторов по мере продолжения хроматографии.
Когда пик продукта начинает появляться вручную начать сбор продукта в круглой нижней колбе коллекции в модуле. Вручную конец сбора, когда гамма-сигнал падает ниже около 400 рассчитывает в секунду. Следите за уровнем жидкости в круглой нижней колбе, когда продукт загружается на твердый картридж для извлечения фазы под давлением гелия.
После того, как колба пуста и жидкость прошла через картридж SPE, нажмите OK, чтобы начать мыть продукты, захваченные на картридже. Затем контролировать активность в флаконе сбора продуктов, как продукт сначала eluted из картриджа во флакон, а затем разбавленной 0,9% солевой раствор. Следите за тем, как раствор продукта передается в флакон продукта через стерильный фильтр под давлением гелия.
Когда передача будет завершена, закройте выходной клапан продукта. Когда радиотракер прибывает в продукт флакон мера абсолютной радиоактивной урожайности. Затем используйте шприц со свинцом для передачи 100 микролитров трассировщика в небольшой флакон для контроля качества.
Принесите образец контроля качества в защищенную рабочую зону контроля качества. Нарисуйте 40 микролитров образца КК в газо-плотный шприц, загрузите его в подготовленный прибор HPLC, оснащенный аналитической колонкой, и ввилите продукт. Выполняем другие измерения контроля качества во время запуска HPLC.
После того, как запуск HPLC закончил интегрировать все пики в хроматограмме от детектора радиоактивности, чтобы определить, является ли snap радиохимической чистоты больше, чем 95%Интеграция пиков в УФ хроматограммы для определения химической чистоты продукта. Используйте область под пиком УФ-продукта для расчета конкретной активности. После того, как продукт был подтвержден для удовлетворения требований к использованию релиз радио трассировщик в режиме реального времени кинетического эксперимента лаборатории.
По крайней мере за 30 минут до начала эксперимента промыть подготовленный дикий тип или трансфицированные клетки с DPBS и добавить два миллилитров сыворотки свободной среды роста. Для блокирования трансфицированных клеток добавьте 0,98 микролитров 20,4 миллимолярный раствор racemic verapamil гидрохлорид в диметилсульфоксиде. Инкубировать клетки на косой плоскости в течение 30 минут.
Затем включите инструмент анализа в режиме реального времени и связанный с ним компьютер. Откройте программное обеспечение управления и выберите одну цель. Установите количество позиций до двух, время обнаружения до трех секунд, время задержки обнаружения до двух секунд и имя первой фазы до базовой линии.
Вставьте блюдо культуры клетки в наклонную поддержку прибора с полюсом клетки на нижней стороне. Убедитесь, что клеточный полюс покрыт средой клеточной культуры. Начните 10-минутное фоновое измерение и установите имя файла и путь.
Установите шкалу времени до минут и сбор нуклида до углерода-11. Настройте график, чтобы показать фоновые, целевые и фоновые вычитаемые целевые данные. После того, как радио трассировщик был доставлен и одобрен для использования, возьмите небольшой образец для анализа.
Рассчитайте необходимый объем раствора радиотейзера и подготовьте пипетки. В программном обеспечении инструмента приостановить запуск и ждать, пока блюдо вращения, чтобы остановить. Откройте крышку устройства, поверните опору на 90 градусов влево, добавьте радиотейлер с подготовленным пипеткой и верните устройство в исходное положение.
Закройте крышку устройства и немедленно возобновите эксперимент. Пусть эксперимент продлится 20 минут, прежде чем закончить его. Обработать и проанализировать данные для оценки поглощения SNAP в клетках.
Теперь процедура может быть повторена для DMSO-обработанных клеток культуры блюдо и дикий тип клеточной линии. Кинетические анализы в режиме реального времени проводились с помощью не-PGP, выражаюющих клетки дикого типа, PGP-экспрессирующие клетки, предварительно заблокированные с верапамилем в качестве ингибитора PGP, и разблокированные клетки PGP. Существенной разницы между необработавленными клетками и клетками, обработанными транспортным средством, не наблюдалось.
Углерод-11 SNAP быстро накапливается в клетках дикого типа, в то время как в клетках, выражаюющих PGP, накопления не наблюдалось. Предварительная блокировка транспортера PGP efflux с верапамилем привела к накоплению SNAP в клетках PGP, сопоставимых с клетками дикого типа. В сочетании с кинетическими измерениями в реальном времени эта настройка позволяет получить широкое представление о фармакокинетии соединений низкой молекулярной массы и поэтому имеет большое значение для доклинического развития радиофармацевтических препаратов.
Сроки и организация являются основными ингредиентами для успешного радиосинтеза углерода-11 с последующими кинетическими экспериментами в режиме реального времени, так как период полусейна углерода-11 составляет всего 20 минут. Благодаря короткому периоду полуготовности углерода-11 многие части этой процедуры выполняются одновременно. Важно, чтобы все участники понимали масштабы и сроки своей роли.
Безопасность продукции и радиационная защита являются ключевыми для подготовки радиофармацевтических препаратов. Все эксперименты должны следовать как низко как разумно достижимый или принцип ALARA, чтобы ограничить радиационное облучение оператора.
Здесь мы представляем протокол для полностью автоматизированной радиомаркировкиNo 11C'SNAP-7941 и анализа кинетики в реальном времени этого ПЭТ-трассировщика на P-gp выражении и невыразительных клетках.
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved