Name: targeting alpha synuclein aggregates in cutaneous peripheral nerve fibers by free-floating immunofluorescence assay
Uploaded: 2019-06-25T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Targeting Alpha Synuclein Aggregates in Cutaneous Peripheral Nerve Fibers by Free-floating Immunofluorescence Assay at JoVE.com

نشكر باركنسون شفايز وABREOC (المجلس الاستشاري للبحث العلمي في كانتون إنتي أوسبيدالييرو) على دعمهما المالي لهذه الدراسة.

وقد وافقت لجنة الأخلاقيات في الكانتونات على البروتوكول، وأعطى جميع الأشخاص المسجلين موافقة خطية مستنيرة على الدراسة.
1. مجموعة خزعة الجلد
<ol><li>السماح للطبيب المؤهل بإجراء خزعة الجلد في بيئة سريرية مناسبة.</li>
	<li>اختر المنطقة لإجراء خزعة الجلد وتنظيفها بمسحة كحولية.</li>
	<li>إع...

<ol>
	<li>McArthur, J. C., Griffin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Another+Tool+for+the+neurologist's+Tollbox.">Another Tool for the neurologist's Tollbox.</a> Annals of Neurology. 57, 163-167 (2005).</li><li>Wilkinson, P. F., Millington, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Skin. , 49-50 (2009).</li><li>Weddell, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+endings+in+mammalian+skin.">Nerve endings in mammalian skin.</a> Biological reviews of the Cambridge Philosophical Society. 30, 159-195 (1954).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+gene+product+9.5-immunoreactve+nerve+fibers+and+cells+in+human+skin.">Protein gene product 9.5-immunoreactve nerve fibers and cells in human skin.</a> Cell and Tissue Research. 261 (1), 25-33 (1990).</li><li>Holland, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraepidermal+nerve+fiber+density+in+patients+with+painful+sensory+neuropathy.">Intraepidermal nerve fiber density in patients with painful sensory neuropathy.</a> Neurology. 48, 708-711 (1997).</li><li>McArthur, J. C., Stocks, E. A., Hauer, P., Cornblath, D. R., Griffin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+nerve+fiber+density:+normative+reference+range+and+diagnostic+efficiency.">Epidermal nerve fiber density: normative reference range and diagnostic efficiency.</a> Archives of Neurology. 55 (12), 1513-1520 (1998).</li><li>Lauria, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=European+Federation+of+Neurological+Societies/Peripheral+Nerve+Society+Guideline+on+the+use+of+skin+biopsy+in+the+diagnosis+of+small+fiber+neuropathy.+Report+of+a+joint+task+force+of+the+European+Federation+of+Neurological+Societies+and+the+Peripheral+Nerve+Society.">European Federation of Neurological Societies/Peripheral Nerve Society Guideline on the use of skin biopsy in the diagnosis of small fiber neuropathy. Report of a joint task force of the European Federation of Neurological Societies and the Peripheral Nerve Society.</a> European Journal of Neurology. 17, 903-912 (2010).</li><li>Provitera, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multi-center,+multinational+age-+and+gender-adjusted+normative+dataset+for+immunofluorescent+intraepidermal+nerve+fiber+density+at+the+distal+leg.">A multi-center, multinational age- and gender-adjusted normative dataset for immunofluorescent intraepidermal nerve fiber density at the distal leg.</a> European Journal of Neurology. 23, 333-338 (2016).</li><li>Wakabayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+the+peripheral+nervous+system+in+synucleinopathies,+tauopathies+and+other+neurodegenerative+proteinopathies+of+the+brain.">Involvement of the peripheral nervous system in synucleinopathies, tauopathies and other neurodegenerative proteinopathies of the brain.</a> Acta Neuropathology. 120, 1-12 (2010).</li><li>Ruffmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+alpha-synuclein+conformational+variants+from+gastro-intestinal+biopsy+tissue+as+a+potential+biomarker+for+Parkinson's+disease.">Detection of alpha-synuclein conformational variants from gastro-intestinal biopsy tissue as a potential biomarker for Parkinson's disease.</a> Neuropathology and Applied Neurobiology. 44 (7), 722-736 (2018).</li><li>Lee, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+search+for+a+peripheral+biopsy+indicator+of+alpha-synuclein+pathology+for+Parkinson+Disease.">The search for a peripheral biopsy indicator of alpha-synuclein pathology for Parkinson Disease.</a> Journal of Neuropathology &amp; Experimental Neurology. 76, 2-15 (2017).</li><li>Donadio, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+nerve+misfolded+alpha-synuclein+in+pure+autonomic+failure+and+Parkinson+disease.">Skin nerve misfolded alpha-synuclein in pure autonomic failure and Parkinson disease.</a> Annals of Neurology. 79, 306-316 (2016).</li><li>Doppler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutaneous+neuropathy+in+Parkinson's+disease:+a+window+into+brain+pathology.">Cutaneous neuropathy in Parkinson's disease: a window into brain pathology.</a> Acta Neuropathologica. 128, 99-109 (2014).</li><li>Zange, L., Noack, C., Hahn, K., Stenzel, W., Lipp, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylated+alpha-synuclein+in+skin+nerve+fibres+differentiates+Parkinson's+disease+from+multiple+system+atrophy.">Phosphorylated alpha-synuclein in skin nerve fibres differentiates Parkinson's disease from multiple system atrophy.</a> Brain. 138, 2310-2321 (2015).</li><li>Braak, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staging+of+brain+pathology+related+to+sporadic+Parkinson's+disease.">Staging of brain pathology related to sporadic Parkinson's disease.</a> Neurobiology of Aging. 24, 197-211 (2003).</li><li>Doppler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dermal+phospho-alpha-synuclein+deposits+confirm+REM+sleep+behaviour+disorder+as+prodromal+Parkinson's+disease.">Dermal phospho-alpha-synuclein deposits confirm REM sleep behaviour disorder as prodromal Parkinson's disease.</a> Acta Neuropathologica. 133 (4), 535-545 (2017).</li><li>Antelmi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+nerve+phosphorylated+&#945;-synuclein+deposits+in+idiopathic+REM+sleep+behavior+disorder.">Skin nerve phosphorylated &#945;-synuclein deposits in idiopathic REM sleep behavior disorder.</a> Neurology. 88 (22), 2128-2131 (2017).</li><li>Nolano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+fiber+pathology+parallels+disease+progression+in+Parkinson+disease:+a+longitudinal+study.">Small fiber pathology parallels disease progression in Parkinson disease: a longitudinal study.</a> Acta Neuropathologica. , (2018).</li><li>Melli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cervical+skin+denervation+associates+with+alpha-synuclein+aggregates+in+Parkinson+disease.">Cervical skin denervation associates with alpha-synuclein aggregates in Parkinson disease.</a> Annals of Clinical and Translational Neurology. 5, 1394-1407 (2018).</li><li>Kovacs, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+processing+of+disease-associated+alpha-synuclein+in+the+human+brain+suggests+prion-like+cell-to-cell+spread.">Intracellular processing of disease-associated alpha-synuclein in the human brain suggests prion-like cell-to-cell spread.</a> Neurobiology Disease. 69, 76-92 (2014).</li><li>Kovacs, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+antibody+with+high+reactivity+for+disease-associated+alpha-synuclein+reveals+extensive+brain+pathology.">An antibody with high reactivity for disease-associated alpha-synuclein reveals extensive brain pathology.</a> Acta Neuropathologica. 124, 37-50 (2012).</li></ol>

نحن نوصف فحص المناعة العائمة الحرة لخزعات الجلد لتشخيص PD: فإنه يستغل الصبغ المناعي المزدوج مع الأجسام المضادة PGP9.5، علامة باناكسونال، والمضادة 5G4، وهو الأجسام المضادة التشكل محددة التي تعترف شكل مجمعة من αSyn.
المزايا الكبيرة لخزعة الجلد لغرض التشخيص في PD وربما في اضطرابات ا?...

وقد اكتسبت خزعة الجلد أهمية كبيرة كأداة التشخيص والبحث في مجال الاضطرابات العصبية1. في الواقع، البشرة والأدمة تحتوي على ألياف عصبية حسية جسدية وفيرة (الميالينات وغير الميالينات)، نهايات العصب الحر nociceptive، مستقبلات الحسية والتعصيب اللاإرادي من الغدد العرقية، والأوعية، والغدد الدهنية والعضلات العاقد بيلروم 2.
في منتصف القرن العشرين، سمح الإعداد للكيمياء المناعية للالأجسام المضادة PGP9.5 بدليل على تعصيب واسع النطاق للبشرة جلد الثدييات3. PGP9.5 هو هيدرولاز كاربوكسيل محطة موزعة على قدم المساواة على طول محاور من كل من الجهاز العصبي المركزي والطرفية (PNS). توافر هذا الأجسام المضادة يسمح ليس فقط لتوضيح المورفولوجيا والتشريح من PNS في الجلد ولكن أيضا تنفيذ دراسة الأمراض المرتبطة به3,4. ساهمت خزعة الجلد في تحديد كيان سريري جديد: الاعتلال العصبي الألياف الصغيرة. أظهرت عدة مجموعات دولية العلاقة بين فقدان الألياف العصبية داخل الجلد وأعراض / علامات اعتلال الأعصاب الألياف الصغيرة5 عن طريق تحليل خزعة الجلد وقدمت بروتوكولات موحدة لmorphometry العصب وكذلك القيم المرجعية المعيارية لاستخدامها في الممارسة السريرية6و7و8.
في الآونة الأخيرة أظهرت كمية كبيرة من الأدلة أن الأمراض العصبية، التي تتميز تراكمات البروتين المطوية في الجهاز العصبي المركزي، هي أمراض متعددة النظام9. في الواقع, يتميز PD بتراكم αSyn في الخلايا العصبية الدوبامينية من نيجرا substantia, ولكن ثبت أن αSyn وشكله المرضي, فوسفوريلاتيد αSyn (P-αSyn), يمكن الكشف أيضا في الأنسجة الطرفية. المعدة والأمعاء الغشاء المخاطي10، الغدد اللعابية11، ألياف الجلد اللاإرادي المحيطة الغدد العرقية والعضلات الحركي12،13،14، تظهر المناعة لأشكال الإمراض من αSyn ، في وفقا لافتراض براك أن يفترض بشكل مثير للاهتمام أن علم الأمراض αSyn قد تبدأ في PNS في وقت مبكر، قبل تراكمه في الدماغ15. وعلاوة على ذلك، تم إثبات وجود p-αSyn في الأعصاب الجلدية للمرضى الذين يعانون من اضطرابات السلوك REM التي تعتبر PD prodromal16،17 وبالتالي يمكن اعتبار αSyn الجلد علم الأمراض واعدة في وقت مبكر الطرفية مؤشر الأنسجة المرضية من اعتلال الخلايا النخاعية.
وقد تم إثبات ارتباط الاعتلال العصبي الألياف الصغيرة في PD سابقا، وقد وجد أن كثافة الألياف العصبية داخل الجلد يعكس تطور المرض18،19. وبالتالي، فإن خزعة الجلد هي أداة مفيدة لدراسة التنكّر العصبي في PD ولإنشاء تشخيص الأنسجة قبل الوفاة للمرض. في الواقع، خزعة الجلد لديه ميزة كبيرة لكونه إجراء يسهل الوصول إليه او طفيفة التوغل، مما يسمح بتحليل الأنسجة العصبية المعرضة لعلم الأمراض. وأخيرا ، فإن إمكانية تكرار خزعة الجلد في سياق متابعة نفس المرضى يسمح بدراسة العلاقة الطولية مع تطور المرض.
في مختبرنا، واستغلال مزدوج المناعية تلطيخ مع PGP9.5 والأجسام المضادة أحادية النسيلة التطابق 5G4 محددة، التي تعترف أشكال محددة من المرض αSyn بما في ذلك المجاميع الصغيرة20،21، كنا قادرين على إظهار وجود المجاميع αSyn في الأعصاب الجلد مع كفاءة تشخيصية عالية واعدة19. تحليل الفلور المناعي لخزعة الجلد في أمراض التشكل تبرز كمصدر واعد للمؤشرات الحيوية من خلال الجمع بين كل من الكشف عن مجاميع البروتين وقياس التنكّر العصبي في الجسم الحي. فيما بعد، نوضح بروتوكولًا سهلًا ومتعدد الاستخدامات بشأن التعامل مع خزعة الجلد وأداء تلطيخ الفلور المناعي العائم الحر للكشف عن مجاميع αSyn. وعلاوة على ذلك، يمكن تكييف هذا البروتوكول لاستهداف أي بروتين آخر من الاهتمام أعرب في PNS الجلد.
وقد تم استخدام بروتوكول الدراسة التالية لتقييم فائدة التشخيص من تحليل αSyn مجمعة في PNS من PD عن طريق خزعة الجلد19. وكانت معايير الشمول للPD: تشخيص سريري واضح وفقا لمعايير التشخيص بنك الدماغ في المملكة المتحدة، ومدة المرض على الأقل 3 سنوات، لا تاريخ الأسرة، وليس ضعف الإدراك الرئيسية أو أعراض خلل التغذية الذاتية الرئيسية في التاريخ. كانت معايير الاستبعاد أسباب معروفة للاعتلال العصبي (الهيموغلوبين الغليكات، الكرياتينين، فيتامين B12، TSH، تثبيت المناعة المصل، فيروس نقص المناعة البشرية، فيروس التهاب الكبد C، الزهري، وداء البوريلي). خضع كل موضوع لخزعات الجلد قطرها 3 مم في ثلاثة مواقع تشريحية (الرقبة على مستوى C8 الجلد، الفخذ 10 سم فوق الركبة، الساق 10 سم فوق malleolus الجانبية) على الجانب، الذي كان سريريا أكثر تضررا. بشكل عام، البروتوكول التالي هو حول التعامل مع خزعة الجلد وأداء تلطيخ الفلور المناعي العائمة الحرة والتحليل. وبالتالي فإنه يمكن تكييفها واستخدامها للكشف عن البروتينات الأخرى ذات الاهتمام في أنسجة الجلد.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:964px;" width="964">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:264px;">5G4 (anti human &#945;Syneclein 5G4)</td>
			<td style="width:161px;">Analytik Jena Roboscreen</td>
			<td style="width:344px;">847-0102004001</td>
			<td style="width:195px;">Mouse monoclonal&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">AlexaFluor 488 Goat anti Rabbit IgG&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1971418</td>
			<td>2mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">AlexaFluor 594 Goat anti Mouse IgG&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1922849</td>
			<td>2mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Disodium hydrogen phosphate solution</td>
			<td>Merk Millipore</td>
			<td>106586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ethylene Glycol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>324558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Lysine monohydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L5626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Aldrich Chemistry</td>
			<td>441244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:264px;">PGP9.5</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab15503</td>
			<td>Rabbit polyclonal</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodium Dihydrogen Phosphate Monohydrate</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>106346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodium (meta)periodate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trizma Base</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tryton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Vectashield&#160;</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td>Mounting medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

targeting alpha synuclein aggregates in cutaneous peripheral nerve fibers by free-floating immunofluorescence assay

حتى الآن ، بالنسبة لمعظم الأمراض العصبية لا يتوفر سوى تشخيص نهائي للتشريح. لمرض باركنسون (PD), التشخيص لا يزال يعتمد فقط على العلامات السريرية للمشاركة الحركية التي تظهر في وقت لاحق في مسار المرض, عندما يتم فقدان معظم الخلايا العصبية الدوبامينبالفعل. وبالتالي، هناك حاجة قوية إلى مؤشر حيوي يمكن أن تحدد المرضى في بداية المرض أو في خطر تطويره. على مدى السنوات القليلة الماضية، وقد ثبت خزعة الجلد لتكون ممتازة البحث وأداة التشخيص لأمراض الأعصاب الطرفية مثل الاعتلال العصبي الألياف الصغيرة. ومن المثير للاهتمام، وقد أظهرت الاعتلال العصبي الألياف الصغيرة وألفا synuclein (αSyn) الرواسب العصبية عن طريق خزعة الجلد في مرضى PD. في الواقع، خزعة الجلد لديه ميزة كبيرة لكونه سهل الوصول إليها، والإجراءات طفيفة التوغل وغير مؤلم الذي يسمح بتحليل الأنسجة العصبية الطرفية المعرضة لعلم الأمراض. وعلاوة على ذلك ، فإن إمكانية تكرار خزعة الجلد خلال متابعة نفس المريض تسمح بدراسة العلاقة الطولية مع تطور المرض. وضعنا بروتوكول اعدّي ّيّة يمكن الاعتماد عليه للتحقيق في وجود المجاميع αSyn في ألياف الأعصاب الجلدية لمريض PD. يتضمن هذا البروتوكول بضع خطوات تثبيت قصيرة، وتقسيم cryotome ومن ثم الفلور المناعي العائمة الحرة مزدوجة التلطخ مع اثنين من الأجسام المضادة محددة: مكافحة البروتين الجينات المنتج 9.5 (PGP9.5) للاحتفال الألياف العصبية الجلدية ومكافحة 5G4 للكشف عن αSyn المجاميع. وهو متعدد الاستخدامات وحساس وسهل الأداء البروتوكول الذي يمكن تطبيقه أيضا لاستهداف البروتينات الأخرى ذات الاهتمام في أعصاب الجلد. القدرة على وضع علامة على المجاميع αSyn خطوة أخرى إلى الأمام إلى استخدام خزعة الجلد كأداة لإنشاء تشخيص الأنسجة قبل الوفاة من PD.

بعد الإجراء الموصوف(الشكل1)، اكتشفنا المجاميع αSyn، وصفت مع الأجسام المضادة 5G4، في اللفافات العصبية الجلدية تشعب الهياكل اللاإرادية من المرضى PD. يظهر مورفولوجيا رواسب ألفا-سينوكلين كإشارة منقط على طول محاور الأعصابالجلدية (الشكل 2). في الواقع، استغلال هذا ال...

Watch this Scientific Journal Video about Targeting Alpha Synuclein Aggregates in Cutaneous Peripheral Nerve Fibers by Free-floating Immunofluorescence Assay at JoVE.com

Targeting Alpha Synuclein Aggregates in Cutaneous Peripheral Nerve Fibers by Free-floating Immunofluorescence Assay

هنا، نقدم بروتوكولاً لفحص الفلور المناعي غير المباشر العائم الحر على أقسام خزعة الجلد التي تسمح بتحديد المتغيرات المطابقة الخاصة بالأمراض من ألفا سينوكلين المشاركة في مرض باركنسون والبروتينات المتعددة لل الجهاز العصبي المحيطي.

استهداف المجاميع ألفا سينوكلين في ألياف الأعصاب الطرفية الجلدية عن طريق اختبار المناعة العائمة الحرة

To date, for most neurodegenerative diseases only a post-mortem histopathological definitive diagnosis is available. For Parkinson&#39;s disease (PD), the ...

تشخيص مرض باركنسون لا يزال يعتمد على العلامات السريرية للمشاركة الحركية التي تظهر في وقت لاحق في سياق المرض، عندما يتم فقدان معظم الخلايا العصبية من النيجرا substantia بالفعل. يسمح هذا البروتوكول بتحليل الأعصاب الجلدية عن طريق خزعة الجلد ، التي تمثل علامة حيوية جديدة محتملة للمرض ، لاستخدامها في التجارب السريرية. خزعة الجلد هو إجراء يمكن تقييمه بسهولة ، وليس الغازية التي تسمح لتحليل الأنسجة العصبية الطرفية التي هي عرضة لعلم الأمراض.ألفا synuclein المجاميع الكشف عن طريق خزعة الجلد يمكن استخدامها لأغراض التشخيص، وربما في المراحل المبكرة، عندما يكون العلاج المحتمل الأكثر فعالية. متابعة خزعات الجلد في نفس المريض تسمح الوقت وتحليل دورة خاصة من ألفا synuclein المجموع انتشار في الجهاز العصبي الجلدي البشري. ويمكن لهذه أن تلقي الضوء على التسبب في المرض.لبدء هذا الإجراء، قم بإعداد حل تثبيت PLP جديد كما هو موضح في جدول واحد من بروتوكول النص. مباشرة بعد جمع خزعة الجلد، غمره في أنبوب يحتوي على 10 ملليلتر من الحل المثبت. احتضان بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية.في اليوم التالي، في غطاء الدخان، وإزالة تثبيت PLP بلطف. في نفس الأنبوب، اغسل الخزعة ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل من هذه الدقائق، باستخدام خمسة ملليلترات من محلول سورنسن الزنجي 0.1 لكل غسل. تجاهل حل سورنسن، وإضافة خمسة ملليلترات من محلول الحماية المبردة.احتضان بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية. في اليوم التالي، تخزين خزعة في أربع درجات مئوية إذا كان خفض مع cryotome هو أن يتم تنفيذها في غضون أسبوع واحد. أولاً، تعيين cryotome إلى ناقص 20 درجة مئوية.خذ cry وملء مع وسيلة تضمين التبريد. باستخدام الملاقط، غمر الخزعة في الوسط المضمّن للتبريد، مع المحور الطولي الموازي لقاع الـ cryomold. اابكي تجميد العينة مع النيتروجين السائل، للحصول على مكعب صلب من المبرد-تضمين المتوسطة التي تحتوي على خزعة في الاتجاه الصحيح.ضع العينة في الكواد، وانتظر لمدة 30 دقيقة للسماح للخزعة بالتأقلم. ثم، إصلاح العينة على التبريد ومقطعة إلى أقسام 50 ميكرومتر. باستخدام فرشاة صغيرة، نقل المقاطع المبردة إلى لوحة 96-well تحتوي على 200 ميكرولترات من محلول التجمد في كل بئر.بعد هذا، تخزين لوحة في ناقص 20 درجة مئوية. للبدء، وملء بعض الآبار من لوحة 96-well الطازجة مع 100 ميكرولترات من محلول الغسيل. نقل الأقسام لتحليلها من لوحة التخزين إلى الجزء الذي يحتوي على محلول الغسيل.اترك الأجزاء في محلول الغسيل لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم، نقل كل قسم إلى بئر فارغة تحتوي على نفس محلول الغسيل، وكرر الغسيل. بعد ذلك، إضافة محلول الغسيل إلى الأقسام، ونقلها إلى آبار جديدة تحتوي على 100 ميكرولترات من محلول الحجب.احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 90 دقيقة على الأقل، والحد الأقصى من أربع ساعات. تمييع الأجسام المضادة الأولية، المضادة PGP9.5 ومكافحة 5G4، في حل العمل. نقل المقاطع إلى آبار جديدة تحتوي على 100 ميكرولترات من حل العمل للأجسام المضادة الأولية، واحتضان بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.في اليوم التالي، قم بغسل الأجزاء في الآبار التي تحتوي على محلول الغسيل كما سبق وصفه. تمييع الأجسام المضادة الثانوية، الماعز المضادة الأرنب للكشف عن PGP9.5، والماعز المضادة للماوس للكشف عن 5G4، في حل العمل. نقل الأجزاء المغسولة إلى آبار جديدة تحتوي على 100 ميكرولترات من حل العمل للأجسام المضادة الثانوية.غطي الطبق برقائق الألومنيوم لتجنب تبييض الفلوروفور المقترن بالأجسام المضادة الثانوية، ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 90 دقيقة. بعد ذلك، غسل الأقسام مرتين في محلول الغسيل كما هو موضح سابقا. نقل الأجزاء المغسولة إلى آبار جديدة تحتوي على 100 ميكرولترات من DAPI لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.اغسل الأقسام مرتين في محلول الغسيل كما هو موضح مسبقًا. ثم قم بتحميل المقاطع على شريحة في الموضع الصحيح، وتجنب misfolding. إضافة بضع قطرات من متوسطة التركيب إلى الشريحة وتغطية القسم مع زلة غطاء.دع الشرائح تجف بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، قم بتخزين الشرائح في مربع مناسب عند أربع درجات مئوية، مع التأكد من تجنب التعرض للضوء. باستخدام مجهر الفلورانس المقلوب أو مجهر confocal، عرض المقاطع.الحصول على الصور بواسطة كاميرا متصلة المجهر. ثم استخدم مجهر الفلوريسنس أو مجهراً مُتطابقاً لتحليل الإشارات الإيجابية في الأقسام من حيث التوزيع المكاني وشدة الإشارة كما هو موضح في بروتوكول النص. بعد الطريقة الموصوفة، يتم الكشف عن مجاميع ألفا synuclein المسمى مع الأجسام المضادة 5G4 في ملزمات العصب الجلدي الهياكل الذاتية من المرضى PD.مورفولوجيا رواسب ألفا سينوكلين يظهر كإشارة منقط على طول محاور الأعصاب الجلدية. الاستخدام التمثيلي لهذا البروتوكول في 19 PD المرضى و 17 ضوابط في خزعات الجلد في ثلاثة مواقع التشريحية يبين أن 5G4 لديه حساسية من 81٪ وخصوصية 86٪ بالمقارنة مع الضوابط الصحية. الفوسفور ألفا synuclein لديه حساسية من 56٪، وخصوصية 100٪ 5G4 وتوجد الودائع ألفا سينوكلين الإيجابية الفوسفورية أساسا حول الغدد العرقية, ولكن توجد أيضا في العضلات arrector بيلي, السفن الصغيرة, والزفير الجلدي ودون رقبة, ولكن أبدا في الألياف العصبية داخل المدى.عموما، داخل الغدد العرقية تجويف، فمن الممكن لمراقبة إشارة غير محددة التي يمكن أن يساء تفسيرها كما 5G4 أو فوسفورية ألفا سينوكلين الإيجابية. هذا النوع من الإشارة منقط، كروية، ويرجع ذلك على الأرجح إلى المواد الفلورية الذاتية داخل الأرصاد كما هو موضح في الضوابط التقنية دون الأجسام المضادة الأولية والثانوية. التكلس مع PGP9.5 الذي يصادف الألياف العصبية، والتي هي شكلية خيوط وممدود، يساعد على تحديد الإشارة الصحيحة.لذلك، يتم زيادة خصوصية إشارة 5G4 بشكل كبير من خلال مضاعفة المناعة مع علامة محور عصبي. تثبيت دقيقة من الخزعة ضروري لإنتاج تلطيخ مناعي ذات نوعية جيدة وللتفسير الموثوق به من الإشارات الفلورية. إذا لم يتم إعداد المثبت بشكل صحيح، أو إذا حدث الإفراط في التثبيت، ستكون النتيجة ذاتية الفلوروس عالية من شأنها أن تخفي إشارة الألياف العصبية عبور تقاطع الجلد الجلدي، أو innervate الهياكل الجلدية الرئيسية.الخطوة الأكثر أهمية من هذا الإجراء هو تثبيت الأنسجة. انتبه إلى pH من حل PLP المثبت، وتوقيت الحضانة، لتجنب الفلوروس وإشارة محددة.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Oral Administration of Rotenone using a Gavage and Image Analysis of Alpha-synuclein Inclusions in the Enteric Nervous System

الشفوي إدارة روتنون باستخدام بالتزقيم وتحليل صورة الفا synuclein الادراج في الجهاز العصبي المعوي

In Parkinson's disease (PD) patients, the associated pathology follows a characteristic pattern involving inter alia the enteric nervous system (ENS) 1,2, ...

Selective Tracing of Auditory Fibers in the Avian Embryonic Vestibulocochlear Nerve

انتقائية للبحث عن المفقودين من ألياف العصب السمعي في الطيور الدهليزي القوقعي الجنينية

The embryonic chick is a widely used model for the study of peripheral and central ganglion cell projections. In the auditory system, selective labeling ...

Transplantation of Olfactory Ensheathing Cells to Evaluate Functional Recovery after Peripheral Nerve Injury

زرع الخلايا الشمية مغمد لتقييم الانتعاش وظيفية بعد إصابة العصب المحيطي

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory ...

Sequential Extraction of Soluble and Insoluble Alpha-Synuclein from Parkinsonian Brains

استخراج متتابعة من القابلة للذوبان وغير القابلة للذوبان ألفا Synuclein من أدمغة الشلل الارتعاشي

Alpha-synuclein (&#945;-syn) protein is abundantly expressed mainly within neurons, and exists in a number of different forms - monomers, tetramers, ...

Bioluminescence Imaging of Neuroinflammation in Transgenic Mice After Peripheral Inoculation of Alpha-Synuclein Fibrils

التصوير تلألؤ بيولوجي من Neuroinflammation في الفئران المعدلة وراثيا بعد الطرفية تلقيح ألفا Synuclein الألياف

To study the prion-like behavior of misfolded alpha-synuclein, mouse models are needed that allow fast and simple transmission of alpha-synuclein ...

Identification of Dopamine D1-Alpha Receptor Within Rodent Nucleus Accumbens by an Innovative RNA In Situ Detection Technology

Identification of Dopamine D1-Alpha Receptor Within Rodent Nucleus Accumbens by an Innovative RNA In Situ Detection Technology

تحديد مستقبلات الدوبامين D1-ألفا داخل Accumbens نواة القوارض بالحمض النووي الريبي مبتكرة في الموقع تكنولوجيا الكشف عن

In the central nervous system, the D1-alpha subtype receptor (Drd1&#945;) is the most abundant dopamine (DA) receptor, which plays a vital role in ...

Exogenous Administration of Microsomes-associated Alpha-synuclein Aggregates to Primary Neurons As a Powerful Cell Model of Fibrils Formation

إدارة خارجية من المجاميع المرتبطة ميكروسوميس ألفا-سينوكلين إلى الخلايا العصبية الأولية كنموذج خلية قوية لتشكيل ييفات

For years, the inability of replicating formation of insoluble alpha-synuclein (&#945;S) inclusions in cell cultures has been a great limitation in the ...

Generation of Alpha-Synuclein Preformed Fibrils from Monomers and Use In Vivo

جيل من الورم الليفي الفا Synuclein المكونة مسبقا من مونومرات واستخدامها في فيفو

Use of the in vivo alpha-synuclein preformed fibril (&#945;-syn PFF) model of synucleinopathy is gaining popularity among researchers aiming to model ...

Short-Term Free-Floating Slice Cultures from the Adult Human Brain

قصيرة الأجل الحرة العائمة شريحة الثقافات من الدماغ البشري الكبار

Organotypic, or slice cultures, have been widely employed to model aspects of the central nervous system functioning in vitro. Despite the potential of ...

Assessing Early Stage Open-Angle Glaucoma in Patients by Isolated-Check Visual Evoked Potential

تقييم المرحلة المبكرة من الزرق المفتوح الزاوية في المرضى عن طريق التحقق من إمكانات استحضار البصرية

Recently, the isolated-check visual evoked potential (icVEP) technique was designed and has been reported to detect glaucomatous damage earlier and ...