Name: targeting alpha synuclein aggregates in cutaneous peripheral nerve fibers by free-floating immunofluorescence assay
Uploaded: 2019-06-25T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Targeting Alpha Synuclein Aggregates in Cutaneous Peripheral Nerve Fibers by Free-floating Immunofluorescence Assay at JoVE.com

Vi takker Parkinson Schweiz og ABREOC (den videnskabelige Forsknings rådgivende bestyrelse for Ente Ospedaliero Cantonale) for deres økonomiske støtte til denne undersøgelse.

Protokollen er blevet godkendt af den kantonale etiske komité, og alle tilmeldte forsøgspersoner gav skriftligt informeret samtykke til undersøgelsen.
1. Skin biopsi Collection
<ol><li>Lad en kvalificeret læge udføre hudbiopsien i en passende klinisk indstilling.</li>
	<li>Vælg området for at udføre huden biopsi og rense det med en spritserviet.</li>
	<li>Forbered anæstesi opløsningen med 1 CC lidocain 2%.</li>
	<li>Med nålen parallelt med området, injicere lokale anæstesi subku...

<ol>
	<li>McArthur, J. C., Griffin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Another+Tool+for+the+neurologist's+Tollbox.">Another Tool for the neurologist's Tollbox.</a> Annals of Neurology. 57, 163-167 (2005).</li><li>Wilkinson, P. F., Millington, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Skin. , 49-50 (2009).</li><li>Weddell, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+endings+in+mammalian+skin.">Nerve endings in mammalian skin.</a> Biological reviews of the Cambridge Philosophical Society. 30, 159-195 (1954).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+gene+product+9.5-immunoreactve+nerve+fibers+and+cells+in+human+skin.">Protein gene product 9.5-immunoreactve nerve fibers and cells in human skin.</a> Cell and Tissue Research. 261 (1), 25-33 (1990).</li><li>Holland, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraepidermal+nerve+fiber+density+in+patients+with+painful+sensory+neuropathy.">Intraepidermal nerve fiber density in patients with painful sensory neuropathy.</a> Neurology. 48, 708-711 (1997).</li><li>McArthur, J. C., Stocks, E. A., Hauer, P., Cornblath, D. R., Griffin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+nerve+fiber+density:+normative+reference+range+and+diagnostic+efficiency.">Epidermal nerve fiber density: normative reference range and diagnostic efficiency.</a> Archives of Neurology. 55 (12), 1513-1520 (1998).</li><li>Lauria, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=European+Federation+of+Neurological+Societies/Peripheral+Nerve+Society+Guideline+on+the+use+of+skin+biopsy+in+the+diagnosis+of+small+fiber+neuropathy.+Report+of+a+joint+task+force+of+the+European+Federation+of+Neurological+Societies+and+the+Peripheral+Nerve+Society.">European Federation of Neurological Societies/Peripheral Nerve Society Guideline on the use of skin biopsy in the diagnosis of small fiber neuropathy. Report of a joint task force of the European Federation of Neurological Societies and the Peripheral Nerve Society.</a> European Journal of Neurology. 17, 903-912 (2010).</li><li>Provitera, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multi-center,+multinational+age-+and+gender-adjusted+normative+dataset+for+immunofluorescent+intraepidermal+nerve+fiber+density+at+the+distal+leg.">A multi-center, multinational age- and gender-adjusted normative dataset for immunofluorescent intraepidermal nerve fiber density at the distal leg.</a> European Journal of Neurology. 23, 333-338 (2016).</li><li>Wakabayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+the+peripheral+nervous+system+in+synucleinopathies,+tauopathies+and+other+neurodegenerative+proteinopathies+of+the+brain.">Involvement of the peripheral nervous system in synucleinopathies, tauopathies and other neurodegenerative proteinopathies of the brain.</a> Acta Neuropathology. 120, 1-12 (2010).</li><li>Ruffmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+alpha-synuclein+conformational+variants+from+gastro-intestinal+biopsy+tissue+as+a+potential+biomarker+for+Parkinson's+disease.">Detection of alpha-synuclein conformational variants from gastro-intestinal biopsy tissue as a potential biomarker for Parkinson's disease.</a> Neuropathology and Applied Neurobiology. 44 (7), 722-736 (2018).</li><li>Lee, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+search+for+a+peripheral+biopsy+indicator+of+alpha-synuclein+pathology+for+Parkinson+Disease.">The search for a peripheral biopsy indicator of alpha-synuclein pathology for Parkinson Disease.</a> Journal of Neuropathology &amp; Experimental Neurology. 76, 2-15 (2017).</li><li>Donadio, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+nerve+misfolded+alpha-synuclein+in+pure+autonomic+failure+and+Parkinson+disease.">Skin nerve misfolded alpha-synuclein in pure autonomic failure and Parkinson disease.</a> Annals of Neurology. 79, 306-316 (2016).</li><li>Doppler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutaneous+neuropathy+in+Parkinson's+disease:+a+window+into+brain+pathology.">Cutaneous neuropathy in Parkinson's disease: a window into brain pathology.</a> Acta Neuropathologica. 128, 99-109 (2014).</li><li>Zange, L., Noack, C., Hahn, K., Stenzel, W., Lipp, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylated+alpha-synuclein+in+skin+nerve+fibres+differentiates+Parkinson's+disease+from+multiple+system+atrophy.">Phosphorylated alpha-synuclein in skin nerve fibres differentiates Parkinson's disease from multiple system atrophy.</a> Brain. 138, 2310-2321 (2015).</li><li>Braak, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staging+of+brain+pathology+related+to+sporadic+Parkinson's+disease.">Staging of brain pathology related to sporadic Parkinson's disease.</a> Neurobiology of Aging. 24, 197-211 (2003).</li><li>Doppler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dermal+phospho-alpha-synuclein+deposits+confirm+REM+sleep+behaviour+disorder+as+prodromal+Parkinson's+disease.">Dermal phospho-alpha-synuclein deposits confirm REM sleep behaviour disorder as prodromal Parkinson's disease.</a> Acta Neuropathologica. 133 (4), 535-545 (2017).</li><li>Antelmi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+nerve+phosphorylated+&#945;-synuclein+deposits+in+idiopathic+REM+sleep+behavior+disorder.">Skin nerve phosphorylated &#945;-synuclein deposits in idiopathic REM sleep behavior disorder.</a> Neurology. 88 (22), 2128-2131 (2017).</li><li>Nolano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+fiber+pathology+parallels+disease+progression+in+Parkinson+disease:+a+longitudinal+study.">Small fiber pathology parallels disease progression in Parkinson disease: a longitudinal study.</a> Acta Neuropathologica. , (2018).</li><li>Melli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cervical+skin+denervation+associates+with+alpha-synuclein+aggregates+in+Parkinson+disease.">Cervical skin denervation associates with alpha-synuclein aggregates in Parkinson disease.</a> Annals of Clinical and Translational Neurology. 5, 1394-1407 (2018).</li><li>Kovacs, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+processing+of+disease-associated+alpha-synuclein+in+the+human+brain+suggests+prion-like+cell-to-cell+spread.">Intracellular processing of disease-associated alpha-synuclein in the human brain suggests prion-like cell-to-cell spread.</a> Neurobiology Disease. 69, 76-92 (2014).</li><li>Kovacs, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+antibody+with+high+reactivity+for+disease-associated+alpha-synuclein+reveals+extensive+brain+pathology.">An antibody with high reactivity for disease-associated alpha-synuclein reveals extensive brain pathology.</a> Acta Neuropathologica. 124, 37-50 (2012).</li></ol>

Vi beskriver en fritflydende immunofluorescens analyse for hud biopsier til diagnosticering af PD: det udnytter dobbelt immun farvning med anti-PGP 9.5 antistof, en panaxonal markør, og anti-5G4, en konformation specifikke antistof, der genkender den aggregerede form af αSyn.
De store fordele ved hud biopsi til diagnostisk formål i PD og eventuelt i andre protein konformationelle lidelser er: 1) direkte adgang til nerve væv tilbøjelige til sygdom ved en mildt invasiv teknik og dermed med ...

Skin biopsi har fået en stor betydning som diagnostisk og forskning værktøj inden for neurologiske lidelser1. Faktisk, epidermis og dermis indeholder rigelige somatiske sensoriske nervefibre (myelinerede og umyelineret), nociceptive frie nerveender, sensoriske receptorer og autonom innervation af svedkirtler, kar, talgkirtler og muskel arrector pilorum 2. i.
I midten af 20th århundrede, opsætningen for Immunhistokemi af PGP 9.5 antistof tilladt bevis for en omfattende innervation af humant epidermis pattedyr hud3. PGP 9.5 er en carboxyl-Terminal lav affinitet ligeligt fordelt langs axoner af både det centrale og perifere nervesystem (PNS). Tilgængeligheden af dette antistof tilladt ikke kun at afklare morfologi og anatomi af PNS i huden, men også implementeret studiet af sygdomme forbundet med det3,4. Hudbiopsi bidrog til at definere en ny klinisk enhed: den lille fiber neuropati. Flere internationale grupper viste sammenhæng mellem tabet af intraepidermal nervefibre og symptomer/tegn på lille fiber neuropati5 ved Skin biopsi analyse og forudsat standardiserede protokoller for nerve morphometri samt normative referenceværdier, der skal anvendes i den kliniske praksis6,7,8.
For nylig en stor mængde af beviser har vist, at neurodegenerative sygdomme, karakteriseret ved misfoldet protein akkumuleringer i det centrale nervesystem, er multi-system patologier9. Faktisk, PD er karakteriseret ved αsyn akkumulering i dopaminerge neuron af substantia nigra, men det er blevet påvist, at αsyn og dets patologiske form, fosforyleres αsyn (P-αsyn), kunne påvises også i det perifere væv. Gastrointestinalt slimhinde10, spytkirtler11, hudens autonome fibre omkring svedkirtler og pilomotor muskler12,13,14, viser immunoreactivity til patogene former af αsyn, i overensstemmelse med Braak-hypotesen om, at det er interessant at postulere, at αSyn patologi kan begynde i PNS i god tid før dens akkumulering i hjernen15. Desuden er tilstedeværelsen af p-αsyn blevet påvist i hudens nerver af patienter med rem-adfærdsforstyrrelser, som anses for at være prodromale PD16,17 således kan hudpatologisk αsyn betragtes som en lovende tidlig perifer histopatologisk markør for synukleinopati.
Sammenslutningen af små fiber neuropati i PD er blevet påvist tidligere, og det er blevet konstateret, at intraepidermal nervefibre tæthed afspejler sygdomsprogression18,19. Derfor er huden biopsi et nyttigt redskab til at studere neurodegeneration i PD og til at etablere en præ-mortem histopatologisk diagnose af sygdommen. Faktisk, hudbiopsi har en stor fordel ved at være en let tilgængelig og minimalt invasive procedure, så analysen af nervevævet tilbøjelig til patologi. Endelig muligheden for at gentage huden biopsi i løbet af opfølgningen af de samme patienter giver mulighed for at studere i længderetningen sammenhæng med sygdomsprogression.
I vores laboratorium, udnytter en dobbelt immuno-farvning med PGP 9.5 og konformation-specifikke monoklonale 5g4 antistof, der genkender sygdomsspecifikke former for αsyn herunder små aggregater20,21, vi var i stand til at vise tilstedeværelsen af αSyn aggregater i huden nerver med en lovende høj diagnostisk effektivitet19. Immunofluorescens analyse af hudbiopsi i konformationelle sygdomme skiller sig ud som en lovende kilde til biomarkører ved at kombinere både påvisning af protein aggregater og måling af neurodegeneration in vivo. Herefter illustrerer vi en let og alsidig protokol om håndtering af hudbiopsi og udførelse af fritflydende immunofluorescens farvning til påvisning af αSyn aggregater. Desuden kan denne protokol tilpasses til at målrette ethvert andet protein af interesse udtrykt i huden PNS.
Følgende studie protokol er blevet anvendt til at evaluere den diagnostiske nytte af aggregeret αSyn analyse i PNS af PD ved hud biopsi19. Inklusionskriterier for PD var: en klar klinisk diagnose i henhold til den britiske Brain bank diagnostiske kriterier, sygdom varighed mindst 3 år, ingen slægtshistorie, og ingen større kognitiv svækkelse eller større dysautonomiske symptomer i historien. Udelukkelseskriterier var kendte årsager til neuropati (glycated hæmoglobin, kreatinin, vitamin B12, TSH, serum immunofiksation, HIV, HCV, syfilis, og borreliose). Hvert emne gennemgik 3 mm-diameter hud biopsier på tre anatomiske steder (hals på C8 dermatomal niveau, lår 10 cm over knæet, Ben 10 cm over lateral malleolus) på siden, som var klinisk mere påvirket. Generelt er følgende protokol handler om håndtering af huden biopsi og udføre den fritflydende immunofluorescens farvning og analyse. Derfor kan det tilpasses og anvendes til påvisning af andre proteiner af interesse i hudvæv.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:964px;" width="964">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:264px;">5G4 (anti human &#945;Syneclein 5G4)</td>
			<td style="width:161px;">Analytik Jena Roboscreen</td>
			<td style="width:344px;">847-0102004001</td>
			<td style="width:195px;">Mouse monoclonal&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">AlexaFluor 488 Goat anti Rabbit IgG&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1971418</td>
			<td>2mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">AlexaFluor 594 Goat anti Mouse IgG&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1922849</td>
			<td>2mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Disodium hydrogen phosphate solution</td>
			<td>Merk Millipore</td>
			<td>106586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ethylene Glycol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>324558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Lysine monohydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L5626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Aldrich Chemistry</td>
			<td>441244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:264px;">PGP9.5</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab15503</td>
			<td>Rabbit polyclonal</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodium Dihydrogen Phosphate Monohydrate</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>106346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodium (meta)periodate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trizma Base</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tryton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Vectashield&#160;</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td>Mounting medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

targeting alpha synuclein aggregates in cutaneous peripheral nerve fibers by free-floating immunofluorescence assay

Til dato, for de fleste neurodegenerative sygdomme er kun en post mortem histopatologisk endelig diagnose tilgængelig. For Parkinsons sygdom (PD), diagnosen stadig kun afhænger af kliniske tegn på motoriske involvering, der vises senere i sygdomsforløbet, når de fleste af de dopaminerge neuroner er allerede tabt. Derfor er der et stort behov for en biomarkør, der kan identificere patienter i begyndelsen af sygdom eller med risiko for at udvikle det. I løbet af de sidste par år har hudbiopsi vist sig at være en fremragende forskning og diagnostisk værktøj til perifere nervesygdomme såsom små fiber neuropati. Interessant, en lille fiber neuropati og alpha synuclein (αSyn) neurale indskud er blevet påvist ved hudbiopsi hos PD patienter. Faktisk, hudbiopsi har den store fordel ved at være en let tilgængelig, minimalt invasiv og smertefri procedure, der gør det muligt at analysere perifere nerve væv tilbøjelige til patologi. Desuden muligheden for at gentage huden biopsi i løbet af opfølgningen af den samme patient giver mulighed for at studere i længderetningen sammenhæng med sygdomsprogression. Vi har oprettet en standardiseret pålidelig protokol til at undersøge tilstedeværelsen af αSyn aggregater i hud nervefibre af PD patienten. Denne protokol omfatter kun få korte fikserings trin, en kryotomsektionering og derefter en fritflydende immunofluorescens, dobbelt farvning med to specifikke antistoffer: anti protein Genprodukt 9,5 (PGP 9.5) til at markere kutane nervefibre og anti 5G4 til påvisning af αSyn aggregater. Det er en alsidig, følsom og nem at udføre protokol, der også kan anvendes til at målrette andre proteiner af interesse i huden nerver. Evnen til at markere αSyn aggregater er endnu et skridt frem mod anvendelse af hudbiopsi som et redskab til at etablere en præ-mortem histopatologisk diagnose af PD.

Efter den beskrevne procedure (figur 1), vi detekterede αsyn aggregater, mærket med 5G4 antistof, i dermal nerve fascicles innerverende autonome strukturer PD patienter. Morfologi af alpha-synuclein indskud vises som et punkteret signal langs axoner af dermal nerver (figur 2). Faktisk, at udnytte denne protokol i 19 PD patienter og 17 kontrol i huden biopsier på tre anatomiske sted (cervikal, lår og distale ben) fandt vi, at 5G4 havde 81% følsomhed og 86% a...

Watch this Scientific Journal Video about Targeting Alpha Synuclein Aggregates in Cutaneous Peripheral Nerve Fibers by Free-floating Immunofluorescence Assay at JoVE.com

Targeting Alpha Synuclein Aggregates in Cutaneous Peripheral Nerve Fibers by Free-floating Immunofluorescence Assay

Her præsenterer vi en protokol for en fritflydende indirekte immunofluorescens assay på hud biopsi sektioner, der giver mulighed for identifikation af sygdomsspecifikke kropsbygnings varianter af alpha synuclein involveret i Parkinsons sygdom og flere proteiner i perifert nervesystem.

Målretning Alpha Synuclein aggregater i kutane perifer nerve fibre af Free-flydende immunofluorescens analyse

To date, for most neurodegenerative diseases only a post-mortem histopathological definitive diagnosis is available. For Parkinson&#39;s disease (PD), the ...

Diagnosen af Parkinsons sygdom er stadig afhængig af kliniske tegn på motorisk involvering, der vises senere i løbet af sygdommen, når de fleste af neuronerne i substantia nigra allerede er tabt. Denne protokol gør det muligt at dermale nerver analyse af hudbiopsi, der repræsenterer en potentiel ny biomarkør for sygdommen, der skal anvendes i kliniske forsøg. Hudbiopsi er en let vurderes, ikke-invasiv procedure, der gør det muligt at analysere perifert nervevæv, der er tilbøjelig til patologi.Alpha synuclein aggregater påvisning af hudbiopsi kan anvendes til diagnostiske formål, muligvis i tidlige faser, når potentiel helbredelse er mest effektiv. Opfølgende hudbiopsier hos samme patient giver mulighed for en tids- og specialanalyse af alfasynuclein aggregat spredning i det menneskelige kutane nervesystem. Disse kan kaste lys over sygdomspatogenesen.For at starte denne procedure skal du forberede en ny PLP-fiksativ løsning som beskrevet i tabel et af tekstprotokollen. Umiddelbart efter indsamling af hudens biopsi nedsænkes det i et rør, der indeholder 10 milliliter af fiksativopløsningen. Inkuber natten over ved fire grader Celsius.Den næste dag, i en røghætte, skal du fjerne PLP fiksativt forsigtigt. I samme rør vaskes biopsien tre gange i fem minutter hver med fem milliliter 0,1 molar Sørensens opløsning til hver vask. Kassér Sørensenens opløsning, og tilsæt fem milliliter kryobeskyttende opløsning.Inkuber natten over ved fire grader Celsius. Den næste dag, gemme biopsi på fire grader Celsius, hvis snittet med en kryotomi skal udføres inden for en uge. Først skal du indstille kryotmet til minus 20 grader Celsius.Tag en kryomet og fyld den op med kryo-indlejring medium. Ved hjælp af en pincet nedsænkes biopsien i kryo-indlejringsmediet med længdeaksen parallelt med bunden af kryopladen. Snap fryse prøven med flydende nitrogen, for at opnå en solid terning af kryo-indlejring medium, der indeholder biopsi i den rigtige retning.Sæt prøven i kryostaten, og vent i 30 minutter for at lade biopsien akklimatisere. Derefter fastgør prøven på kryostaten og skæres i 50-mikrometersektioner. Ved hjælp af en lille børste, overføre kryo-sektioner til en 96-brønd plade, der indeholder 200 mikroliter af frostvæske opløsning i hver brønd.Derefter opbevares pladen ved minus 20 grader Celsius. Til at begynde, fylde nogle af brøndene i en frisk 96-brønd plade med 100 mikroliter af vask løsning. Overfør de sektioner, der skal analyseres, fra opbevaringspladen til den, der indeholder vaskeopløsningen.Lad sektionerne i vaskeopløsningen være i 10 minutter ved stuetemperatur. Derefter overføres hver sektion til en tom brønd, der indeholder den samme vaskeopløsning, og gentag vasken. Dernæst tilføje vaske løsning til sektionerne, og overføre dem til nye brønde, der indeholder 100 mikroliter af blokerende opløsning.Inkuber ved stuetemperatur i mindst 90 minutter og højst fire timer. Fortyndes de primære antistoffer, anti-PGP9.5 og anti-5G4, i arbejdsopløsningen. Overfør sektionerne til nye brønde, der indeholder 100 mikroliter af arbejdsopløsningen af de primære antistoffer, og inkuber natten over ved stuetemperatur.Den næste dag vaskes sektionerne i brønde, der indeholder vaskeopløsning som tidligere beskrevet. Fortyndes de sekundære antistoffer, gedeanti-kanin til detektere PGP9.5, og Ged anti-mus til at opdage 5G4, i arbejdsopløsningen. De vaskede sektioner overføres til nye brønde, der indeholder 100 mikroliter af arbejdsopløsningen af de sekundære antistoffer.Dæk pladen med aluminiumsfolie for at undgå blegning af fluorophore konjugeret med sekundære antistoffer, og inkubere ved stuetemperatur i 90 minutter. Herefter vaskes sektionerne to gange i vaskeopløsningen som tidligere beskrevet. De vaskede sektioner overføres til nye brønde, der indeholder 100 mikroliter DAPI i fem minutter ved stuetemperatur.Sektionerne vaskes to gange i vaskeopløsningen som tidligere beskrevet. Derefter monteres sektionerne på et dias i den korrekte position, så du undgår fejlfoldning. Tilføj et par dråber monteringsmedium til diaset og dække afsnittet med et dæksel slip.Lad rutsjebanerne tørre natten over. Den næste dag, gemme dias i en passende boks ved fire grader Celsius, og sørg for at undgå lyseksponering. Brug et omvendt fluorescensmikroskop eller et konfokalt mikroskop, se sektionerne.Hent billederne med et kamera, der er forbundet til mikroskopet. Brug derefter et fluorescensmikroskop eller et konfokalt mikroskop til at analysere positive signaler i sektioner med hensyn til rumlig fordeling og intensitet af signalet som beskrevet i tekstprotokollen. Efter den beskrevne metode, alpha synuclein aggregater mærket med 5G4 antistof påvises i dermal nerve fascicles innervating autonome strukturer PD patienter.Morfologien af alfa synuclein indskud vises som et prikket signal langs axoner af dermal nerver. Repræsentativ brug af denne protokol hos 19 PD-patienter og 17 kontroller i hudbiopsier på tre anatomiske steder viser, at 5G4 har en følsomhed på 81% og en specificitet på 86% sammenlignet med sunde kontroller. Fosforyleret alfa synuclein har en følsomhed på 56%, og en specificitet på 100% 5G4 og fosforyleret alpha synuclein-positive aflejringer findes hovedsageligt omkring svedkirtler, men findes også i muskel arrector pili, små fartøjer, og subepidermal og dermal plexus, men aldrig i intraepidermale nerver.Generelt, inden for sved kirtler lumen, er det muligt at observere en uspecifik signal, der kunne misforstås som 5G4 eller fosforyleret alpha synuclein positivitet. Denne type signal er prikket, sfærisk, og det skyldes sandsynligvis intraluminal autofluorescerende materiale som påvist i tekniske kontroller uden primære og sekundære antistoffer. Colocalization med PGP9.5, der markerer nervefibre, som morfologisk er filamentous og aflange, hjælper med at identificere det korrekte signal.Derfor øges specificiteten af 5G4-signalet kraftigt ved en dobbelt immunstaining med en axonal markør. En nøjagtig fiksering af biopsi er nødvendig for at producere en god kvalitet immunfluorescerende farvning og for pålidelig fortolkning af lysstofrør. Hvis fiksativet ikke er korrekt forberedt, eller hvis en over-fiksering har fundet sted, vil resultatet være en høj autofluorescens, der vil maskere signalet af nervefibre krydser dermal-epidermal krydset, eller innervate de vigtigste dermal strukturer.Det mest kritiske trin i denne procedure er vævsfiksering. Vær opmærksom på pH af PLP fiksativ opløsning, og timingen af inkubation, for at undgå autofluorescens og et bestemt signal.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Oral Administration of Rotenone using a Gavage and Image Analysis of Alpha-synuclein Inclusions in the Enteric Nervous System

In Parkinson's disease (PD) patients, the associated pathology follows a characteristic pattern involving inter alia the enteric nervous system (ENS) 1,2, ...

Selective Tracing of Auditory Fibers in the Avian Embryonic Vestibulocochlear Nerve

Selektiv Tracing af Auditive fibre i de Avian embryoer Vestibulocochlear Nerve

The embryonic chick is a widely used model for the study of peripheral and central ganglion cell projections. In the auditory system, selective labeling ...

Transplantation of Olfactory Ensheathing Cells to Evaluate Functional Recovery after Peripheral Nerve Injury

Transplantation af olfaktoriske Ensheathing Cells at evaluere Funktionel Recovery efter perifer nerveskade

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory ...

Sequential Extraction of Soluble and Insoluble Alpha-Synuclein from Parkinsonian Brains

Sekventiel Udvinding af opløselige og uopløselige Alpha-Synuclein fra Parkinson Brains

Alpha-synuclein (&#945;-syn) protein is abundantly expressed mainly within neurons, and exists in a number of different forms - monomers, tetramers, ...

Bioluminescence Imaging of Neuroinflammation in Transgenic Mice After Peripheral Inoculation of Alpha-Synuclein Fibrils

Bioluminescens Billeddannelse af Neuroinflammation i transgene mus efter perifer Inokulering af alfa-synuclein Fibriller

To study the prion-like behavior of misfolded alpha-synuclein, mouse models are needed that allow fast and simple transmission of alpha-synuclein ...

Identification of Dopamine D1-Alpha Receptor Within Rodent Nucleus Accumbens by an Innovative RNA In Situ Detection Technology

Identification of Dopamine D1-Alpha Receptor Within Rodent Nucleus Accumbens by an Innovative RNA In Situ Detection Technology

Identifikation af dopamin D1-Alpha Receptor inden for gnavere kernen Accumbens af en innovativ RNA In Situ opdagelse teknologi

In the central nervous system, the D1-alpha subtype receptor (Drd1&#945;) is the most abundant dopamine (DA) receptor, which plays a vital role in ...

Exogenous Administration of Microsomes-associated Alpha-synuclein Aggregates to Primary Neurons As a Powerful Cell Model of Fibrils Formation

Eksogene Administration af Microsomes-associerede Alpha-synuclein aggregater til primære neuroner som en kraftfuld celle Model af fibriller dannelse

For years, the inability of replicating formation of insoluble alpha-synuclein (&#945;S) inclusions in cell cultures has been a great limitation in the ...

Generation of Alpha-Synuclein Preformed Fibrils from Monomers and Use In Vivo

Generering af alpha-Synuclein præformerede Fibrils fra monomerer og brug in vivo

Use of the in vivo alpha-synuclein preformed fibril (&#945;-syn PFF) model of synucleinopathy is gaining popularity among researchers aiming to model ...

Short-Term Free-Floating Slice Cultures from the Adult Human Brain

Kortsigtede fritflydende udsnit kulturer fra den voksne menneskelige hjerne

Organotypic, or slice cultures, have been widely employed to model aspects of the central nervous system functioning in vitro. Despite the potential of ...

Assessing Early Stage Open-Angle Glaucoma in Patients by Isolated-Check Visual Evoked Potential

Vurdering af tidlig fase Open-Angle Glaukom hos patienter ved Isolated-Check Visual Fremkaldte Potentiale

Recently, the isolated-check visual evoked potential (icVEP) technique was designed and has been reported to detect glaucomatous damage earlier and ...