Name: targeting alpha synuclein aggregates in cutaneous peripheral nerve fibers by free-floating immunofluorescence assay
Uploaded: 2019-06-25T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Targeting Alpha Synuclein Aggregates in Cutaneous Peripheral Nerve Fibers by Free-floating Immunofluorescence Assay at JoVE.com

Wij danken Parkinson Schweiz en ABREOC (de wetenschappelijke adviesraad voor onderzoek van de Ospedaliero Cantonale) voor hun financiële steun aan deze studie.

Het protocol is goedgekeurd door de Cantonal ethische Commissie en alle ingeschreven onderwerpen hebben schriftelijk geïnformeerde toestemming gegeven aan de studie.
1. huid biopsie collectie
<ol><li>Laat een gekwalificeerde arts de huid biopsie uit te voeren in een passende klinische setting.</li>
	<li>Kies het gebied om de huid biopsie uit te voeren en schoon met een alcoholdoekje.</li>
	<li>Bereid de verdoving oplossing met 1 CC van lidocaïne 2%.</li>
	<li>Met de naald parallel aan het ...

<ol>
	<li>McArthur, J. C., Griffin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Another+Tool+for+the+neurologist's+Tollbox.">Another Tool for the neurologist's Tollbox.</a> Annals of Neurology. 57, 163-167 (2005).</li><li>Wilkinson, P. F., Millington, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Skin. , 49-50 (2009).</li><li>Weddell, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+endings+in+mammalian+skin.">Nerve endings in mammalian skin.</a> Biological reviews of the Cambridge Philosophical Society. 30, 159-195 (1954).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+gene+product+9.5-immunoreactve+nerve+fibers+and+cells+in+human+skin.">Protein gene product 9.5-immunoreactve nerve fibers and cells in human skin.</a> Cell and Tissue Research. 261 (1), 25-33 (1990).</li><li>Holland, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraepidermal+nerve+fiber+density+in+patients+with+painful+sensory+neuropathy.">Intraepidermal nerve fiber density in patients with painful sensory neuropathy.</a> Neurology. 48, 708-711 (1997).</li><li>McArthur, J. C., Stocks, E. A., Hauer, P., Cornblath, D. R., Griffin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+nerve+fiber+density:+normative+reference+range+and+diagnostic+efficiency.">Epidermal nerve fiber density: normative reference range and diagnostic efficiency.</a> Archives of Neurology. 55 (12), 1513-1520 (1998).</li><li>Lauria, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=European+Federation+of+Neurological+Societies/Peripheral+Nerve+Society+Guideline+on+the+use+of+skin+biopsy+in+the+diagnosis+of+small+fiber+neuropathy.+Report+of+a+joint+task+force+of+the+European+Federation+of+Neurological+Societies+and+the+Peripheral+Nerve+Society.">European Federation of Neurological Societies/Peripheral Nerve Society Guideline on the use of skin biopsy in the diagnosis of small fiber neuropathy. Report of a joint task force of the European Federation of Neurological Societies and the Peripheral Nerve Society.</a> European Journal of Neurology. 17, 903-912 (2010).</li><li>Provitera, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multi-center,+multinational+age-+and+gender-adjusted+normative+dataset+for+immunofluorescent+intraepidermal+nerve+fiber+density+at+the+distal+leg.">A multi-center, multinational age- and gender-adjusted normative dataset for immunofluorescent intraepidermal nerve fiber density at the distal leg.</a> European Journal of Neurology. 23, 333-338 (2016).</li><li>Wakabayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+the+peripheral+nervous+system+in+synucleinopathies,+tauopathies+and+other+neurodegenerative+proteinopathies+of+the+brain.">Involvement of the peripheral nervous system in synucleinopathies, tauopathies and other neurodegenerative proteinopathies of the brain.</a> Acta Neuropathology. 120, 1-12 (2010).</li><li>Ruffmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+alpha-synuclein+conformational+variants+from+gastro-intestinal+biopsy+tissue+as+a+potential+biomarker+for+Parkinson's+disease.">Detection of alpha-synuclein conformational variants from gastro-intestinal biopsy tissue as a potential biomarker for Parkinson's disease.</a> Neuropathology and Applied Neurobiology. 44 (7), 722-736 (2018).</li><li>Lee, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+search+for+a+peripheral+biopsy+indicator+of+alpha-synuclein+pathology+for+Parkinson+Disease.">The search for a peripheral biopsy indicator of alpha-synuclein pathology for Parkinson Disease.</a> Journal of Neuropathology &amp; Experimental Neurology. 76, 2-15 (2017).</li><li>Donadio, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+nerve+misfolded+alpha-synuclein+in+pure+autonomic+failure+and+Parkinson+disease.">Skin nerve misfolded alpha-synuclein in pure autonomic failure and Parkinson disease.</a> Annals of Neurology. 79, 306-316 (2016).</li><li>Doppler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutaneous+neuropathy+in+Parkinson's+disease:+a+window+into+brain+pathology.">Cutaneous neuropathy in Parkinson's disease: a window into brain pathology.</a> Acta Neuropathologica. 128, 99-109 (2014).</li><li>Zange, L., Noack, C., Hahn, K., Stenzel, W., Lipp, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylated+alpha-synuclein+in+skin+nerve+fibres+differentiates+Parkinson's+disease+from+multiple+system+atrophy.">Phosphorylated alpha-synuclein in skin nerve fibres differentiates Parkinson's disease from multiple system atrophy.</a> Brain. 138, 2310-2321 (2015).</li><li>Braak, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staging+of+brain+pathology+related+to+sporadic+Parkinson's+disease.">Staging of brain pathology related to sporadic Parkinson's disease.</a> Neurobiology of Aging. 24, 197-211 (2003).</li><li>Doppler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dermal+phospho-alpha-synuclein+deposits+confirm+REM+sleep+behaviour+disorder+as+prodromal+Parkinson's+disease.">Dermal phospho-alpha-synuclein deposits confirm REM sleep behaviour disorder as prodromal Parkinson's disease.</a> Acta Neuropathologica. 133 (4), 535-545 (2017).</li><li>Antelmi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+nerve+phosphorylated+&#945;-synuclein+deposits+in+idiopathic+REM+sleep+behavior+disorder.">Skin nerve phosphorylated &#945;-synuclein deposits in idiopathic REM sleep behavior disorder.</a> Neurology. 88 (22), 2128-2131 (2017).</li><li>Nolano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+fiber+pathology+parallels+disease+progression+in+Parkinson+disease:+a+longitudinal+study.">Small fiber pathology parallels disease progression in Parkinson disease: a longitudinal study.</a> Acta Neuropathologica. , (2018).</li><li>Melli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cervical+skin+denervation+associates+with+alpha-synuclein+aggregates+in+Parkinson+disease.">Cervical skin denervation associates with alpha-synuclein aggregates in Parkinson disease.</a> Annals of Clinical and Translational Neurology. 5, 1394-1407 (2018).</li><li>Kovacs, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+processing+of+disease-associated+alpha-synuclein+in+the+human+brain+suggests+prion-like+cell-to-cell+spread.">Intracellular processing of disease-associated alpha-synuclein in the human brain suggests prion-like cell-to-cell spread.</a> Neurobiology Disease. 69, 76-92 (2014).</li><li>Kovacs, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+antibody+with+high+reactivity+for+disease-associated+alpha-synuclein+reveals+extensive+brain+pathology.">An antibody with high reactivity for disease-associated alpha-synuclein reveals extensive brain pathology.</a> Acta Neuropathologica. 124, 37-50 (2012).</li></ol>

We beschrijven een vrij zwevende immunofluorescentie assay voor huid biopten voor de diagnose van PD: het exploiteert dubbele immunokleuring met anti-PGP 9.5 antilichaam, een panaxonal marker, en anti-5G4, een conformatie specifieke antilichaam dat de geaggregeerde vorm erkent van αSyn.
De grote voordelen van huid biopsie voor diagnostische doeleinden in PD en eventueel in andere eiwit conformatie stoornissen zijn: 1) de directe toegang tot zenuwweefsel vatbaar voor ziekte door een licht inva...

Huid biopsie heeft verworven een groot belang als de diagnostische en Research Tool op het gebied van neurologische aandoeningen1. Inderdaad, epidermis en dermis bevatten overvloedige somatische zintuiglijke zenuwvezels (gemyeliniseerde en mergloze), Nociceptieve vrije zenuwuiteinden, zintuiglijke receptoren en autonome innervatie van zweetklieren, schepen, talgklieren en spier arrector pilorum 2.
In het midden van de 20e eeuw, de Setup voor Immunohistochemistry van PGP 9.5 antilichaam toegestaan het bewijs van een uitgebreide innervatie van de menselijke epidermis zoogdier huid3. PGP 9.5 is een carboxyl-Terminal hydrolase gelijkelijk verdeeld langs axons van zowel het centrale en perifere zenuwstelsel (PNS). De beschikbaarheid van dit antilichaam liet niet alleen toe om de morfologie en de anatomie van PNS in de huid te verduidelijken maar ook uitgevoerd de studie van ziekten verbonden aan het3,4. Huid biopsie bijgedragen aan het definiëren van een nieuwe klinische entiteit: de kleine vezel neuropathie. Verschillende internationale groepen toonden de associatie tussen het verlies van intraepidermal zenuwvezels en symptomen/tekenen van kleine Fiber neuropathie5 door de huid biopsie analyse en mits gestandaardiseerde protocollen voor zenuw morphometry evenals normatieve referentiewaarden die in de klinische praktijk6,7,8moeten worden gebruikt.
Onlangs heeft een grote hoeveelheid bewijsmateriaal aangetoond dat neurodegeneratieve ziekten, gekenmerkt door misgevouwen eiwit accumulaties in het centrale zenuwstelsel, zijn multi-systeem pathologieën9. Inderdaad, PD wordt gekenmerkt door αSyn accumulatie in de Dopaminerge neuron van Substantia nigra, maar het is aangetoond dat αSyn en haar pathologische vorm, phosphorylated ΑSyn (P-αSyn), ook kan worden gedetecteerd in de perifere weefsels. Gastro-intestinale mucosa10, speekselklieren11, huid autonome vezels omringende zweetklieren en pilomotor spieren12,13,14, tonen immunoreactivity aan pathogene vormen van αSyn, in overeenstemming met de hypothese van braak dat intrigerend postulaat dat αSyn de pathologie kan in PNS goed vooraf beginnen, vóór zijn accumulatie in hersenen15. Verder, de aanwezigheid van p-αSyn is aangetoond in de huid zenuwen van patiënten met rem gedragsstoornissen die worden beschouwd als prodromal PD16,17 dus huid pathologische αSyn kan worden beschouwd als een veelbelovende vroege perifere histopathologisch marker van synucleinopathy.
De vereniging van kleine vezel neuropathie in PD is eerder aangetoond en het is gebleken dat intraepidermal zenuwvezels dichtheid weerspiegelt progressie van de ziekte18,19. Vandaar, de huid biopsie is een nuttig instrument voor het bestuderen van neurodegeneratie in PD en voor de vaststelling van een pre-mortem histopathologisch diagnose van de ziekte. Inderdaad, huid biopsie heeft een groot voordeel van een gemakkelijk toegankelijke en minimaal invasieve procedure, waardoor de analyse van het zenuwweefsel vatbaar voor de pathologie. Ten slotte, de mogelijkheid van het herhalen van de huid biopsie in de loop van de follow-up van dezelfde patiënten maakt het bestuderen van de longitudinale correlatie met progressie van de ziekte.
In ons laboratorium, het exploiteren van een dubbele immuun-kleuring met PGP 9.5 en de conformatie-specifieke monoclonal 5G4 antilichaam, dat de ziekte specifieke vormen van αSyn met inbegrip van kleine aggregaten20,21erkent, waren we in staat om aan te tonen de aanwezigheid van αSyn aggregaten in huid zenuwen met een veelbelovende hoge diagnostische efficiëntie19. Immunofluorescentie analyse van de huid biopsie in conformationele ziekten onderscheidt zich als een veelbelovende bron van biomarkers door het combineren van zowel de opsporing van eiwit aggregaten en de maatregel van de neurodegeneratie in vivo. Hierna illustreren we een eenvoudig en veelzijdig protocol over de behandeling van de huid biopsie en het uitvoeren van de vrij zwevende immunofluorescentie kleuring voor het opsporen van αSyn aggregaten. Bovendien kan dit protocol worden aangepast voor het richten van een andere proteïne van belang, uitgedrukt in huid PNS.
De volgende studie protocol is gebruikt om de diagnostische nut van geaggregeerde αSyn analyse in de PNS van PD door de huid biopsie19te evalueren. De criteria van de opneming voor PD waren: een welomlijnde klinische diagnose volgens de Britse kenmerkende criteria van de hersenen Bank, ziekteduur minstens 3 jaar, geen familiegeschiedenis, en geen belangrijke cognitieve stoornis of belangrijke dysautonomic symptomen in de geschiedenis. Uitsluitingscriteria waren bekende oorzaken van neuropathie (versuikerde hemoglobine, creatinine, vitamine B12, TSH, serum immunofixation, HIV, HCV, syfilis, en Borreliosis). Elk onderwerp onderging aan 3 mm-diameter huid biopten bij drie anatomische plaatsen (hals bij C8 dermatomale niveau, dij 10 cm boven de knie, been 10 cm boven zij malleolus) aan de kant, die klinisch meer werd beïnvloed. In het algemeen, het volgende protocol is over de behandeling van de huid biopsie en het uitvoeren van de vrij zwevende immunofluorescentie kleuring en analyse. Vandaar kan het worden aangepast en worden gebruikt voor de opsporing van andere proteïnen van belang in huidweefsel.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:964px;" width="964">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:264px;">5G4 (anti human &#945;Syneclein 5G4)</td>
			<td style="width:161px;">Analytik Jena Roboscreen</td>
			<td style="width:344px;">847-0102004001</td>
			<td style="width:195px;">Mouse monoclonal&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">AlexaFluor 488 Goat anti Rabbit IgG&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1971418</td>
			<td>2mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">AlexaFluor 594 Goat anti Mouse IgG&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1922849</td>
			<td>2mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Disodium hydrogen phosphate solution</td>
			<td>Merk Millipore</td>
			<td>106586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ethylene Glycol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>324558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Lysine monohydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L5626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Aldrich Chemistry</td>
			<td>441244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:264px;">PGP9.5</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab15503</td>
			<td>Rabbit polyclonal</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodium Dihydrogen Phosphate Monohydrate</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>106346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodium (meta)periodate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trizma Base</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tryton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Vectashield&#160;</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td>Mounting medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

targeting alpha synuclein aggregates in cutaneous peripheral nerve fibers by free-floating immunofluorescence assay

Tot op heden is voor de meeste neurodegeneratieve ziekten alleen een post-mortem histopathologisch definitieve diagnose beschikbaar. Voor de ziekte van Parkinson (PD), de diagnose nog steeds berust alleen op klinische symptomen van de motor betrokkenheid die later verschijnen in de ziekte natuurlijk, wanneer de meeste van de Dopaminerge neuronen zijn al verloren. Daarom is er een sterke behoefte aan een biomarker die patiënten kunnen identificeren aan het begin van de ziekte of op het risico van de ontwikkeling ervan. In de afgelopen jaren, huid biopsie heeft bewezen een uitstekend onderzoek en diagnostisch hulpmiddel voor perifere zenuwziekten zoals kleine vezel neuropathie. Interessant is dat een kleine Fiber neuropathie en Alfa synuclein (αSyn) neurale deposito's zijn aangetoond door huid biopsie bij PD patiënten. Inderdaad, huid biopsie heeft het grote voordeel dat het een gemakkelijk toegankelijke, minimaal invasieve en pijnloze procedure die het mogelijk maakt de analyse van perifeer zenuwweefsel vatbaar voor de pathologie. Bovendien, de mogelijkheid van het herhalen van de huid biopsie in de loop van de follow-up van dezelfde patiënt maakt het bestuderen van de longitudinale correlatie met de progressie van de ziekte. We zetten een gestandaardiseerd betrouwbaar protocol om de aanwezigheid van αSyn aggregaten in de huidzenuw vezels van de PD patiënt te onderzoeken. Dit protocol omvat weinig korte fixatie stappen, een cryotome en vervolgens een vrij zwevende immunofluorescentie Double-kleuring met twee specifieke antilichamen: anti-eiwit gen product 9,5 (PGP 9.5) om de cutane zenuwvezels en anti 5G4 voor het opsporen van merk αSyn aggregaten. Het is een veelzijdig, gevoelig en gemakkelijk uit te voeren protocol dat ook kan worden toegepast voor het richten van andere eiwitten van belang in de huid zenuwen. De mogelijkheid om αSyn aggregaten merk is een andere stap voorwaarts om het gebruik van huid biopsie als een instrument voor de vaststelling van een pre-mortem histopathologisch diagnose van PD.

Naar aanleiding van de beschreven procedure (Figuur 1), we gedetecteerd αSyn aggregaten, gelabeld met 5G4 antilichaam, in dermale zenuwbundels innervating autonome structuren van PD patiënten. De morfologie van Alfa-synuclein deposito's verschijnt als een gestippelde signaal langs de axonen van de huid zenuwen (Figuur 2). Inderdaad, het exploiteren van dit protocol in 19 PD patiënten en 17 controles in de huid biopten op drie anatomische site (cervicale, dij ...

Watch this Scientific Journal Video about Targeting Alpha Synuclein Aggregates in Cutaneous Peripheral Nerve Fibers by Free-floating Immunofluorescence Assay at JoVE.com

Targeting Alpha Synuclein Aggregates in Cutaneous Peripheral Nerve Fibers by Free-floating Immunofluorescence Assay

Hier presenteren we een protocol voor een vrij zwevende indirecte immunofluorescentie assay op de huid biopsie secties die het mogelijk maakt voor de identificatie van de ziekte specifieke conformatie varianten van Alfa synuclein betrokken bij de ziekte van Parkinson en meerdere eiwitten van de perifere zenuwstelsel.

Targeting Alfa Synuclein aggregaten in cutane perifere zenuwvezels door Free-floating immunofluorescentie assay

To date, for most neurodegenerative diseases only a post-mortem histopathological definitive diagnosis is available. For Parkinson&#39;s disease (PD), the ...

De diagnose van de ziekte van Parkinson is nog steeds afhankelijk van klinische tekenen van motorische betrokkenheid die later verschijnen in de loop van de ziekte, wanneer de meeste neuronen van de substantia nigra al verloren zijn gegaan. Dit protocol maakt het mogelijk de huidzenuwen analyse door huidbiopsie, dat een potentiële nieuwe biomarker van de ziekte vertegenwoordigt, te worden gebruikt in klinische proeven. Huidbiopsie is een gemakkelijk te beoordelen, niet-invasieve procedure die de analyse van perifeer zenuwweefsel dat gevoelig is voor de pathologie mogelijk maakt.Alpha synuclein aggregaten detectie door huidbiopsie kan worden gebruikt voor diagnostische doeleinden, eventueel in vroege fasen, wanneer potentiële genezing het meest effectief is. Follow-up huidbiopten bij dezelfde patiënt zorgen voor een tijd en speciale cursusanalyse van alfasynuclein aggregaat verspreiding in het menselijk cutane zenuwstelsel. Deze kunnen licht werpen op de pathogenese van de ziekte.Als u deze procedure wilt starten, stelt u een nieuwe PLP-fixatieve oplossing voor, zoals beschreven in tabel één van het tekstprotocol. Onmiddellijk na het verzamelen van huidbiopsie, dompel het onder in een buis met 10 milliliter van de fixatieve oplossing. Incubeer 's nachts bij vier graden Celsius.De volgende dag, in een rookkap, verwijder de PLP fixatief voorzichtig. In dezelfde buis, was de biopsie drie keer gedurende vijf minuten per stuk, met behulp van vijf milliliter van 0,1 molar Sorensen's oplossing voor elke wasbeurt. Gooi de oplossing van de Sorensen weg en voeg vijf milliliter cryoprotectantoplossing toe.Incubeer 's nachts bij vier graden Celsius. Bewaar de biopsie de volgende dag op vier graden Celsius als de snede met een cryotoom binnen een week moet worden uitgevoerd. Stel eerst de cryotome op min 20 graden Celsius.Neem een cryomold en vul het met cryo-inbedding medium. Met behulp van een pincet, dompel de biopsie in de cryo-inbedding medium, met de longitudinale as parallel aan de onderkant van de cryomold. Bevries het monster met vloeibare stikstof, om een stevige kubus van cryo-inbedding medium met de biopsie in de juiste oriëntatie te verkrijgen.Doe het monster in de cryostat en wacht 30 minuten om de biopsie te laten acclimatiseren. Bevestig vervolgens het monster op de cryostat en snijd in secties van 50 micrometer. Breng met behulp van een kleine borstel de cryo-secties over op een 96-putplaat met 200 microliter antivriesoplossing in elke put.Bewaar hierna de plaat op min 20 graden Celsius. Vul om te beginnen enkele van de putten van een verse 96-put plaat met 100 microliter wasoplossing. Breng de te analyseren secties over van de opbergplaat naar de die met de wasoplossing.Laat de secties in de wasoplossing gedurende 10 minuten op kamertemperatuur. Breng vervolgens elke sectie over in een lege put met dezelfde wasoplossing en herhaal de was. Voeg vervolgens een wasoplossing toe aan de secties en breng ze over naar nieuwe putten met 100 microliter blokkeeroplossing.Incubeer bij kamertemperatuur gedurende ten minste 90 minuten, en een maximum van vier uur. Verdun de primaire antilichamen, anti-PGP9.5 en anti-5G4, in de werkoplossing. Breng de secties over in nieuwe putten met 100 microliter van de werkoplossing van de primaire antilichamen en broed 's nachts uit bij kamertemperatuur.De volgende dag, was de secties in putten met wasoplossing zoals eerder beschreven. Verdun de secundaire antilichamen, Goat anti-Rabbit om PGP9.5 te detecteren, en Goat anti-Mouse om 5G4 te detecteren, in de werkoplossing. Breng de gewassen secties over in nieuwe putten met 100 microliter van de werkoplossing van de secundaire antilichamen.Bedek de plaat met aluminiumfolie om te voorkomen dat fluorofofoër geconjugeerd met secundaire antilichamen, en uitbroeden bij kamertemperatuur gedurende 90 minuten. Daarna was je de secties twee keer in de wasoplossing zoals eerder beschreven. Breng de gewassen secties in nieuwe putten met 100 microliters van DAPI gedurende vijf minuten op kamertemperatuur.Was de secties twee keer in wasoplossing zoals eerder beschreven. Monteer vervolgens de secties op een dia in de juiste positie, waardoor verkeerd worden gevouwen. Voeg een paar druppels montagemedium toe aan de dia en bedek de sectie met een afdeksel.Laat de glijbanen 's nachts drogen. De volgende dag, bewaar de dia's in een geschikte doos op vier graden Celsius, zorg ervoor dat blootstelling aan licht te voorkomen. Met behulp van een omgekeerde fluorescentie microscoop of een confocale microscoop, bekijk de secties.Verkrijg de beelden door een camera aangesloten op de microscoop. Gebruik vervolgens een fluorescentiemicroscoop of een confocale microscoop om positieve signalen in secties te analyseren in termen van ruimtelijke verdeling en intensiteit van het signaal zoals beschreven in het tekstprotocol. Volgens de beschreven methode worden alfasynucleinaggregaten met 5G4-antilichaam gedetecteerd in huidzenuw fascicles innervating autonome structuren van PD-patiënten.De morfologie van alfa synuclein deposito's verschijnt als een gestippeld signaal langs de axonen van dermale zenuwen. Representatief gebruik van dit protocol bij 19 PD-patiënten en 17 controles in huidbiopten op drie anatomische locaties toont aan dat 5G4 een gevoeligheid heeft van 81% en een specificiteit van 86%in vergelijking met gezonde controles. Fosforylated alpha synuclein heeft een gevoeligheid van 56%en een specificiteit van 100%5G4 en fosforylated alpha synuclein-positieve afzettingen zijn voornamelijk te vinden rond zweetklieren, maar zijn ook te vinden in spierarrector pili, kleine bloedvaten, en subepidermale en dermale plexus, maar nooit in intraepmalider zenuwvezels.Over het algemeen is het in het zweetklieren lumen mogelijk om een niet-specifiek signaal waar te nemen dat verkeerd kan worden geïnterpreteerd als 5G4 of fosforylated alpha synuclein positiviteit. Dit type signaal is gestippeld, bolvormig, en het is waarschijnlijk te wijten aan intraluminale autofluorescentie materiaal zoals aangetoond in technische controles zonder primaire en secundaire antilichamen. Colocalisatie met PGP9.5 die de zenuwvezels markeert, die morfologisch filamenteus en langwerpig zijn, helpt om het juiste signaal te identificeren.Daarom wordt de specificiteit van 5G4-signaal sterk verhoogd door een dubbele immunostaining met een axonale marker. Een nauwkeurige fixatie van de biopsie is noodzakelijk voor het produceren van een hoogwaardige immunofluorescente kleuring en voor de betrouwbare interpretatie van de tl-signalen. Als de fixatieve niet correct is voorbereid, of als een over-fixatie heeft plaatsgevonden, zal het resultaat een hoge autofluorescentie die het signaal van zenuwvezels het oversteken van de huid-epidermale kruising zal maskeren, of innervate de belangrijkste huidstructuren.De meest kritieke stap van deze procedure is weefselfixatie. Besteed aandacht aan de pH van PLP fixatieve oplossing, en de timing van de incubatie, om autofluorescentie en een specifiek signaal te voorkomen.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Oral Administration of Rotenone using a Gavage and Image Analysis of Alpha-synuclein Inclusions in the Enteric Nervous System

Orale toediening van Rotenon met behulp van een Gavage en beeldanalyse van de Alpha-synucleïne inclusies in het enterisch zenuwstelsel

In Parkinson's disease (PD) patients, the associated pathology follows a characteristic pattern involving inter alia the enteric nervous system (ENS) 1,2, ...

Selective Tracing of Auditory Fibers in the Avian Embryonic Vestibulocochlear Nerve

Selectieve Tracing van auditieve vezels in de Avian Embryonale evenwichtszenuw Nerve

The embryonic chick is a widely used model for the study of peripheral and central ganglion cell projections. In the auditory system, selective labeling ...

Transplantation of Olfactory Ensheathing Cells to Evaluate Functional Recovery after Peripheral Nerve Injury

Transplantatie van olfactorische Ensheathing Cellen tot functioneel herstel Evalueer na perifere zenuwschade

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory ...

Sequential Extraction of Soluble and Insoluble Alpha-Synuclein from Parkinsonian Brains

Sequentiële extractie van oplosbare en onoplosbare Alpha-Synuclein van Parkinson Brains

Alpha-synuclein (&#945;-syn) protein is abundantly expressed mainly within neurons, and exists in a number of different forms - monomers, tetramers, ...

Bioluminescence Imaging of Neuroinflammation in Transgenic Mice After Peripheral Inoculation of Alpha-Synuclein Fibrils

Bioluminescentie beeldvorming van ontstekingsprocessen in transgene muizen Na Perifere Enten van alfa-synucleine fibrillen

To study the prion-like behavior of misfolded alpha-synuclein, mouse models are needed that allow fast and simple transmission of alpha-synuclein ...

Identification of Dopamine D1-Alpha Receptor Within Rodent Nucleus Accumbens by an Innovative RNA In Situ Detection Technology

Identification of Dopamine D1-Alpha Receptor Within Rodent Nucleus Accumbens by an Innovative RNA In Situ Detection Technology

Identificatie van Dopamine D1-Alpha Receptor binnen knaagdier Nucleus Accumbens door een innovatieve RNA In Situ de technologie van de opsporing

In the central nervous system, the D1-alpha subtype receptor (Drd1&#945;) is the most abundant dopamine (DA) receptor, which plays a vital role in ...

Exogenous Administration of Microsomes-associated Alpha-synuclein Aggregates to Primary Neurons As a Powerful Cell Model of Fibrils Formation

Exogene toediening van Alpha-synuclein Microsomes-geassocieerde aggregaten te primaire neuronen als een krachtige cel Model van de vorming van fibrillen

For years, the inability of replicating formation of insoluble alpha-synuclein (&#945;S) inclusions in cell cultures has been a great limitation in the ...

Generation of Alpha-Synuclein Preformed Fibrils from Monomers and Use In Vivo

Generatie van Alfa-Synuclein voorgevormde fibrillen van monomeren en gebruik in vivo

Use of the in vivo alpha-synuclein preformed fibril (&#945;-syn PFF) model of synucleinopathy is gaining popularity among researchers aiming to model ...

Short-Term Free-Floating Slice Cultures from the Adult Human Brain

Korte-termijn vrij zwevende segment culturen van het volwassen menselijk brein

Organotypic, or slice cultures, have been widely employed to model aspects of the central nervous system functioning in vitro. Despite the potential of ...

Assessing Early Stage Open-Angle Glaucoma in Patients by Isolated-Check Visual Evoked Potential

Beoordeling van early stage open-angle glaucoom bij patiënten door geïsoleerde-check visuele opgeroepen potentieel

Recently, the isolated-check visual evoked potential (icVEP) technique was designed and has been reported to detect glaucomatous damage earlier and ...