Name: targeting alpha synuclein aggregates in cutaneous peripheral nerve fibers by free-floating immunofluorescence assay
Uploaded: 2019-06-25T13:30:00
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Nous remercions Parkinson Schweiz et ABREOC (le Conseil consultatif de recherche scientifique de l'Ente Ospedaliero Cantonale) pour leur soutien financier à cette étude.

Le protocole a été approuvé par le Comité cantonal d'éthique et tous les sujets inscrits ont donné leur consentement éclairé écrit à l'étude.
1. Collection de biopsie de peau
<ol><li>Laissez un médecin qualifié effectuer la biopsie de la peau dans un cadre clinique approprié.</li>
	<li>Choisissez la zone pour effectuer la biopsie de la peau et nettoyez-la avec un écouvillon d'alcool.</li>
	<li>Préparer la solution anesthésique avec 1 cc de lidocaïne 2%.</li>
	<li>Avec l'aig...

<ol>
	<li>McArthur, J. C., Griffin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Another+Tool+for+the+neurologist's+Tollbox.">Another Tool for the neurologist's Tollbox.</a> Annals of Neurology. 57, 163-167 (2005).</li><li>Wilkinson, P. 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G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+processing+of+disease-associated+alpha-synuclein+in+the+human+brain+suggests+prion-like+cell-to-cell+spread.">Intracellular processing of disease-associated alpha-synuclein in the human brain suggests prion-like cell-to-cell spread.</a> Neurobiology Disease. 69, 76-92 (2014).</li><li>Kovacs, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+antibody+with+high+reactivity+for+disease-associated+alpha-synuclein+reveals+extensive+brain+pathology.">An antibody with high reactivity for disease-associated alpha-synuclein reveals extensive brain pathology.</a> Acta Neuropathologica. 124, 37-50 (2012).</li></ol>

Nous décrivons un analyse d'immunofluorescence flottante pour des biopsies de peau pour le diagnostic de : il exploite l'immunostaining double avec l'anticorps anti-PGP9.5, un marqueur panaxonal, et anti-5G4, un anticorps spécifique de conformation qui reconnaît la forme agrégée de Syn.
Les grands avantages de la biopsie de peau pour le but diagnostique dans la MP et probablement dans d'autres désordres conformationnels de protéine sont : 1) l'accès direct au tissu nerveux enclin à la...

La biopsie de la peau a acquis une grande importance en tant qu'outil de diagnostic et de recherche dans le domaine des troubles neurologiques1. En effet, l'épiderme et le derme contiennent d'abondantes fibres nerveuses sensorielles somatiques (myélinisés et non myélinistielles), des terminaisons nerveuses sans nociceptive, des récepteurs sensoriels et une innervation autonome des glandes sudoripares, des vaisseaux, des glandes sébacées et des pilorum d'arrector musculaires. 2.
Au milieu du XXe siècle, la configuration de l'immunohistochimie de l'anticorps PGP9.5 a permis l'évidence d'une innervation étendue de la peau humaine de mammifères d'épiderme3. PGP9.5 est un hydrolase carboxyl-terminal également réparti le long des axones du système nerveux central et périphérique (PNS). La disponibilité de cet anticorps a permis non seulement de clarifier la morphologie et l'anatomie de PNS dans la peau, mais a également mis en œuvre l'étude des maladies qui lui sont associées3,4. La biopsie de peau a contribué à définir une nouvelle entité clinique : la neuropathie de petite fibre. Plusieurs groupes internationaux ont démontré l'association entre la perte des fibres nerveuses intraépidermiques et des symptômes/signes de la neuropathie de petite fibre5 par l'analyse de biopsie de peau et ont fourni des protocoles normalisés pour la morphométrie de nerf aussi bien que valeurs de référence normatives à utiliser dans la pratique clinique6,7,8.
Récemment, une grande quantité de preuves a montré que les maladies neurodégénératives, caractérisées par des accumulations de protéines mal repliées dans le système nerveux central, sont des pathologies multi-systèmes9. En effet, la DP se caractérise par une accumulation de Syn dans le neurone dopaminergique de la substantia nigra, mais il a été démontré que le Syn et sa forme pathologique, phosphorylée Syn (P-Syn), pouvaient être détectés également dans les tissus périphériques. La muqueuse gastro-intestinale10, glandes salivaires11, fibres autonomes de la peau entourant les glandes sudoripares et les muscles pilomoteurs12,13,14, montrent l'immunoréactivité aux formes pathogènes de 'Syn, en conformément à l'hypothèse de Braak qui postulent intrigantement que la pathologie de Syn peut commencer dans PNS bien à l'avance, avant son accumulation dans le cerveau15. En outre, la présence de p-Syn a été démontrée dans les nerfs de peau des patients présentant des désordres de comportement de REM qui sont considérés prodromal16,17 ainsi la peau pathologique - Syn peut être considérée un périphérique tôt prometteur marqueur histopathologique de synucleinopathy.
L'association de la neuropathie de petite fibre dans a été démontrée précédemment et il a été constaté que la densité intraepidermal de fibres de nerf reflète la progression de la maladie18,19. Par conséquent, la biopsie de peau est un outil utile pour étudier la neurodégénérescence dans la MP et pour établir un diagnostic histopathologique pré-mortem de la maladie. En effet, la biopsie de la peau a un grand avantage d'être une procédure facilement accessible et peu invasive, permettant l'analyse des tissus nerveux enclins à la pathologie. Enfin, la possibilité de répéter la biopsie de la peau au cours du suivi des mêmes patients permet d'étudier la corrélation longitudinale avec la progression de la maladie.
Dans notre laboratoire, l'exploitation d'une double immuno-coloration avec PGP9.5 et l'anticorps monoclonal 5G4 conformation-spécifique, qui reconnaît les formes spécifiques de la maladie de 'Syn y compris les petits agrégats20,21, nous avons pu montrer le présence d'agrégats syn dans les nerfs de la peau avec une efficacité diagnostique élevée prometteuse19. L'analyse d'immunofluorescence de la biopsie de peau dans les maladies conformationnelles se distingue comme source prometteuse de biomarqueurs en combinant à la fois la détection des agrégats protéiques et la mesure de la neurodégénérescence in vivo. Par la suite, nous illustrons un protocole facile et polyvalent sur la manipulation de la biopsie de peau et l'exécution de la coloration d'immunofluorescence flottante libre pour détecter des agrégats de Syn. En outre, ce protocole peut être adapté pour cibler toute autre protéine d'intérêt exprimée dans la peau PNS.
Le protocole d'étude suivant a été utilisé pour évaluer l'utilité diagnostique de l'analyse agrégée de Syn dans le PNS de la MP par biopsie de peau19. Les critères d'inclusion pour la étaient : un diagnostic clinique défini selon les critères diagnostiques de banque de cerveau du R-U, la durée de la maladie au moins 3 ans, aucune histoire de famille, et aucune affaiblissement cognitif majeur ou symptômes dysautonomic principaux dans l'histoire. Les critères d'exclusion étaient des causes connues de neuropathie (hémoglobine glyquée, créatinine, vitamine B12, TSH, immunofixation du sérum, VIH, VHC, syphilis et borréliose). Chaque sujet a subi des biopsies de peau de 3 millimètres de diamètre à trois emplacements anatomiques (cou au niveau dermatomal de C8, cuisse 10 cm au-dessus du genou, jambe 10 cm au-dessus du malleolus latéral) sur le côté, qui a été médicalement plus affecté. En général, le protocole suivant consiste à traiter la biopsie de la peau et à effectuer la coloration et l'analyse de l'immunofluorescence flottante. Par conséquent, il peut être adapté et utilisé pour la détection d'autres protéines d'intérêt dans les tissus cutanés.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:964px;" width="964">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:264px;">5G4 (anti human &#945;Syneclein 5G4)</td>
			<td style="width:161px;">Analytik Jena Roboscreen</td>
			<td style="width:344px;">847-0102004001</td>
			<td style="width:195px;">Mouse monoclonal&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">AlexaFluor 488 Goat anti Rabbit IgG&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1971418</td>
			<td>2mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">AlexaFluor 594 Goat anti Mouse IgG&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1922849</td>
			<td>2mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Disodium hydrogen phosphate solution</td>
			<td>Merk Millipore</td>
			<td>106586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ethylene Glycol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>324558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Lysine monohydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L5626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Aldrich Chemistry</td>
			<td>441244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:264px;">PGP9.5</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab15503</td>
			<td>Rabbit polyclonal</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodium Dihydrogen Phosphate Monohydrate</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>106346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodium (meta)periodate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trizma Base</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tryton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Vectashield&#160;</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td>Mounting medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

targeting alpha synuclein aggregates in cutaneous peripheral nerve fibers by free-floating immunofluorescence assay

À ce jour, pour la plupart des maladies neurodégénératives, seul un diagnostic histopathologique post-mortem définitif est disponible. Pour la maladie de Parkinson (PD), le diagnostic repose toujours seulement sur des signes cliniques de la participation motrice qui apparaissent plus tard dans le cours de la maladie, quand la plupart des neurones dopaminergiques sont déjà perdus. Par conséquent, il y a un fort besoin d'un biomarqueur qui puisse identifier les patients au début de la maladie ou au risque de le développer. Au cours des dernières années, la biopsie de la peau s'est avérée être un excellent outil de recherche et de diagnostic pour les maladies nerveuses périphériques telles que la neuropathie des petites fibres. Fait intéressant, une petite neuropathie de fibre et des dépôts neuronaux alpha synucléines ont été montrés par biopsie de peau dans les patients de. En effet, la biopsie de la peau a le grand avantage d'être une procédure facilement accessible, peu invasive et indolore qui permet l'analyse du tissu nerveux périphérique enclin à la pathologie. En outre, la possibilité de répéter la biopsie de peau au cours du suivi du même patient permet d'étudier la corrélation longitudinale avec la progression de la maladie. Nous avons mis en place un protocole fiable normalisé pour étudier la présence des agrégats de Syn dans les fibres nerveuses de peau du patient de. Ce protocole implique peu d'étapes courtes de fixation, une section cryotome et puis une double coloration d'immunofluorescence flottante avec deux anticorps spécifiques : anti-produit de gène de protéine 9.5 (PGP9.5) pour marquer les fibres cutanées de nerf et anti 5G4 pour détecter Agrégats Syn. Il s'agit d'un protocole polyvalent, sensible et facile à exécuter qui peut également être appliqué pour cibler d'autres protéines d'intérêt dans les nerfs de la peau. La capacité de marquer les agrégats de Syn est un autre pas en avant à l'utilisation de la biopsie de peau comme outil pour établir un diagnostic histopathologique pré-mortem de.

Après la procédure décrite (Figure 1), nous avons détecté des agrégats de Syn, étiquetés avec l'anticorps 5G4, dans les fascicles de nerf dermique intériorisant des structures autonomes des patients de. La morphologie des dépôts d'alpha-synucléine apparaît comme un signal pointillé le long des axones des nerfs dermiques (Figure 2). En effet, en exploitant ce protocole dans 19 patients de et 17 contrôles dans des biopsies de peau à trois emplaceme...

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Targeting Alpha Synuclein Aggregates in Cutaneous Peripheral Nerve Fibers by Free-floating Immunofluorescence Assay

Ici, nous présentons un protocole pour un test d'immunofluorescence indirecte flottant sur les sections de biopsie de peau qui permet l'identification des variantes spécifiques de conformation de la maladie de la synuclein alpha impliquée dans la maladie de Parkinson et les protéines multiples du système nerveux périphérique.

Cibler les agrégats alpha synuclein dans les fibres nerveuses périphériques cutanées par l'évaluation de l'immunofluorescence flottante

To date, for most neurodegenerative diseases only a post-mortem histopathological definitive diagnosis is available. For Parkinson&#39;s disease (PD), the ...

Le diagnostic de la maladie de Parkinson repose toujours sur des signes cliniques de participation motrice qui apparaissent plus tard au cours de la maladie, lorsque la plupart des neurones du nigra substantia sont déjà perdus. Ce protocole permet d’utiliser l’analyse des nerfs cutanés par biopsie cutanée, qui représente un nouveau biomarqueur potentiel de la maladie, dans le cadre d’essais cliniques. La biopsie cutanée est une procédure facilement évaluable et non invasive qui permet l’analyse du tissu nerveux périphérique qui est sujette à la pathologie.Alpha synucléine agrégats détection par biopsie de la peau peut être utilisé à des fins diagnostiques, peut-être à des phases précoces, lorsque la guérison potentielle est le plus efficace. Les biopsies de peau de suivi dans le même patient permettent une analyse de temps et de cours spécial de l’agrégat d’alpha synuclein se propageant dans le système nerveux cutané humain. Ceux-ci peuvent faire la lumière sur la pathogénie de la maladie.Pour commencer cette procédure, préparez une nouvelle solution fixative PLP telle qu’elle est décrite dans le tableau un du protocole texte. Immédiatement après la collecte de la biopsie de la peau, submergez-la dans un tube contenant 10 millilitres de la solution fixative. Incuber toute la nuit à quatre degrés Celsius.Le lendemain, dans une hotte de fumée, retirez doucement le fixatif PLP. Dans le même tube, laver la biopsie trois fois pendant cinq minutes chacune, à l’aide de cinq millilitres de la solution de la molaire Sorensen pour chaque lavage. Jetez la solution du Sorensen et ajoutez cinq millilitres de solution cryoprotectrice.Incuber toute la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain, stockez la biopsie à quatre degrés Celsius si la coupe avec un cryotome doit être effectuée dans un délai d’une semaine. Tout d’abord, réglez le cryotome à moins 20 degrés Celsius.Prenez un cryomold et remplissez-le avec un milieu cryo-enseurgeant. À l’aide d’une pince à épiler, plonger la biopsie dans le milieu cryo-entéré, avec l’axe longitudinal parallèle au fond du cryomold. Snap congeler l’échantillon avec de l’azote liquide, pour obtenir un cube solide de cryo-intégration milieu contenant la biopsie dans la bonne orientation.Mettez l’échantillon dans le cryostat et attendez 30 minutes pour permettre à la biopsie de s’acclimater. Ensuite, fixez l’échantillon sur le cryostat et coupez-le en sections de 50 micromètres. À l’aide d’une petite brosse, transférer les cryo-sections dans une plaque de 96 puits contenant 200 microlitres de solution antigel dans chaque puits.Après cela, conserver la plaque à moins 20 degrés Celsius. Pour commencer, remplissez certains des puits d’une assiette fraîche de 96 puits avec 100 microlitres de solution de lavage. Transférez les sections à analyser de la plaque de stockage à celle contenant la solution de lavage.Laissez les sections dans la solution de lavage pendant 10 minutes à température ambiante. Ensuite, transférez chaque section dans un puits vide contenant la même solution de lavage, et répétez le lavage. Ensuite, ajoutez une solution de lavage aux sections et transférez-les dans de nouveaux puits contenant 100 microlitres de solution de blocage.Incuber à température ambiante pendant au moins 90 minutes, et un maximum de quatre heures. Diluer les anticorps primaires, anti-PGP9.5 et anti-5G4, dans la solution de travail. Transférer les sections dans de nouveaux puits contenant 100 microlitres de la solution de travail des anticorps primaires, et incuber toute la nuit à température ambiante.Le lendemain, lavez les sections dans des puits contenant une solution de lavage comme décrit précédemment. Diluer les anticorps secondaires, chèvre anti-lapin pour détecter PGP9.5, et chèvre anti-souris pour détecter 5G4, dans la solution de travail. Transférer les sections lavées dans de nouveaux puits contenant 100 microlitres de la solution de travail des anticorps secondaires.Couvrir la plaque de papier d’aluminium pour éviter le blanchiment du fluorophore conjugué à des anticorps secondaires, et incuber à température ambiante pendant 90 minutes. Après cela, laver les sections deux fois dans la solution de lavage comme décrit précédemment. Transférer les sections lavées dans de nouveaux puits contenant 100 microlitres de DAPI pendant cinq minutes à température ambiante.Lavez les sections deux fois dans la solution de lavage comme décrit précédemment. Ensuite, montez les sections sur une glissière dans la bonne position, en évitant les mauvais déroulements. Ajouter quelques gouttes de milieu de montage à la lame et couvrir la section d’un glissement de couvercle.Laissez sécher les toboggans pendant la nuit. Le lendemain, rangez les glissières dans une boîte appropriée à quatre degrés Celsius, en vous assurant d’éviter l’exposition à la lumière. À l’aide d’un microscope à fluorescence inversé ou d’un microscope confocal, visualisez les sections.Acquérir les images par une caméra connectée au microscope. Ensuite, utilisez un microscope à fluorescence ou un microscope confocal pour analyser les signaux positifs en sections en termes de distribution spatiale et d’intensité du signal tel que décrit dans le protocole texte. Suivant la méthode décrite, des agrégats alpha synucléine étiquetés avec l’anticorps 5G4 sont détectés dans les fascicles de nerf dermique innervant des structures autonomes des patients de.La morphologie des dépôts alpha synucléine apparaît comme un signal pointillé le long des axones des nerfs cutatéaux. L’utilisation représentative de ce protocole chez 19 patients atteints de MP et 17 contrôles dans les biopsies cutanées à trois sites anatomiques montre que la 5G4 a une sensibilité de 81% et une spécificité de 86% par rapport aux contrôles sains. La synucléine alpha phosphorylatée a une sensibilité de 56% et une spécificité de 100%5G4 et des dépôts alpha synuclein-positifs phosphorylatés se trouvent principalement autour des glandes sudoripares, mais sont également trouvés dans le pili d’arriéré de muscle, les petits vaisseaux, et le plexus subepidermal et dermique, mais jamais dans les fibres intraepidermales de nerf.Généralement, dans les glandes sudoripares lumen, il est possible d’observer un signal non spécifique qui pourrait être mal interprété comme 5G4 ou phosphorylated alpha synuclein positivité. Ce type de signal est pointillé, sphérique, et il est probablement dû au matériel autofluorescent intraluminal tel que démontré dans les contrôles techniques sans anticorps primaires et secondaires. La colocalisation avec PGP9.5 qui marque les fibres nerveuses, qui sont morphologiquement filamenteuses et allongées, aide à identifier le signal correct.Par conséquent, la spécificité du signal 5G4 est fortement augmentée par une double immunostaining avec un marqueur axonal. Une fixation précise de la biopsie est nécessaire pour produire une coloration immunofluorescente de bonne qualité et pour l’interprétation fiable des signaux fluorescents. Si le fixatif n’est pas correctement préparé, ou si une sur-fixation s’est produite, le résultat sera une autofluorescence élevée qui masquera le signal des fibres nerveuses traversant la jonction dermique-épidermique, ou innervate les structures cutanées principales.L’étape la plus critique de cette procédure est la fixation des tissus. Faites attention au pH de la solution fixative PLP, et le moment de l’incubation, pour éviter l’autofluorescence et un signal spécifique.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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Neurosciences

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