Name: targeting alpha synuclein aggregates in cutaneous peripheral nerve fibers by free-floating immunofluorescence assay
Uploaded: 2019-06-25T13:30:00
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Wir danken Parkinson Schweiz und ABREOC (dem Wissenschaftlichen Forschungsbeirat der Ente Ospedaliero Cantonale) für die finanzielle Unterstützung dieser Studie.

Das Protokoll wurde von der kantonalen Ethikkommission genehmigt und alle eingeschriebenen Probanden gaben der Studie schriftlich ihre Zustimmung.
1. Hautbiopsie-Sammlung
<ol><li>Lassen Sie einen qualifizierten Arzt die Hautbiopsie in einem geeigneten klinischen Umfeld durchführen.</li>
	<li>Wählen Sie den Bereich, um die Hautbiopsie durchzuführen und reinigen Sie sie mit einem Alkoholtupfer.</li>
	<li>Bereiten Sie die Anästhetikumlösung mit 1 cc Lidocain 2%.</li>
	<li>Mit der Nadel par...

<ol>
	<li>McArthur, J. C., Griffin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Another+Tool+for+the+neurologist's+Tollbox.">Another Tool for the neurologist's Tollbox.</a> Annals of Neurology. 57, 163-167 (2005).</li><li>Wilkinson, P. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+search+for+a+peripheral+biopsy+indicator+of+alpha-synuclein+pathology+for+Parkinson+Disease.">The search for a peripheral biopsy indicator of alpha-synuclein pathology for Parkinson Disease.</a> Journal of Neuropathology &amp; Experimental Neurology. 76, 2-15 (2017).</li><li>Donadio, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+nerve+misfolded+alpha-synuclein+in+pure+autonomic+failure+and+Parkinson+disease.">Skin nerve misfolded alpha-synuclein in pure autonomic failure and Parkinson disease.</a> Annals of Neurology. 79, 306-316 (2016).</li><li>Doppler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutaneous+neuropathy+in+Parkinson's+disease:+a+window+into+brain+pathology.">Cutaneous neuropathy in Parkinson's disease: a window into brain pathology.</a> Acta Neuropathologica. 128, 99-109 (2014).</li><li>Zange, L., Noack, C., Hahn, K., Stenzel, W., Lipp, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylated+alpha-synuclein+in+skin+nerve+fibres+differentiates+Parkinson's+disease+from+multiple+system+atrophy.">Phosphorylated alpha-synuclein in skin nerve fibres differentiates Parkinson's disease from multiple system atrophy.</a> Brain. 138, 2310-2321 (2015).</li><li>Braak, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staging+of+brain+pathology+related+to+sporadic+Parkinson's+disease.">Staging of brain pathology related to sporadic Parkinson's disease.</a> Neurobiology of Aging. 24, 197-211 (2003).</li><li>Doppler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dermal+phospho-alpha-synuclein+deposits+confirm+REM+sleep+behaviour+disorder+as+prodromal+Parkinson's+disease.">Dermal phospho-alpha-synuclein deposits confirm REM sleep behaviour disorder as prodromal Parkinson's disease.</a> Acta Neuropathologica. 133 (4), 535-545 (2017).</li><li>Antelmi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+nerve+phosphorylated+&#945;-synuclein+deposits+in+idiopathic+REM+sleep+behavior+disorder.">Skin nerve phosphorylated &#945;-synuclein deposits in idiopathic REM sleep behavior disorder.</a> Neurology. 88 (22), 2128-2131 (2017).</li><li>Nolano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+fiber+pathology+parallels+disease+progression+in+Parkinson+disease:+a+longitudinal+study.">Small fiber pathology parallels disease progression in Parkinson disease: a longitudinal study.</a> Acta Neuropathologica. , (2018).</li><li>Melli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cervical+skin+denervation+associates+with+alpha-synuclein+aggregates+in+Parkinson+disease.">Cervical skin denervation associates with alpha-synuclein aggregates in Parkinson disease.</a> Annals of Clinical and Translational Neurology. 5, 1394-1407 (2018).</li><li>Kovacs, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+processing+of+disease-associated+alpha-synuclein+in+the+human+brain+suggests+prion-like+cell-to-cell+spread.">Intracellular processing of disease-associated alpha-synuclein in the human brain suggests prion-like cell-to-cell spread.</a> Neurobiology Disease. 69, 76-92 (2014).</li><li>Kovacs, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+antibody+with+high+reactivity+for+disease-associated+alpha-synuclein+reveals+extensive+brain+pathology.">An antibody with high reactivity for disease-associated alpha-synuclein reveals extensive brain pathology.</a> Acta Neuropathologica. 124, 37-50 (2012).</li></ol>

Wir beschreiben einen frei schwebenden Immunfluoreszenz-Assay für Hautbiopsien zur Diagnose von PD: Er nutzt die doppelte Immunfärbung mit Anti-PGP9.5-Antikörpern, einem panaxonalen Marker und Anti-5G4, einem konformationsspezifischen Antikörper, der die aggregierte Form erkennt. von Syn.
Die großen Vorteile der Hautbiopsie zu diagnostischen Zwecken bei PD und möglicherweise bei anderen Proteinkonformationsstörungen sind: 1) der direkte Zugang zu krankheitsanfälligem Nervengewebe durch...

Die Hautbiopsie hat als diagnostisches und forschungsmedizinisches Instrument im Bereich neurologischer Erkrankungen1eine große Bedeutung erlangt. Tatsächlich enthalten Epidermis und Dermis reichlich somatische sensorische Nervenfasern (myeliniert und unmyeliniert), nozizeptive freie Nervenenden, sensorische Rezeptoren und autonome Innervation von Schweißdrüsen, Gefäßen, Talgdrüsen und Muskelarrector Pilorum 2.
In der Mitte des 20. Jahrhunderts erlaubte das Setup für die Immunhistochemie von PGP9.5-Antikörpern den Nachweis einer umfangreichen Innervation der menschlichen Epidermis-Säugetierhaut3. PGP9.5 ist eine Carboxyl-Terminal-Hydrolase, die gleichmäßig entlang von Axonen des zentralen und peripheren Nervensystems (PNS) verteilt ist. Die Verfügbarkeit dieses Antikörpers ermöglichte es nicht nur, die Morphologie und Anatomie von PNS in der Haut zu klären, sondern auch die Untersuchung von damit verbundenen Krankheiten3,4. Die Hautbiopsie trug zur Definition einer neuen klinischen Einheit bei: der kleinen Faserneuropathie. Mehrere internationale Gruppen demonstrierten den Zusammenhang zwischen dem Verlust von intraepidermalen Nervenfasern und Symptomen/Zeichen einer kleinen Faserneuropathie5 durch Hautbiopsieanalyse und lieferten standardisierte Protokolle für die Nervenmorphometrie sowie normative Referenzwerte, die in der klinischen Praxis verwendet werden sollen6,7,8.
Kürzlich hat eine große Menge an Beweisen gezeigt, dass neurodegenerative Erkrankungen, gekennzeichnet durch falsch gefaltete Proteinansammlungen im zentralen Nervensystem, Multisystempathologiensind 9. In der Tat, PD ist gekennzeichnet durch die Syn-Akkumulation im dopaminergen Neuron von Substantia nigra, aber es wurde gezeigt, dass ,Syn und seine pathologische Form, phosphoryliertes Syn (P-Syn), auch in den peripheren Geweben nachgewiesen werden konnte. Magen-Darm-Schleimhaut10, Speicheldrüsen11, hautautonome Fasern um Schweißdrüsen und pilomotorische Muskeln12,13,14, zeigen Immunreaktivität zu pathogenen Formen von Syn, in nach Braak Hypothese, dass faszinierend postulieren, dass 'Syn Pathologie kann in PNS lange im Voraus beginnen, vor seiner Akkumulation im Gehirn15. Darüber hinaus wurde das Vorhandensein von p-Syn in Hautnerven von Patienten mit REM-Verhaltensstörungen nachgewiesen, die als prodromal PD16,17 gelten, so dass hautpathologische Syn als vielversprechende frühe periphere histopathologischen Marker der Synukenopathie.
Der Zusammenhang der kleinen Faserneuropathie in PD wurde bereits gezeigt und es wurde festgestellt, dass intraepidermale Nervenfasern Dichte reflektiert Krankheitsprogression18,19. Daher ist die Hautbiopsie ein nützliches Werkzeug für die Untersuchung der Neurodegeneration bei PD und für die Etablierung einer vor-mortem histopathologischen Diagnose der Krankheit. Tatsächlich hat die Hautbiopsie einen großen Vorteil, ein leicht zugängliches und minimalinvasives Verfahren zu sein, das die Analyse von Nervengewebe ermöglicht, das anfällig für die Pathologie ist. Schließlich ermöglicht die Möglichkeit, die Hautbiopsie im Zuge der Nachbeobachtung der gleichen Patienten zu wiederholen, die Untersuchung der Längskorrelation mit dem Fortschreiten der Erkrankung.
In unserem Labor, die Nutzung einer doppelten Immunfärbung mit PGP9.5 und dem konformen monoklonalen 5G4-Antikörper, der krankheitsspezifische Formen von Syn einschließlich kleiner Aggregate20,21, erkennt, konnten wir die Vorhandensein von Syn-Aggregaten in Hautnerven mit einer vielversprechenden hohen diagnostischen Effizienz19. Die Immunfluoreszenzanalyse der Hautbiopsie bei Konformationserkrankungen zeichnet sich als vielversprechende Quelle von Biomarkern aus, indem sowohl der Nachweis von Proteinaggregaten als auch das Maß der Neurodegeneration in vivo kombiniert werden. Im Folgenden veranschaulichen wir ein einfaches und vielseitiges Protokoll über den Umgang mit der Hautbiopsie und die Durchführung der frei schwebenden Immunfluoreszenzfärbung zum Nachweis von Syn-Aggregaten. Darüber hinaus kann dieses Protokoll angepasst werden, um jedes andere Protein von Interesse, das in Haut-PNS ausgedrückt wird, zu zielen.
Das folgende Studienprotokoll wurde verwendet, um den diagnostischen Nutzen der aggregierten Syn-Analyse in den PNS von PD durch Hautbiopsie19zu bewerten. Inklusionskriterien für PD waren: eine definitive klinische Diagnose nach den diagnostischen Kriterien der UK Brain Bank, die Krankheitsdauer von mindestens 3 Jahren, keine Familiengeschichte und keine größeren kognitiven Beeinträchtigungen oder großen dysautonomen Symptome in der Geschichte. Ausschlusskriterien waren bekannte Ursachen der Neuropathie (glykiertes Hämoglobin, Kreatinin, Vitamin B12, TSH, Serumimmunfixation, HIV, HCV, Syphilis und Borreliose). Jedes Subjekt wurde an drei anatomischen Stellen (Hals bei C8-Dermatomal, Oberschenkel 10 cm über dem Knie, Bein 10 cm über seitlichem Malleolus) seitlich mit 3 mm Durchmesser biopsien, was klinisch stärker betroffen war. Im Allgemeinen geht es im folgenden Protokoll um den Umgang mit der Hautbiopsie und die Durchführung der frei schwebenden Immunfluoreszenzfärbung und -analyse. Daher kann es angepasst und für den Nachweis anderer Proteine von Interesse im Hautgewebe verwendet werden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:964px;" width="964">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:264px;">5G4 (anti human &#945;Syneclein 5G4)</td>
			<td style="width:161px;">Analytik Jena Roboscreen</td>
			<td style="width:344px;">847-0102004001</td>
			<td style="width:195px;">Mouse monoclonal&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">AlexaFluor 488 Goat anti Rabbit IgG&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1971418</td>
			<td>2mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">AlexaFluor 594 Goat anti Mouse IgG&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1922849</td>
			<td>2mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Disodium hydrogen phosphate solution</td>
			<td>Merk Millipore</td>
			<td>106586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ethylene Glycol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>324558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Lysine monohydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L5626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Aldrich Chemistry</td>
			<td>441244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:264px;">PGP9.5</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab15503</td>
			<td>Rabbit polyclonal</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodium Dihydrogen Phosphate Monohydrate</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>106346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodium (meta)periodate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trizma Base</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tryton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Vectashield&#160;</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td>Mounting medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

targeting alpha synuclein aggregates in cutaneous peripheral nerve fibers by free-floating immunofluorescence assay

Bis heute steht für die meisten neurodegenerativen Erkrankungen nur eine postmortale histopathologische definitive Diagnose zur Verfügung. Bei der Parkinson-Krankheit (PD) beruht die Diagnose immer noch nur auf klinischen Anzeichen einer motorischen Beteiligung, die später im Krankheitsverlauf auftreten, wenn die meisten dopaminergen Neuronen bereits verloren sind. Daher besteht ein starker Bedarf an einem Biomarker, der Patienten zu Beginn der Krankheit oder mit dem Risiko, sie zu entwickeln, identifizieren kann. In den letzten Jahren hat sich die Hautbiopsie als ausgezeichnetes Forschungs- und Diagnoseinstrument für periphere Nervenkrankheiten wie kleine Faserneuropathie erwiesen. Interessanterweise, eine kleine Faser Neuropathie und Alpha-Synuclein (Syn) neuronale Ablagerungen wurden durch Hautbiopsie bei PD-Patienten gezeigt. Tatsächlich hat die Hautbiopsie den großen Vorteil, dass sie ein leicht zugängliches, minimalinvasives und schmerzloses Verfahren ist, das die Analyse von peripherem Nervengewebe ermöglicht, das anfällig für die Pathologie ist. Darüber hinaus ermöglicht die Möglichkeit, die Hautbiopsie im Zuge der Nachbeobachtung desselben Patienten zu wiederholen, die Untersuchung der Längskorrelation mit dem Krankheitsverlauf. Wir haben ein standardisiertes, zuverlässiges Protokoll eingerichtet, um das Vorhandensein von Syn-Aggregaten in den Hautnervenfasern des PD-Patienten zu untersuchen. Dieses Protokoll beinhaltet nur wenige kurze Fixierungsschritte, eine Kryotome-Sektion und dann eine frei schwebende Immunfluoreszenz-Doppelfärbung mit zwei spezifischen Antikörpern: Antiprotein-Genprodukt 9.5 (PGP9.5), um die hautförmigen Nervenfasern zu markieren, und Anti-5G4 zum Nachweis Syn-Aggregate. Es ist ein vielseitiges, empfindliches und einfach durchzuführendes Protokoll, das auch für andere Proteine angewendet werden kann, die für Hautnerven von Interesse sind. Die Fähigkeit, Syn-Aggregate zu markieren, ist ein weiterer Schritt nach vorn bei der Verwendung der Hautbiopsie als Werkzeug zur Etablierung einer vor-mortem histopathologischen Diagnose von PD.

Nach dem beschriebenen Verfahren (Abbildung 1) haben wir Syn-Aggregate, mit 5G4-Antikörpern gekennzeichnet, in dermalen Nervenfasziden festgestellt, die autonome Strukturen von PD-Patienten innervieren. Die Morphologie der Alpha-Synuclein-Ablagerungen erscheint als gepunktetes Signal entlang der Axone dermaler Nerven (Abbildung 2). In der Tat, ausnutzen dieses Protokoll bei 19 PD-Patienten und 17 Kontrollen in Hautbiopsien an drei anatomischen Stelle (Zervix, O...

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Targeting Alpha Synuclein Aggregates in Cutaneous Peripheral Nerve Fibers by Free-floating Immunofluorescence Assay

Hier stellen wir ein Protokoll für einen frei schwebenden indirekten Immunfluoreszenz-Assay auf Hautbiopsieabschnitten vor, das die Identifizierung von krankheitsspezifischen Konformationsvarianten von Alpha-Synuclein ermöglicht, die an der Parkinson-Krankheit und mehreren Proteinen der peripheren Nervensystems.

Targeting Alpha Synuclein Aggregates in Kutane periphere Nervenfasern durch frei schwebenden Immunfluoreszenz-Assay

To date, for most neurodegenerative diseases only a post-mortem histopathological definitive diagnosis is available. For Parkinson&#39;s disease (PD), the ...

Die Diagnose der Parkinson-Krankheit beruht immer noch auf klinischen Anzeichen einer motorischen Beteiligung, die später im Verlauf der Krankheit auftreten, wenn die meisten Neuronen der Substantia nigra bereits verloren sind. Dieses Protokoll ermöglicht die Analyse der dermalen Nerven durch Hautbiopsie, die einen potenziellen neuen Biomarker der Krankheit darstellt, in klinischen Studien zu verwenden. Die Hautbiopsie ist ein leicht zu beurteilendes, nicht-invasives Verfahren, das die Analyse von peripherem Nervengewebe ermöglicht, das anfällig für die Pathologie ist.Alpha-Synuclein-Aggregate Detektion durch Hautbiopsie kann für diagnostische Zwecke verwendet werden, möglicherweise in frühen Phasen, wenn mögliche Heilung am effektivsten ist. Nachbereitung der Hautbiopsien beim gleichen Patienten ermöglicht eine Zeit- und spezielle Kursanalyse der Verbreitung von Alpha-Synuclein-Aggregaten im menschlichen Hautnervensystem. Diese können Licht auf die Pathogenese von Krankheiten werfen.Bereiten Sie zum Starten dieses Verfahrens eine neue PLP-Fixierungslösung vor, wie in Tabelle 1 des Textprotokolls beschrieben. Unmittelbar nach dem Sammeln der Hautbiopsie, tauchen Sie sie in eine Röhre mit 10 Milliliter der fixativen Lösung. Über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren.Am nächsten Tag, in einer Dunstabzugshaube, entfernen Sie die PLP Fixativ sanft. In der gleichen Röhre, waschen Sie die Biopsie dreimal für jeweils fünf Minuten, mit fünf Milliliter 0,1 Molar Sorensen Lösung für jede Wäsche. Entsorgen Sie die Lösung des Sorensen, und fügen Sie fünf Milliliter Kryoprotektorlösung hinzu.Über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren. Am nächsten Tag die Biopsie bei vier Grad Celsius aufbewahren, wenn der Schnitt mit einem Kryotom innerhalb einer Woche durchgeführt werden soll. Stellen Sie zunächst das Kryotome auf minus 20 Grad Celsius ein.Nehmen Sie einen Kryomold und füllen Sie es mit Kryo-Einbettung Medium. Tauchen Sie die Biopsie mit einer Pinzette in das Kryo-Einbettungsmedium ein, wobei die Längsachse parallel zum Boden des Kryomolds verläuft. Fangen Sie die Probe mit flüssigem Stickstoff ein, um einen festen Würfel mit Kryo-Einbettungsmedium zu erhalten, das die Biopsie in der richtigen Ausrichtung enthält.Legen Sie die Probe in den Kryostat, und warten Sie 30 Minuten, damit sich die Biopsie akklimatisiert. Fixieren Sie dann die Probe auf dem Kryostat und schneiden Sie sie in 50-Mikrometer-Abschnitte. Mit einer kleinen Bürste die Kryo-Sektionen auf eine 96-Well-Platte mit 200 MikroliterFrostlösung in jedem Brunnen übertragen.Danach die Platte bei minus 20 Grad Celsius aufbewahren. Zu Beginn füllen Sie einige der Brunnen einer frischen 96-Well-Platte mit 100 Mikroliter Waschlösung. Übertragen Sie die zu analysierenden Abschnitte von der Lagerplatte auf die, die die Waschlösung enthält.Lassen Sie die Abschnitte in der Waschlösung für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Dann übertragen Sie jeden Abschnitt in einen leeren Brunnen mit der gleichen Waschlösung, und wiederholen Sie die Wäsche. Als nächstes fügen Sie die Waschlösung zu den Abschnitten hinzu und übertragen Sie sie in neue Brunnen mit 100 Mikroliter blockender Lösung.Bei Raumtemperatur mindestens 90 Minuten und maximal vier Stunden inkubieren. Verdünnen Sie die primären Antikörper, Anti-PGP9.5 und Anti-5G4, in der Arbeitslösung. Übertragen Sie die Abschnitte in neue Brunnen mit 100 Mikrolitern der Arbeitslösung der primären Antikörper und inkubieren Sie über Nacht bei Raumtemperatur.Am nächsten Tag die Abschnitte in Brunnen mit Waschlösung waschen, wie zuvor beschrieben. Verdünnen Sie die sekundären Antikörper, Goat Anti-Rabbit, um PGP9.5 zu erkennen, und Goat Anti-Maus, um 5G4 zu erkennen, in der Arbeitslösung. Übertragen Sie die gewaschenen Abschnitte in neue Brunnen mit 100 Mikrolitern der Arbeitslösung der Sekundärantikörper.Bedecken Sie die Platte mit Aluminiumfolie, um das Bleichen von Fluorophor konjugiert mit sekundären Antikörpern zu vermeiden, und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 90 Minuten. Danach die Abschnitte wie zuvor beschrieben zweimal in Waschlösung waschen. Übertragen Sie die gewaschenen Abschnitte für fünf Minuten bei Raumtemperatur in neue Brunnen mit 100 Mikroliter DAPI.Waschen Sie die Abschnitte zweimal in Waschlösung wie zuvor beschrieben. Montieren Sie dann die Abschnitte auf einem Dia in der richtigen Position, um Fehlfalten zu vermeiden. Fügen Sie dem Schlitten ein paar Tropfen Montagemedium hinzu und bedecken Sie den Abschnitt mit einem Deckbeleg.Lassen Sie die Rutschen über Nacht trocknen. Am nächsten Tag lagern Sie die Dias in einer entsprechenden Box bei vier Grad Celsius, um Lichteinwirkung zu vermeiden. Betrachten Sie die Abschnitte mit einem invertierten Fluoreszenzmikroskop oder einem konfokalen Mikroskop.Erfassen Sie die Bilder mit einer Kamera, die mit dem Mikroskop verbunden ist. Verwenden Sie dann ein Fluoreszenzmikroskop oder ein konfokales Mikroskop, um positive Signale in Abschnitten in Bezug auf räumliche Verteilung und Intensität des Signals zu analysieren, wie im Textprotokoll beschrieben. Nach der beschriebenen Methode werden Alpha-Synuclein-Aggregate, die mit 5G4-Antikörpern gekennzeichnet sind, in dermalen Nervenfasziden nachgewiesen, die autonome Strukturen von PD-Patienten innervieren.Die Morphologie der Alpha-Synuclein-Ablagerungen erscheint als gepunktetes Signal entlang der Axone derdermaler Nerven. Die repräsentative Anwendung dieses Protokolls bei 19 PD-Patienten und 17 Kontrollen in Hautbiopsien an drei anatomischen Stellen zeigt, dass 5G4 eine Empfindlichkeit von 81 % und eine Spezifität von 86 % im Vergleich zu gesunden Kontrollen hat. Phosphoryliertes Alphasynuclein hat eine Empfindlichkeit von 56% und eine Spezifität von 100%5G4 und phosphorylierte Alpha-Synuclein-positive Ablagerungen finden sich hauptsächlich um Schweißdrüsen, aber auch in Muskelarrector Pili, kleinen Gefäßen und subepidermalen und dermalen Plexus, aber nie in intraepidermalen Nervenfasern.Im Allgemeinen ist es innerhalb der Schweißdrüsen Lumen möglich, ein unspezifisches Signal zu beobachten, das als 5G4 oder phosphorylierte Alpha-Synuclein-Positivität fehlinterpretiert werden könnte. Diese Art von Signal ist gepunktet, sphärisch, und es ist höchstwahrscheinlich auf intraluminal autofluoreszierendes Material zurückzuführen, wie in technischen Kontrollen ohne primäre und sekundäre Antikörper gezeigt. Die Kolokalisierung mit PGP9.5, die die Nervenfasern markiert, die morphologisch fadenförmig und länglich sind, hilft, das richtige Signal zu identifizieren.Daher wird die Spezifität des 5G4-Signals durch eine doppelte Immunostainierung mit einem axonalen Marker stark erhöht. Eine genaue Fixierung der Biopsie ist notwendig, um eine hochwertige immunfluoreszierende Färbung zu erzeugen und die fluoreszierenden Signale zuverlässig zu interpretieren. Wenn das Fixativ nicht richtig vorbereitet ist, oder wenn eine Überfixierung aufgetreten ist, wird das Ergebnis eine hohe Autofluoreszenz sein, die das Signal von Nervenfasern maskiert, die die dermal-epidermale Kreuzung kreuzen, oder die hauptdermalen Strukturen innervierend verkörpern.Der wichtigste Schritt dieses Verfahrens ist die Gewebefixierung. Achten Sie auf den pH-Wert der PLP-Fixierlösung und den Zeitpunkt der Inkubation, um Autofluoreszenz und ein bestimmtes Signal zu vermeiden.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Oral Administration of Rotenone using a Gavage and Image Analysis of Alpha-synuclein Inclusions in the Enteric Nervous System

Die orale Verabreichung von Rotenon mit einem Gavage und Bildanalyse von Alpha-Synuclein Einschlüsse in den enterischen Nervensystem

In Parkinson's disease (PD) patients, the associated pathology follows a characteristic pattern involving inter alia the enteric nervous system (ENS) 1,2, ...

Forschung

Neurowissenschaften

Selective Tracing of Auditory Fibers in the Avian Embryonic Vestibulocochlear Nerve

Selektive Tracing von Auditory Fibers im Avian Embryonale vestibulocochlearis

The embryonic chick is a widely used model for the study of peripheral and central ganglion cell projections. In the auditory system, selective labeling ...

Transplantation of Olfactory Ensheathing Cells to Evaluate Functional Recovery after Peripheral Nerve Injury

Transplantation von olfaktorischen Zellen ensheathing zu Funktionswiederherstellung nach peripheren Nervenschäden Bewerten

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory ...

Sequential Extraction of Soluble and Insoluble Alpha-Synuclein from Parkinsonian Brains

Sequentielle Extraktion von löslichen und unlöslichen Alpha-Synuclein von Parkinson-Brains

Alpha-synuclein (&#945;-syn) protein is abundantly expressed mainly within neurons, and exists in a number of different forms - monomers, tetramers, ...

Bioluminescence Imaging of Neuroinflammation in Transgenic Mice After Peripheral Inoculation of Alpha-Synuclein Fibrils

Biolumineszenz-Bildgebung von Neuroinflammation in transgenen Mäusen nach peripherer Inokulation von Alpha-Synuclein

To study the prion-like behavior of misfolded alpha-synuclein, mouse models are needed that allow fast and simple transmission of alpha-synuclein ...

Identification of Dopamine D1-Alpha Receptor Within Rodent Nucleus Accumbens by an Innovative RNA In Situ Detection Technology

Identification of Dopamine D1-Alpha Receptor Within Rodent Nucleus Accumbens by an Innovative RNA In Situ Detection Technology

Identifizierung von Dopamin-D1-Alpha-Rezeptor im Nagetier Nucleus Accumbens durch eine Innovative RNA- In Situ -Detection-Technologie

In the central nervous system, the D1-alpha subtype receptor (Drd1&#945;) is the most abundant dopamine (DA) receptor, which plays a vital role in ...

Exogenous Administration of Microsomes-associated Alpha-synuclein Aggregates to Primary Neurons As a Powerful Cell Model of Fibrils Formation

Exogene Verabreichung von Alpha-Synuclein Microsomen verbundenen Aggregate zur primären Neuronen als eine mächtige Zellmodell der Fibrillen Bildung

For years, the inability of replicating formation of insoluble alpha-synuclein (&#945;S) inclusions in cell cultures has been a great limitation in the ...

Generation of Alpha-Synuclein Preformed Fibrils from Monomers and Use In Vivo

Generation von Alpha-Synuclein vorgeformten Fibrillen aus Monomers und Einsatz In Vivo

Use of the in vivo alpha-synuclein preformed fibril (&#945;-syn PFF) model of synucleinopathy is gaining popularity among researchers aiming to model ...

Short-Term Free-Floating Slice Cultures from the Adult Human Brain

Kurzfristig frei schwebende Scheibenkulturen aus dem erwachsenen menschlichen Gehirn

Organotypic, or slice cultures, have been widely employed to model aspects of the central nervous system functioning in vitro. Despite the potential of ...

Assessing Early Stage Open-Angle Glaucoma in Patients by Isolated-Check Visual Evoked Potential

Beurteilung des Frühstadiums des Offenen Winkelglaukoms bei Patienten durch isoliertes visuelles Evokiertes Potenzial

Recently, the isolated-check visual evoked potential (icVEP) technique was designed and has been reported to detect glaucomatous damage earlier and ...