Name: targeting alpha synuclein aggregates in cutaneous peripheral nerve fibers by free-floating immunofluorescence assay
Uploaded: 2019-06-25T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Targeting Alpha Synuclein Aggregates in Cutaneous Peripheral Nerve Fibers by Free-floating Immunofluorescence Assay at JoVE.com

אנו מודים לפרקינסון שוויץ ו ABREOC (המועצה המייעצת של המחקר המדעי של ה-"אנטה Ospedaliero)" על תמיכתם הכספית של מחקר זה.

הפרוטוקול אושר על ידי ועדת האתיקה של הקנטראל וכל הנושאים הרשומים העניקו הסכמה מושכלת למחקר.
1. העור אוסף ביופסיה
<ol><li>תן רופא מוסמך לבצע את ביופסיה העור בסביבה קלינית מתאימה.</li>
	<li>בחר את האזור כדי לבצע את ביופסיה העור ולנקות אותו עם ספוגית אלכוהול.</li>
	<li>הכינו את פתרון ההרדמ...

<ol>
	<li>McArthur, J. C., Griffin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Another+Tool+for+the+neurologist's+Tollbox.">Another Tool for the neurologist's Tollbox.</a> Annals of Neurology. 57, 163-167 (2005).</li><li>Wilkinson, P. F., Millington, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Skin. , 49-50 (2009).</li><li>Weddell, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+endings+in+mammalian+skin.">Nerve endings in mammalian skin.</a> Biological reviews of the Cambridge Philosophical Society. 30, 159-195 (1954).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+gene+product+9.5-immunoreactve+nerve+fibers+and+cells+in+human+skin.">Protein gene product 9.5-immunoreactve nerve fibers and cells in human skin.</a> Cell and Tissue Research. 261 (1), 25-33 (1990).</li><li>Holland, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraepidermal+nerve+fiber+density+in+patients+with+painful+sensory+neuropathy.">Intraepidermal nerve fiber density in patients with painful sensory neuropathy.</a> Neurology. 48, 708-711 (1997).</li><li>McArthur, J. C., Stocks, E. A., Hauer, P., Cornblath, D. R., Griffin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+nerve+fiber+density:+normative+reference+range+and+diagnostic+efficiency.">Epidermal nerve fiber density: normative reference range and diagnostic efficiency.</a> Archives of Neurology. 55 (12), 1513-1520 (1998).</li><li>Lauria, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=European+Federation+of+Neurological+Societies/Peripheral+Nerve+Society+Guideline+on+the+use+of+skin+biopsy+in+the+diagnosis+of+small+fiber+neuropathy.+Report+of+a+joint+task+force+of+the+European+Federation+of+Neurological+Societies+and+the+Peripheral+Nerve+Society.">European Federation of Neurological Societies/Peripheral Nerve Society Guideline on the use of skin biopsy in the diagnosis of small fiber neuropathy. Report of a joint task force of the European Federation of Neurological Societies and the Peripheral Nerve Society.</a> European Journal of Neurology. 17, 903-912 (2010).</li><li>Provitera, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multi-center,+multinational+age-+and+gender-adjusted+normative+dataset+for+immunofluorescent+intraepidermal+nerve+fiber+density+at+the+distal+leg.">A multi-center, multinational age- and gender-adjusted normative dataset for immunofluorescent intraepidermal nerve fiber density at the distal leg.</a> European Journal of Neurology. 23, 333-338 (2016).</li><li>Wakabayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+the+peripheral+nervous+system+in+synucleinopathies,+tauopathies+and+other+neurodegenerative+proteinopathies+of+the+brain.">Involvement of the peripheral nervous system in synucleinopathies, tauopathies and other neurodegenerative proteinopathies of the brain.</a> Acta Neuropathology. 120, 1-12 (2010).</li><li>Ruffmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+alpha-synuclein+conformational+variants+from+gastro-intestinal+biopsy+tissue+as+a+potential+biomarker+for+Parkinson's+disease.">Detection of alpha-synuclein conformational variants from gastro-intestinal biopsy tissue as a potential biomarker for Parkinson's disease.</a> Neuropathology and Applied Neurobiology. 44 (7), 722-736 (2018).</li><li>Lee, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+search+for+a+peripheral+biopsy+indicator+of+alpha-synuclein+pathology+for+Parkinson+Disease.">The search for a peripheral biopsy indicator of alpha-synuclein pathology for Parkinson Disease.</a> Journal of Neuropathology &amp; Experimental Neurology. 76, 2-15 (2017).</li><li>Donadio, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+nerve+misfolded+alpha-synuclein+in+pure+autonomic+failure+and+Parkinson+disease.">Skin nerve misfolded alpha-synuclein in pure autonomic failure and Parkinson disease.</a> Annals of Neurology. 79, 306-316 (2016).</li><li>Doppler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutaneous+neuropathy+in+Parkinson's+disease:+a+window+into+brain+pathology.">Cutaneous neuropathy in Parkinson's disease: a window into brain pathology.</a> Acta Neuropathologica. 128, 99-109 (2014).</li><li>Zange, L., Noack, C., Hahn, K., Stenzel, W., Lipp, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylated+alpha-synuclein+in+skin+nerve+fibres+differentiates+Parkinson's+disease+from+multiple+system+atrophy.">Phosphorylated alpha-synuclein in skin nerve fibres differentiates Parkinson's disease from multiple system atrophy.</a> Brain. 138, 2310-2321 (2015).</li><li>Braak, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staging+of+brain+pathology+related+to+sporadic+Parkinson's+disease.">Staging of brain pathology related to sporadic Parkinson's disease.</a> Neurobiology of Aging. 24, 197-211 (2003).</li><li>Doppler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dermal+phospho-alpha-synuclein+deposits+confirm+REM+sleep+behaviour+disorder+as+prodromal+Parkinson's+disease.">Dermal phospho-alpha-synuclein deposits confirm REM sleep behaviour disorder as prodromal Parkinson's disease.</a> Acta Neuropathologica. 133 (4), 535-545 (2017).</li><li>Antelmi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+nerve+phosphorylated+&#945;-synuclein+deposits+in+idiopathic+REM+sleep+behavior+disorder.">Skin nerve phosphorylated &#945;-synuclein deposits in idiopathic REM sleep behavior disorder.</a> Neurology. 88 (22), 2128-2131 (2017).</li><li>Nolano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+fiber+pathology+parallels+disease+progression+in+Parkinson+disease:+a+longitudinal+study.">Small fiber pathology parallels disease progression in Parkinson disease: a longitudinal study.</a> Acta Neuropathologica. , (2018).</li><li>Melli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cervical+skin+denervation+associates+with+alpha-synuclein+aggregates+in+Parkinson+disease.">Cervical skin denervation associates with alpha-synuclein aggregates in Parkinson disease.</a> Annals of Clinical and Translational Neurology. 5, 1394-1407 (2018).</li><li>Kovacs, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+processing+of+disease-associated+alpha-synuclein+in+the+human+brain+suggests+prion-like+cell-to-cell+spread.">Intracellular processing of disease-associated alpha-synuclein in the human brain suggests prion-like cell-to-cell spread.</a> Neurobiology Disease. 69, 76-92 (2014).</li><li>Kovacs, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+antibody+with+high+reactivity+for+disease-associated+alpha-synuclein+reveals+extensive+brain+pathology.">An antibody with high reactivity for disease-associated alpha-synuclein reveals extensive brain pathology.</a> Acta Neuropathologica. 124, 37-50 (2012).</li></ol>

אנו מתארים את שיטת הimmunofluorescence צף חינם עבור ביופסיות עור לאבחון של PD: הוא מנצל את החיסוני כפול עם אנטי PGP הנוגדן 9.5, סמן panaxonal, ו-anti-5G4, נוגדן מסוים מזהה הטופס הצבור של αSyn.
היתרונות הגדולים של ביופסיה של העור למטרת אבחון ב PD ואולי בהפרעות אחרות חלבון הפרעות מסוימות הם: 1) גישה ישיר?...

ביופסיה העור רכשה חשיבות רבה כמו כלי אבחון ומחקר בתחום של הפרעות נוירולוגיות1. אכן, אפידרמיס ו דרמיס מכילים שופע סיבי העצב החושי החושים (מיאלואידית ובלתי מיאלואידית), nociceptive קצוות עצביים חינם, קולטני חישה ואינבציה אוטונומי של בלוטות הזיעה, כלי, בלוטות החלב ושרירים הרקטור השרירום 2. שתיים.
באמצע המאה ה -20, ההתקנה עבור אימונוהיסטוכימיה של הנוגדן pgp 9.5 מותר הראיות של שימור נרחב של העור באפידרמיס האדם3. Pgp 9.5 הוא carboxyl-טרמינל הידרוקלז מופץ באופן שווה לאורך אקסונים של מערכת העצבים המרכזית וההיקפית (היקפית). הזמינות של הנוגדן הזה מותר לא רק כדי להבהיר את המבנה ואת האנטומיה של היקפית בעור אלא גם יישמה את המחקר של מחלות הקשורות בו3,4. ביופסיה של העור תרמו להגדרת ישות קלינית חדשה: נוירופתיה סיבים קטנים. קבוצות בינלאומיות מספר הפגינו את הקשר בין אובדן סיבי העצב התוך באפידרמיס ותסמינים/סימנים של נוירופתיה סיבים קטנים5 על ידי ניתוח ביופסיה העור סיפק פרוטוקולים סטנדרטיים עבור ממורמטריה עצבים, כמו גם ערכי התייחסות נורמטיבית לשימוש בפרקטיקה הקלינית6,7,8.
לאחרונה כמות גדולה של ראיות הראו כי מחלות ניווניות, המאופיינת על ידי חלבון מקופל צטברויות במערכת העצבים המרכזית, הם הפתווגיות מולטי מערכת9. אכן, PD מאופיין על ידי הצטברות αSyn בתוך תא העצב הדואמנרגיים של החומר, אבל זה הוכח כי αSyn וצורתו הפתולוגית, αSyn זרחתי (P-αSyn), ניתן להבחין גם ברקמות ההיקפית. רירית העיכול10, בלוטות הרוק11, סיבי העור האוטונומית סביב בלוטות הזיעה והשרירים הפילגניים12,13,14, להראות פעילות immunoreactivity צורות של מערכת החיסונית של, ב בהתאם להשערה Braak כי שליט אקסיומת כי αSyn פתולוגיה עשויה להתחיל ב היקפית גם מראש, לפני הצטברות שלה במוח15. עוד, הנוכחות של p-αSyn כבר הפגינו עצבי העור של חולים עם הפרעות התנהגות REM שנחשבים משטרת prodromal16,17 ובכך העור הפתולוגי αSyn יכול להיחשב היקפי מבטיח מוקדם סימן ההיסטואוולוגי של הסיננופתיה.
האגודה של נוירופתיה סיבים קטנים במשטרה כבר הפגינו בעבר וזה נמצא כי צפיפות סיבים עצביים באפידרמיס משקף התקדמות המחלה18,19. מכאן, ביופסיה של העור הוא כלי שימושי עבור לימוד נוירוניוון ב PD ולהקמת אבחון histopathological לפני המוות של המחלה. אכן, ביופסיה של העור יש יתרון גדול של להיות הליך נגיש בקלות מינימלית פולשנית, המאפשר ניתוח של רקמת העצבים נוטה הפתולוגיה. לבסוף, האפשרות לחזור על ביופסיה בעור במהלך המעקב של חולים אותו מאפשר ללמוד את הקורלציה האורך עם התקדמות המחלה.
במעבדה שלנו, ניצול דלקת חיסונית כפולה עם pgp 9.5 ואת הקונפורמציה-הנוגדן 5g4 ספציפי, כי מזהה צורות ספציפיות של המחלה של αSyn כולל אגרגטים קטנים20,21, הצלחנו להראות את ה נוכחות של אגרגטים αSyn בעצבי העור עם יעילות מבטיחה אבחון גבוה19. Immunofluorescence ניתוח של ביופסיה של העור מחלות קונפורניות בולטת כמו מקור מבטיח של סמנים באמצעות שילוב הן זיהוי של אגרגטים חלבונים ואת המדד של נוירוניוון ב vivo. להלן, אנו ממחישים פרוטוקול קל וצדדי על הטיפול ביופסיה העור וביצוע ללא תשלום הimmunofluorescence כתמים עבור זיהוי אגרגטים. יתר על כן, פרוטוקול זה יכול להיות מותאם למיקוד כל חלבון אחר של ריבית המתבטאת בעור היקפית.
פרוטוקול המחקר שלהלן נעשה שימוש כדי להעריך את כלי האבחון של ניתוח αSyn צבור בהיקפית של PD על ידי העור ביופסיה19. קריטריוני הכללה עבור המשטרה היו: אבחנה קלינית מובהק על פי הקריטריונים האבחון של בנק המוח בבריטניה, משך המחלה לפחות 3 שנים, אין היסטוריה משפחתית, ואין ליקוי קוגניטיבית גדול או סימפטומים dysautonomic הגדולות בהיסטוריה. קריטריוני הדרה היו ידועים סיבות נוירופתיה (המוגלובין מסוכרר, קריאטינין, ויטמין B12, TSH, החיסוני סרום, HIV, מימן, עגבת, ו borreliosis). כל אחד מהנושאים עבר ל -3 ביופסיות עור בקוטר 3 מ"מ בשלושה אתרים אנטומיים (צוואר ברמה C8 דרמטאלית, ירכיים 10 ס מ מעל הברך, רגל 10 ס"מ מעל קרסולית לרוחב) בצד, אשר הושפע קלינית יותר. באופן כללי, הפרוטוקול הבא הוא על טיפול ביופסיה של העור וביצוע של כתמים וניתוח החיסונית הצפה בחינם. לכן זה יכול להיות מותאם ומשמש לאיתור חלבונים אחרים של עניין רקמת העור.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:964px;" width="964">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:264px;">5G4 (anti human &#945;Syneclein 5G4)</td>
			<td style="width:161px;">Analytik Jena Roboscreen</td>
			<td style="width:344px;">847-0102004001</td>
			<td style="width:195px;">Mouse monoclonal&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">AlexaFluor 488 Goat anti Rabbit IgG&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1971418</td>
			<td>2mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">AlexaFluor 594 Goat anti Mouse IgG&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1922849</td>
			<td>2mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Disodium hydrogen phosphate solution</td>
			<td>Merk Millipore</td>
			<td>106586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ethylene Glycol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>324558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Lysine monohydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L5626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Aldrich Chemistry</td>
			<td>441244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:264px;">PGP9.5</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab15503</td>
			<td>Rabbit polyclonal</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodium Dihydrogen Phosphate Monohydrate</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>106346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodium (meta)periodate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trizma Base</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tryton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Vectashield&#160;</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td>Mounting medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

targeting alpha synuclein aggregates in cutaneous peripheral nerve fibers by free-floating immunofluorescence assay

עד היום, עבור רוב מחלות ניווניות רק האבחון הסופי לאחר המוות histopathological זמין. עבור מחלת פרקינסון (PD), האבחון עדיין מסתמך רק על סימנים קליניים של מעורבות מוטורית המופיעים מאוחר יותר בקורס המחלה, כאשר רוב הנוירונים הדוגיים האלה כבר אבדו. מכאן, יש צורך חזק בסמנים שיכולים לזהות חולים בתחילת המחלה או בסיכון לפתח אותו. במהלך השנים האחרונות, ביופסיה העור הוכיחה להיות כלי מחקר מעולה ואבחון עבור מחלות עצבים היקפיים כגון נוירופתיה סיבים קטנים. מעניין, נוירופתיה סיבים קטנים ומערכת האלפא synuclein (αSyn) הפקדות עצביות הוכחו על ידי ביופסיה בעור חולי PD. אכן, ביופסיה העור יש את היתרון הגדול של להיות נגיש בקלות, פולשני מינימלית הליך כאבים המאפשר ניתוח של רקמת העצבים ההיקפית נוטה הפתולוגיה. יתר על כן, האפשרות של חזרה על ביופסיה של העור במהלך המעקב של החולה אותו מאפשר ללמוד את הקשר האורך עם התקדמות המחלה. הגדרת פרוטוקול אמין מתוקננת כדי לחקור את הנוכחות של אגרגטים αSyn בסיבי עצב העור של החולה PD. פרוטוקול זה כולל כמה שלבים הקיבעון קצר, הפסקה קריוטום ולאחר מכן בחינם צף הimmunofluorescence כפולה עם שני נוגדנים ספציפיים: אנטי חלבון מוצר גנטי 9.5 (PGP 9.5) כדי לסמן את סיבי העצב עורית ו 5G4 לגילוי . אגרגטים αSyn זהו מגוון, רגיש וקל לבצע פרוטוקול שניתן גם להחיל על המיקוד חלבונים אחרים של עניין עצבי העור. היכולת לסמן אגרגטים αSyn הוא צעד נוסף קדימה לשימוש ביופסיה של העור ככלי להקמת אבחנה טרום לנתיחה לפני המוות של PD.

בעקבות ההליך המתואר (איור 1), גילינו אגרגטים αSyn, המסומנים עם נוגדן 5G4, במבנה עצבי העורי innervating מבנים אוטונומית של חולי PD. מורפולוגיה של הפיקדונות אלפא-synuclein מופיע כאות מנוקד לאורך האקטונים של עצבי העורי (איור 2). אכן, ניצול פרוטוקול זה 19 חולים PD ו -17 שולטת ביופסי?...

Watch this Scientific Journal Video about Targeting Alpha Synuclein Aggregates in Cutaneous Peripheral Nerve Fibers by Free-floating Immunofluorescence Assay at JoVE.com

Targeting Alpha Synuclein Aggregates in Cutaneous Peripheral Nerve Fibers by Free-floating Immunofluorescence Assay

כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור מערכת ביופסיה בחינם צף של העור על מקטעים לביופסיה של מעטפת המאפשרת זיהוי של מחלות היווצרות המחלה מסוים של מחלת אלפא מעורב במחלת פרקינסון מספר חלבונים של מערכת העצבים ההיקפית

מיקוד אלפא Synuclein אגרגטים בתוך עורית היקפיים סיבים עצביים על ידי Free-צפה אימונוofלואונסנציה החופשית

To date, for most neurodegenerative diseases only a post-mortem histopathological definitive diagnosis is available. For Parkinson&#39;s disease (PD), the ...

האבחנה של מחלת פרקינסון עדיין מסתמכת על סימנים קליניים של מעורבות מוטורית המופיעים מאוחר יותר במהלך המחלה, כאשר רוב הנוירונים של הסובסטנציה ניגרה כבר הולכים לאיבוד. פרוטוקול זה מאפשר ניתוח עצבים עוריים על ידי ביופסיה העור, המייצג סמן ביולוגי חדש פוטנציאלי של המחלה, לשמש בניסויים קליניים. ביופסיה של העור היא הליך לא פולשני שניתן להעריך בקלות המאפשר ניתוח של רקמת עצבים היקפית הנוטה לפתולוגיה.אלפא סינוקליין אגרגטים זיהוי על ידי ביופסיה העור יכול לשמש למטרות אבחון, אולי בשלבים מוקדמים, כאשר תרופה פוטנציאלית היא היעילה ביותר. ביופסיות עור מעקב באותו חולה לאפשר ניתוח זמן קורס מיוחד של אלפא סינוקליין צבירה מתפשטת במערכת העצבים העורית האנושית. אלה יכולים לשפוך אור על הפתוגנזה של המחלה.כדי להתחיל בהליך זה, הכן פתרון תיקון PLP חדש כמפורט בטבלה אחת של פרוטוקול הטקסט. מיד לאחר איסוף ביופסיה של העור, להטביע אותו בצינור המכיל 10 מיליליטר של הפתרון התיקון. דגירה לילה בארבע מעלות צלזיוס.למחרת, במכסה המנוע אדים, להסיר את התיקון PLP בעדינות. באותו צינור, לשטוף את הביופסיה שלוש פעמים במשך חמש דקות כל אחד, באמצעות חמישה מיליליטר של 0.1 פתרון טוחן של סורנסן עבור כל לשטוף. השלך את הפתרון של סורנסן, והוסף חמישה מיליליטר של פתרון קריופרוטקטנט.דגירה לילה בארבע מעלות צלזיוס. למחרת, לאחסן את הביופסיה בארבע מעלות צלזיוס אם החתך עם קריוטום יבוצע בתוך שבוע. ראשית, להגדיר את הקריוטום למינוס 20 מעלות צלזיוס.קח קריומאולד ומלא אותו במדיום להטמיע קריו. באמצעות פינצטה, לטבול את הביופסיה לתוך המדיום ההטבעה קריו, עם ציר האורך מקביל לתחתית cryomold. הצמד להקפיא את המדגם עם חנקן נוזלי, כדי לקבל קוביה מוצקה של מדיום cryo-הטבעה המכיל את הביופסיה בכיוון הנכון.שים את הדגימה בהקפאטט, ולחכות 30 דקות כדי לאפשר את הביופסיה להתאקלם. לאחר מכן, לתקן את המדגם על קריוסטט לחתוך לקטעים 50 מיקרומטר. בעזרת מברשת קטנה, מעבירים את קטעי ההקפאה לצלחת של 96 בארות המכילה 200 מיקרוליטרים של תותב נגד קפריש בכל באר.לאחר מכן, לאחסן את הצלחת במינוס 20 מעלות צלזיוס. ראשית, מלאו חלק מה בארות של צלחת טרייה של 96 בארות עם 100 מיקרוליטרים של פתרון כביסה. מעבירים את החלקים לניתוח מצלחת האחסון לזה המכיל את פתרון הכביסה.השאירו את החלקים בתסרון הכביסה למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, מעבירים כל קטע לתוך באר ריקה המכילה את אותו פתרון כביסה, וחוזרים על הכביסה. לאחר מכן, להוסיף פתרון כביסה לחלקים, ולהעביר אותם לתוך בארות חדשות המכילות 100 microliters של פתרון חסימה.דגירה בטמפרטורת החדר לפחות 90 דקות, ומקסימום של ארבע שעות. לדלל את הנוגדנים העיקריים, אנטי PGP9.5 ואנטי 5G4, בפתרון העבודה. מעבירים את החלקים לתוך בארות חדשות המכילות 100 מיקרוליטרים של פתרון העבודה של הנוגדנים העיקריים, ו דגירה לילה בטמפרטורת החדר.למחרת, לשטוף את החלקים בארות המכיל פתרון כביסה כפי שתואר קודם לכן. לדלל את הנוגדנים המשניים, עז אנטי ארנב כדי לזהות PGP9.5, ו עז נגד עכבר כדי לזהות 5G4, בתת פתרון העבודה. מעבירים את החלקים השטופים לתוך בארות חדשות המכילות 100 מיקרוליטרים של פתרון העבודה של הנוגדנים המשניים.מכסים את הצלחת בנייר אלומיניום כדי למנוע הלבנה של פלואורופור גדומה בנוגדנים משניים, ודורגים בטמפרטורת החדר במשך 90 דקות. לאחר מכן, לשטוף את החלקים פעמיים בתסת פתרון כביסה כפי שתואר קודם לכן. מעבירים את החלקים השטופים לתוך בארות חדשות המכילות 100 מיקרוליטרים של DAPI למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.לשטוף את החלקים פעמיים בתסת פתרון כביסה כפי שתואר קודם לכן. לאחר מכן, תקן את המקטעים בשקופית במיקום הנכון, תוך הימנעות מתיקיות שגויות. הוסף כמה טיפות של מדיום הרכבה לשקופית וכסה את המקטע עם פתק כיסוי.תן לשקופיות להתייבש בן לילה. למחרת, לאחסן את השקופיות בתיבה מתאימה בארבע מעלות צלזיוס, הקפד להימנע מחשיפה לאור. באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך או מיקרוסקופ קונפוקל, הצג את החלקים.רכוש את התמונות באמצעות מצלמה המחוברת למיקרוסקופ. לאחר מכן, השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי או במיקרוסקופ קונפוקל כדי לנתח אותות חיוביים בחלקים במונחים של התפלגות מרחבית ועוצמת האות כמתואר בפרוטוקול הטקסט. בעקבות השיטה המתוארת, אגרגטים אלפא סינוקליין שכותרתו עם נוגדן 5G4 מזוהים fascicles עצב עורי innervating מבנים אוטונומיים של חולי PD.המורפולוגיה של מרבצי אלפא סינוקליין מופיעה כאות מנוקד לאורך האקסונים של עצבים עוריים. שימוש ייצוגי בפרוטוקול זה ב-19 חולי PD ו-17 פקדים בביופסיות עור בשלושה אתרים אנטומיים מראה כי ל-5G4 יש רגישות של 81% וספדיות של 86% בהשוואה לפקדים בריאים. Phosphorylated אלפא synuclein יש רגישות של 56%, ספציפיות של 100%5G4 ו זרחן אלפא סינוקלאין חיובי פיקדונות נמצאים בעיקר סביב בלוטות זיעה, אבל נמצאים גם פיילי שריר, כלי קטן, ופלקסוס subepidermal ו עורי, אבל אף פעם לא בסיבי עצב תוך ירך.בדרך כלל, בתוך לומן בלוטות הזיעה, ניתן לצפות אות לא ספציפי שיכול להיות מתפרש לא נכון כמו 5G4 או זרחן אלפא סינוקליין חיובי. סוג זה של אות מנוקד, כדורי, והוא נובע ככל הנראה מחומר autofluorescent תוך-אלומיניום כפי שהוכח בפקדים טכניים ללא נוגדנים ראשוניים ומשניים. קולוקליזציה עם PGP9.5 שמסמן את סיבי העצב, אשר מורפולוגית הם filamentous ומוארך, מסייע לזהות את האות הנכון.לכן, הספציפיות של אות 5G4 גדלה מאוד על ידי כשל חיסוני כפול עם סמן אקסונאלי. קיבעון מדויק של הביופסיה נחוץ לייצור כתם immunofluorescent באיכות טובה ולפרשנות אמינה של אותות פלואורסצנטיים. אם התיקון אינו מוכן כראוי, או אם התרחשה קיבעון יתר, התוצאה תהיה שפעת אוטומטית גבוהה שתסוו את האות של סיבי עצב החוצים את צומת העור-אפידרמיס, או פנימיים את המבנים העוריים העיקריים.השלב הקריטי ביותר בהליך זה הוא קיבוע רקמות. שים לב ל- pH של פתרון תיקון PLP, ותזמון הדגירה, כדי למנוע שפעת אוטומטית ואות ספציפי.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Oral Administration of Rotenone using a Gavage and Image Analysis of Alpha-synuclein Inclusions in the Enteric Nervous System

אוראלית של Rotenone באמצעות Gavage וניתוח מקדימה של Alpha-synuclein תכלילים במערכת העצבים enteric

In Parkinson's disease (PD) patients, the associated pathology follows a characteristic pattern involving inter alia the enteric nervous system (ENS) 1,2, ...

Selective Tracing of Auditory Fibers in the Avian Embryonic Vestibulocochlear Nerve

איתור סלקטיבי של סיבי עצב שמיעה בVestibulocochlear העוברי העופות

The embryonic chick is a widely used model for the study of peripheral and central ganglion cell projections. In the auditory system, selective labeling ...

Transplantation of Olfactory Ensheathing Cells to Evaluate Functional Recovery after Peripheral Nerve Injury

השתלה של תאי ensheathing חוש ריח להערכת החלמה תפקודית לאחר פגיעה עצבית היקפית

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory ...

Sequential Extraction of Soluble and Insoluble Alpha-Synuclein from Parkinsonian Brains

הפקה רציפה של המסיס ובלתי מסיס אלפא-סינוקלאין ממוח פרקינסון

Alpha-synuclein (&#945;-syn) protein is abundantly expressed mainly within neurons, and exists in a number of different forms - monomers, tetramers, ...

Bioluminescence Imaging of Neuroinflammation in Transgenic Mice After Peripheral Inoculation of Alpha-Synuclein Fibrils

הדמית פליטת אור של neuroinflammation בעכברים טרנסגניים לאחר היקפיים הרכבה של אלפא-Synuclein סיבים

To study the prion-like behavior of misfolded alpha-synuclein, mouse models are needed that allow fast and simple transmission of alpha-synuclein ...

Identification of Dopamine D1-Alpha Receptor Within Rodent Nucleus Accumbens by an Innovative RNA In Situ Detection Technology

Identification of Dopamine D1-Alpha Receptor Within Rodent Nucleus Accumbens by an Innovative RNA In Situ Detection Technology

זיהוי של דופמין קולטן D1-אלפא בתוך מכרסמים גרעין האקומבנס על ידי טכנולוגיה חדשנית RNA בחיי עיר זיהוי

In the central nervous system, the D1-alpha subtype receptor (Drd1&#945;) is the most abundant dopamine (DA) receptor, which plays a vital role in ...

Exogenous Administration of Microsomes-associated Alpha-synuclein Aggregates to Primary Neurons As a Powerful Cell Model of Fibrils Formation

הממשל אקסוגני של אלפא-synuclein Microsomes-הקשורים אגרגטים כדי נוירונים העיקרי כמודל תא עוצמה היווצרות הסיבים

For years, the inability of replicating formation of insoluble alpha-synuclein (&#945;S) inclusions in cell cultures has been a great limitation in the ...

Generation of Alpha-Synuclein Preformed Fibrils from Monomers and Use In Vivo

דור של אלפא-סינונוקלאומין מראש בנוי ממונמרים והשימוש ב Vivo

Use of the in vivo alpha-synuclein preformed fibril (&#945;-syn PFF) model of synucleinopathy is gaining popularity among researchers aiming to model ...

Short-Term Free-Floating Slice Cultures from the Adult Human Brain

לטווח קצר-מתרבות פרוסה שצפה בחינם מהמוח האנושי המבוגר

Organotypic, or slice cultures, have been widely employed to model aspects of the central nervous system functioning in vitro. Despite the potential of ...

Assessing Early Stage Open-Angle Glaucoma in Patients by Isolated-Check Visual Evoked Potential

הערכת השלב המוקדם פתיחת גלאוקומה בחולים על ידי מבודדים-בדוק פוטנציאל ויזואלי מעורר

Recently, the isolated-check visual evoked potential (icVEP) technique was designed and has been reported to detect glaucomatous damage earlier and ...