Name: targeting alpha synuclein aggregates in cutaneous peripheral nerve fibers by free-floating immunofluorescence assay
Uploaded: 2019-06-25T13:30:00
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Ringraziamo Parkinson Schweiz e ABREOC (comitato consultivo per la ricerca scientifica dell'Enteo Cantonale) per il loro sostegno finanziario a questo studio.

Il protocollo è stato approvato dal Comitato Etico cantonale e tutti i soggetti arruolati hanno dato il consenso informato scritto allo studio.
1. Collezione di biopsia cutanea
<ol><li>Consentire a un medico qualificato di eseguire la biopsia cutanea in un ambiente clinico appropriato.</li>
	<li>Scegli l'area per eseguire la biopsia della pelle e pulirla con un tampone alcolico.</li>
	<li>Preparare la soluzione anestetica con 1 cc di lidocaine 2%.</li>
	<li>Con l'ago parallelo alla zona, in...

<ol>
	<li>McArthur, J. C., Griffin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Another+Tool+for+the+neurologist's+Tollbox.">Another Tool for the neurologist's Tollbox.</a> Annals of Neurology. 57, 163-167 (2005).</li><li>Wilkinson, P. F., Millington, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Skin. , 49-50 (2009).</li><li>Weddell, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+endings+in+mammalian+skin.">Nerve endings in mammalian skin.</a> Biological reviews of the Cambridge Philosophical Society. 30, 159-195 (1954).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+gene+product+9.5-immunoreactve+nerve+fibers+and+cells+in+human+skin.">Protein gene product 9.5-immunoreactve nerve fibers and cells in human skin.</a> Cell and Tissue Research. 261 (1), 25-33 (1990).</li><li>Holland, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraepidermal+nerve+fiber+density+in+patients+with+painful+sensory+neuropathy.">Intraepidermal nerve fiber density in patients with painful sensory neuropathy.</a> Neurology. 48, 708-711 (1997).</li><li>McArthur, J. C., Stocks, E. A., Hauer, P., Cornblath, D. R., Griffin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+nerve+fiber+density:+normative+reference+range+and+diagnostic+efficiency.">Epidermal nerve fiber density: normative reference range and diagnostic efficiency.</a> Archives of Neurology. 55 (12), 1513-1520 (1998).</li><li>Lauria, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=European+Federation+of+Neurological+Societies/Peripheral+Nerve+Society+Guideline+on+the+use+of+skin+biopsy+in+the+diagnosis+of+small+fiber+neuropathy.+Report+of+a+joint+task+force+of+the+European+Federation+of+Neurological+Societies+and+the+Peripheral+Nerve+Society.">European Federation of Neurological Societies/Peripheral Nerve Society Guideline on the use of skin biopsy in the diagnosis of small fiber neuropathy. Report of a joint task force of the European Federation of Neurological Societies and the Peripheral Nerve Society.</a> European Journal of Neurology. 17, 903-912 (2010).</li><li>Provitera, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multi-center,+multinational+age-+and+gender-adjusted+normative+dataset+for+immunofluorescent+intraepidermal+nerve+fiber+density+at+the+distal+leg.">A multi-center, multinational age- and gender-adjusted normative dataset for immunofluorescent intraepidermal nerve fiber density at the distal leg.</a> European Journal of Neurology. 23, 333-338 (2016).</li><li>Wakabayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+the+peripheral+nervous+system+in+synucleinopathies,+tauopathies+and+other+neurodegenerative+proteinopathies+of+the+brain.">Involvement of the peripheral nervous system in synucleinopathies, tauopathies and other neurodegenerative proteinopathies of the brain.</a> Acta Neuropathology. 120, 1-12 (2010).</li><li>Ruffmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+alpha-synuclein+conformational+variants+from+gastro-intestinal+biopsy+tissue+as+a+potential+biomarker+for+Parkinson's+disease.">Detection of alpha-synuclein conformational variants from gastro-intestinal biopsy tissue as a potential biomarker for Parkinson's disease.</a> Neuropathology and Applied Neurobiology. 44 (7), 722-736 (2018).</li><li>Lee, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+search+for+a+peripheral+biopsy+indicator+of+alpha-synuclein+pathology+for+Parkinson+Disease.">The search for a peripheral biopsy indicator of alpha-synuclein pathology for Parkinson Disease.</a> Journal of Neuropathology &amp; Experimental Neurology. 76, 2-15 (2017).</li><li>Donadio, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+nerve+misfolded+alpha-synuclein+in+pure+autonomic+failure+and+Parkinson+disease.">Skin nerve misfolded alpha-synuclein in pure autonomic failure and Parkinson disease.</a> Annals of Neurology. 79, 306-316 (2016).</li><li>Doppler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutaneous+neuropathy+in+Parkinson's+disease:+a+window+into+brain+pathology.">Cutaneous neuropathy in Parkinson's disease: a window into brain pathology.</a> Acta Neuropathologica. 128, 99-109 (2014).</li><li>Zange, L., Noack, C., Hahn, K., Stenzel, W., Lipp, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylated+alpha-synuclein+in+skin+nerve+fibres+differentiates+Parkinson's+disease+from+multiple+system+atrophy.">Phosphorylated alpha-synuclein in skin nerve fibres differentiates Parkinson's disease from multiple system atrophy.</a> Brain. 138, 2310-2321 (2015).</li><li>Braak, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staging+of+brain+pathology+related+to+sporadic+Parkinson's+disease.">Staging of brain pathology related to sporadic Parkinson's disease.</a> Neurobiology of Aging. 24, 197-211 (2003).</li><li>Doppler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dermal+phospho-alpha-synuclein+deposits+confirm+REM+sleep+behaviour+disorder+as+prodromal+Parkinson's+disease.">Dermal phospho-alpha-synuclein deposits confirm REM sleep behaviour disorder as prodromal Parkinson's disease.</a> Acta Neuropathologica. 133 (4), 535-545 (2017).</li><li>Antelmi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+nerve+phosphorylated+&#945;-synuclein+deposits+in+idiopathic+REM+sleep+behavior+disorder.">Skin nerve phosphorylated &#945;-synuclein deposits in idiopathic REM sleep behavior disorder.</a> Neurology. 88 (22), 2128-2131 (2017).</li><li>Nolano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+fiber+pathology+parallels+disease+progression+in+Parkinson+disease:+a+longitudinal+study.">Small fiber pathology parallels disease progression in Parkinson disease: a longitudinal study.</a> Acta Neuropathologica. , (2018).</li><li>Melli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cervical+skin+denervation+associates+with+alpha-synuclein+aggregates+in+Parkinson+disease.">Cervical skin denervation associates with alpha-synuclein aggregates in Parkinson disease.</a> Annals of Clinical and Translational Neurology. 5, 1394-1407 (2018).</li><li>Kovacs, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+processing+of+disease-associated+alpha-synuclein+in+the+human+brain+suggests+prion-like+cell-to-cell+spread.">Intracellular processing of disease-associated alpha-synuclein in the human brain suggests prion-like cell-to-cell spread.</a> Neurobiology Disease. 69, 76-92 (2014).</li><li>Kovacs, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+antibody+with+high+reactivity+for+disease-associated+alpha-synuclein+reveals+extensive+brain+pathology.">An antibody with high reactivity for disease-associated alpha-synuclein reveals extensive brain pathology.</a> Acta Neuropathologica. 124, 37-50 (2012).</li></ol>

Descriviamo un test di immunofluorescenza fluttuante per le biopsie cutanee per la diagnosi della PD: sfrutta la doppia immunostaining con anticorpi anti-PGP9.5, un marcatore panassonale e anti-5G4, un anticorpo specifico della conformazione che riconosce la forma aggregata di "Syn".
I grandi vantaggi della biopsia cutanea a scopo diagnostico nella PD e possibilmente in altri disturbi conformazionali proteici sono: 1) l'accesso diretto al tessuto nervoso incline alla malattia con una tecnica l...

La biopsia cutanea ha acquisito una grande importanza come strumento diagnostico e di ricerca nel campo dei disturbi neurologici1. Infatti, epidermide e dermide contengono abbondanti fibre nervose sensoriali somatiche (mielinate e non mitielinate), terminazioni nervose libere nocicettive, recettori sensoriali e innervazione autonoma di ghiandole sudoripare, vasi, ghiandole sebacee e muscolo arrectorilorum 2.
A metà del XX secolo, l'installazione per l'immunohistochimica dell'anticorpo PGP9.5 ha permesso l'evidenza di un'ampia innervazione della pelle di mammifero dell'epidermide umana3. PGP9.5 è un'idrolasi carboxyl-terminale equamente distribuita insieme agli assoni del sistema nervoso centrale e periferico (PNS). La disponibilità di questo anticorpo ha permesso non solo di chiarire la morfologia e l'anatomia del PNS nella pelle, ma ha anche implementato lo studio delle malattie ad esso associate3,4. La biopsia cutanea ha contribuito alla definizione di una nuova entità clinica: la piccola neuropatia delle fibre. Diversi gruppi internazionali hanno dimostrato l'associazione tra la perdita di fibre nervose intraepidermiche e sintomi/segni di nevropatia delle piccole fibre5 mediante l'analisi della biopsia cutanea e hanno fornito protocolli standardizzati per la morfometria nervosa e valori di riferimento normativi da utilizzare nella pratica clinica6,7,8.
Recentemente una grande quantità di prove ha dimostrato che le malattie neurodegenerative, caratterizzate da accumuli di proteine piegate in modo improprio nel sistema nervoso centrale, sono patologie multi-sistema9. Infatti, la PD è caratterizzata dall'accumulo di sinistre nel neurone dopaminergico di substantia nigra, ma è stato dimostrato che la Sindsyn e la sua forma patologica, il fosforilo, il sinsyn (P-Syn), potrebbe essere rilevata anche nei tessuti periferici. Musco-intestinalemucosa 10, ghiandole salivari11, fibre autonomiche della pelle che circondano le ghiandole sudoripare e muscoli pilomotori12,13,14, mostrano l'immunoreattività alle forme patogene di secondo l'ipotesi di Braak che intrigantemente postulare che la patologia di Syn può iniziare in PNS con largo anticipo, prima del suo accumulo nel cervello15. Inoltre, è stata dimostrata la presenza di p--Syn Syn nei nervi della pelle di pazienti con disturbi del comportamento REM che sono considerati prodromal PD16,17 quindi la pelle patologica -Syn può essere considerata una promettente periferica precoce marcatore istopatologico della sinucleinopatia.
L'associazione di piccola neuropatia in fibra nella PD è stata dimostrata in precedenza ed è stato trovato che la densità delle fibre nervose intraepidermiche riflette la progressione della malattia18,19. Quindi, la biopsia cutanea è uno strumento utile per studiare la neurodegenerazione nella PD e per stabilire una diagnosi istopatologica pre-mortem della malattia. Infatti, la biopsia cutanea ha un grande vantaggio di essere una procedura facilmente accessibile e minimamente invasiva, consentendo l'analisi del tessuto nervoso incline alla patologia. Infine, la possibilità di ripetere la biopsia cutanea nel corso del follow-up degli stessi pazienti consente di studiare la correlazione longitudinale con la progressione della malattia.
Nel nostro laboratorio, sfruttando una doppia colorazione immuno-intura con PGP9.5 e l'anticorpo monoclonale 5G4 specificodella conformazione, che riconosce le forme specifiche della malattia di la presenza di srl aggrega nei nervi della pelle con una promettente elevata efficienza diagnostica19. L'analisi dell'immunofluorescenza della biopsia cutanea nelle malattie conformazionali si distingue come una promettente fonte di biomarcatori combinando sia la rilevazione di aggregati proteici che la misura della neurodegenerazione in vivo. Di seguito, illustreremo un protocollo facile e versatile sulla gestione della biopsia cutanea e sull'esecuzione della colorazione dell'immunofluorescenza a fluttuazione libera per rilevare gli aggregati di syn. Inoltre, questo protocollo può essere adattato per colpire qualsiasi altra proteina di interesse espressa nel PNS della pelle.
Il seguente protocollo di studio è stato utilizzato per valutare l'utilità diagnostica dell'analisi aggregata di Ssyn nel PNS della PD mediante biopsia cutanea19. I criteri di inclusione per la PD erano: una diagnosi clinica definita secondo i criteri diagnostici della Banca del cervello del Regno Unito, la durata della malattia di almeno 3 anni, nessuna storia familiare, e nessun grave danno cognitivo o principali sintomi disautonomici nella storia. I criteri di esclusione erano noti cause di neuropatia (emoglobina glicata, creatinina, vitamina B12, TSH, immunofissia del siero, HIV, HCV, sifilide e borreliosi). Ogni soggetto è stato sottoposto a biopsie cutanee di 3 mm di diametro in tre siti anatomici (collo a livello dermatomico C8, coscia 10 cm sopra il ginocchio, gamba 10 cm sopra malleolus laterale) sul lato, che era clinicamente più colpito. In generale, il seguente protocollo riguarda la gestione della biopsia cutanea e l'esecuzione della colorazione e dell'analisi dell'immunofluorescenza a fluttuazione libera. Quindi può essere adattato e utilizzato per il rilevamento di altre proteine di interesse nel tessuto cutaneo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:964px;" width="964">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:264px;">5G4 (anti human &#945;Syneclein 5G4)</td>
			<td style="width:161px;">Analytik Jena Roboscreen</td>
			<td style="width:344px;">847-0102004001</td>
			<td style="width:195px;">Mouse monoclonal&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">AlexaFluor 488 Goat anti Rabbit IgG&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1971418</td>
			<td>2mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">AlexaFluor 594 Goat anti Mouse IgG&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1922849</td>
			<td>2mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Disodium hydrogen phosphate solution</td>
			<td>Merk Millipore</td>
			<td>106586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ethylene Glycol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>324558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Lysine monohydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L5626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Aldrich Chemistry</td>
			<td>441244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:264px;">PGP9.5</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab15503</td>
			<td>Rabbit polyclonal</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodium Dihydrogen Phosphate Monohydrate</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>106346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodium (meta)periodate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trizma Base</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tryton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Vectashield&#160;</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td>Mounting medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

targeting alpha synuclein aggregates in cutaneous peripheral nerve fibers by free-floating immunofluorescence assay

Ad oggi, per la maggior parte delle malattie neurodegenerative è disponibile solo una diagnosi definitiva istopatologica post-mortem. Per il morbo di Parkinson (PD), la diagnosi si basa ancora solo su segni clinici di coinvolgimento motorio che appaiono più tardi nel corso della malattia, quando la maggior parte dei neuroni dopaminergici sono già persi. Quindi, c'è una forte necessità di un biomarcatore in grado di identificare i pazienti all'inizio della malattia o a rischio di svilupparlo. Negli ultimi anni, la biopsia cutanea si è rivelata un eccellente strumento di ricerca e diagnostica per le malattie nervose periferiche come la piccola neuropatia delle fibre. È interessante notare che, una piccola neuropatia della fibra e sinucleina alfa (SynSyn) depositi neurali sono stati mostrati dalla biopsia della pelle in pazienti affetti da PD. Infatti, la biopsia cutanea ha il grande vantaggio di essere una procedura facilmente accessibile, minimamente invasiva e indolore che consente l'analisi del tessuto nervoso periferico incline alla patologia. Inoltre, la possibilità di ripetere la biopsia cutanea nel corso del follow-up dello stesso paziente consente di studiare la correlazione longitudinale con la progressione della malattia. Abbiamo istituito un protocollo affidabile standardizzato per studiare la presenza di aggregati di Syn nelle fibre nervose della pelle del paziente PD. Questo protocollo prevede pochi brevi passaggi di fissazione, una sezionamento criotomeo e poi una doppia colorazione immunofluorescenza a fluttuazione libera con due anticorpi specifici: antiproteina Gene Product 9.5 (PGP9.5) per contrassegnare le fibre nervose cutanee e anti 5G4 per la rilevazione di : syn. Si tratta di un protocollo versatile, sensibile e facile da eseguire che può essere applicato anche per colpire altre proteine di interesse nei nervi della pelle. La capacità di contrassegnare gli aggregati di Syn è un altro passo avanti verso l'uso della biopsia cutanea come strumento per stabilire una diagnosi istologica pre-mortem della PD.

Seguendo la procedura descritta (Figura1), abbiamo rilevato aggregati di Syn, etichettati con anticorpi 5G4, in fascicoli nervosi dermici innervaccando le strutture autonomiche dei pazienti affetti da PD. La morfologia dei depositi alfa-sinucleina appare come un segnale punteggiato lungo gli assoni dei nervi dermici (Figura 2). Infatti, sfruttando questo protocollo in 19 pazienti affetti da PD e 17 controlli nelle biopsie cutanee in tre siti anatomici (collo del...

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Targeting Alpha Synuclein Aggregates in Cutaneous Peripheral Nerve Fibers by Free-floating Immunofluorescence Assay

Qui, presentiamo un protocollo per un test di immunofluorescenza indiretta a fluttuazione libera sulle sezioni di biopsia cutanea che consente l'identificazione di varianti di conformazione specifiche della malattia di sinucleina alfa coinvolte nella malattia di Parkinson e proteine multiple del sistema nervoso periferico.

Targeting Alpha Synuclein Aggregati in cutaneous periferici nervose fibre nervose da Pro(Enunciante autofluorescenza libera)

To date, for most neurodegenerative diseases only a post-mortem histopathological definitive diagnosis is available. For Parkinson&#39;s disease (PD), the ...

La diagnosi del morbo di Parkinson si basa ancora su segni clinici di coinvolgimento motorio che compaiono più avanti nel corso della malattia, quando la maggior parte dei neuroni della substantia nigra sono già persi. Questo protocollo consente l'analisi dei nervi dermici mediante biopsia cutanea, che rappresenta un potenziale nuovo biomarcatore della malattia, da utilizzare negli studi clinici. La biopsia cutanea è una procedura facilmente valutabile e non invasiva che consente l'analisi del tessuto nervoso periferico soggetto alla patologia.Il rilevamento degli aggregati di alfa sinuleina mediante biopsia cutanea può essere utilizzato per scopi diagnostici, possibilmente nelle fasi iniziali, quando la potenziale cura è più efficace. Le biopsie cutanee di follow-up nello stesso paziente consentono un'analisi del tempo e del decorso speciale della diffusione dell'aggregato di alfa sinuleina nel sistema nervoso cutaneo umano. Questi possono far luce sulla patogenesi della malattia.Per iniziare questa procedura, preparare una nuova soluzione fissante PLP come descritto nella tabella Uno del protocollo di testo. Immediatamente dopo aver raccolto la biopsia cutanea, immergerla in un tubo contenente 10 millilitri della soluzione fissante. Incubare durante la notte a quattro gradi Celsius.Il giorno dopo, in una cappa aspirante, rimuovere delicatamente il fissatore PLP. Nello stesso tubo, lavare la biopsia tre volte per cinque minuti ciascuna, utilizzando cinque millilitri della soluzione molare di Sorensen 0,1 per ogni lavaggio. Scartare la soluzione di Sorensen e aggiungere cinque millilitri di soluzione crioprotettiva.Incubare durante la notte a quattro gradi Celsius. Il giorno dopo, conservare la biopsia a quattro gradi Celsius se il taglio con un criotoma deve essere eseguito entro una settimana. Per prima cosa, imposta il criotomo su meno 20 gradi Celsius.Prendi un criomold e riempilo con un mezzo crio-incorporante. Utilizzando le pinzette, immergere la biopsia nel mezzo crio-incorporante, con l'asse longitudinale parallelo al fondo del criomold. Snap congelare il campione con azoto liquido, per ottenere un cubo solido di mezzo crio-incorporante contenente la biopsia nel giusto orientamento.Mettere il campione nel criostato e attendere 30 minuti per consentire alla biopsia di acclimatarsi. Quindi, fissare il campione sul criostato e tagliarlo in sezioni di 50 micrometri. Utilizzando un piccolo pennello, trasferire le crio-sezioni in una piastra da 96 pozzetti contenente 200 microlitri di soluzione antigelo in ogni pozzo.Dopo questo, conservare la piastra a meno 20 gradi Celsius. Per iniziare, riempire alcuni dei pozzi di una piastra fresca da 96 po 'con 100 microlitri di soluzione di lavaggio. Trasferire le sezioni da analizzare dalla piastra di stoccaggio a quella contenente la soluzione di lavaggio.Lasciare le sezioni nella soluzione di lavaggio per 10 minuti a temperatura ambiente. Quindi, trasferire ogni sezione in un pozzo vuoto contenente la stessa soluzione di lavaggio e ripetere il lavaggio. Successivamente, aggiungere la soluzione di lavaggio alle sezioni e trasferirle in nuovi pozzi contenenti 100 microlitri di soluzione di blocco.Incubare a temperatura ambiente per almeno 90 minuti e un massimo di quattro ore. Diluire gli anticorpi primari, anti-PGP9.5 e anti-5G4, nella soluzione di lavoro. Trasferire le sezioni in nuovi pozzi contenenti 100 microlitri della soluzione di lavoro degli anticorpi primari e incubare durante la notte a temperatura ambiente.Il giorno successivo, lavare le sezioni in pozzi contenenti soluzione di lavaggio come descritto in precedenza. Diluire gli anticorpi secondari, Goat anti-Rabbit per rilevare PGP9.5 e Goat anti-Mouse per rilevare 5G4, nella soluzione di lavoro. Trasferire le sezioni lavate in nuovi pozzi contenenti 100 microlitri della soluzione di lavoro degli anticorpi secondari.Coprire la piastra con un foglio di alluminio per evitare lo sbiancamento del fluorofore coniugato con anticorpi secondari e incubare a temperatura ambiente per 90 minuti. Successivamente, lavare le sezioni due volte nella soluzione di lavaggio come descritto in precedenza. Trasferire le sezioni lavate in nuovi pozzi contenenti 100 microlitri di DAPI per cinque minuti a temperatura ambiente.Lavare le sezioni due volte nella soluzione di lavaggio come descritto in precedenza. Quindi, montare le sezioni su una diapositiva nella posizione corretta, evitando errori di piegatura. Aggiungere alcune gocce di supporto di montaggio allo scivolo e coprire la sezione con uno slittamento del coperchio.Lasciare asciugare gli scivoli durante la notte. Il giorno successivo, conservare le diapositive in una casella appropriata a quattro gradi Celsius, assicurandosi di evitare l'esposizione alla luce. Utilizzando un microscopio a fluorescenza invertito o un microscopio confocale, visualizzare le sezioni.Acquisire le immagini da una fotocamera collegata al microscopio. Quindi, utilizzare un microscopio a fluorescenza o un microscopio confocale per analizzare i segnali positivi in sezioni in termini di distribuzione spaziale e intensità del segnale come delineato nel protocollo di testo. Seguendo il metodo descritto, gli aggregati di alfa sinucleina etichettati con anticorpi 5G4 vengono rilevati nei fascicoli nervosi dermici che innervano le strutture autonomiche dei pazienti affetti da PD.La morfologia dei depositi di alfa sinuleina appare come un segnale punteggiato lungo gli assoni dei nervi dermici. L'uso rappresentativo di questo protocollo in 19 pazienti PD e 17 controlli nelle biopsie cutanee in tre siti anatomici mostra che il 5G4 ha una sensibilità dell'81% e una specificità dell'86% rispetto ai controlli sani. La sinuleina alfa fosforilata ha una sensibilità del 56% e una specificità del 100%5G4 e depositi alfa sinuleina positiva fosforilati si trovano principalmente intorno alle ghiandole sudoripare, ma si trovano anche nell'arrector pili muscolare, nei piccoli vasi e nel plesso subepidermico e dermico, ma mai nelle fibre nervose intraepidermiche.Generalmente, all'interno del lume delle ghiandole sudoripare, è possibile osservare un segnale non specifico che potrebbe essere interpretato erroneamente come positività 5G4 o alfa sinuleina fosforilata. Questo tipo di segnale è punteggiato, sferico, ed è dovuto molto probabilmente al materiale autofluorescente intraluminale come dimostrato nei controlli tecnici senza anticorpi primari e secondari. La colocalizzazione con PGP9.5 che segna le fibre nervose, morfologicamente filamentose e allungate, aiuta a identificare il segnale corretto.Pertanto, la specificità del segnale 5G4 è altamente aumentata da una doppia immunostaining con un marcatore assonale. Una fissazione accurata della biopsia è necessaria per produrre una colorazione immunofluorescente di buona qualità e per l'interpretazione affidabile dei segnali fluorescenti. Se il fissatore non è preparato correttamente, o se si è verificata una fissazione troppo, il risultato sarà un'alta autofluorescenza che maschera il segnale delle fibre nervose che attraversano la giunzione dermica-epidermica o innerva le principali strutture dermiche.Il passaggio più critico di questa procedura è la fissazione dei tessuti. Prestare attenzione al pH della soluzione fissante PLP e alla tempistica dell'incubazione, per evitare l'autofluorescenza e un segnale specifico.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Oral Administration of Rotenone using a Gavage and Image Analysis of Alpha-synuclein Inclusions in the Enteric Nervous System

La somministrazione orale di Rotenone utilizzando un Gavage e Image Analysis di alfa-sinucleina inclusioni nel sistema nervoso enterico

In Parkinson's disease (PD) patients, the associated pathology follows a characteristic pattern involving inter alia the enteric nervous system (ENS) 1,2, ...

Ricerca

Neuroscienze

Selective Tracing of Auditory Fibers in the Avian Embryonic Vestibulocochlear Nerve

L&#39;analisi selettiva delle fibre uditive nel aviaria Nerve Embryonic vestibolococleare

The embryonic chick is a widely used model for the study of peripheral and central ganglion cell projections. In the auditory system, selective labeling ...

Transplantation of Olfactory Ensheathing Cells to Evaluate Functional Recovery after Peripheral Nerve Injury

Il trapianto di cellule olfattive ensheathing per valutare il recupero funzionale dopo Peripheral Nerve Injury

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory ...

Sequential Extraction of Soluble and Insoluble Alpha-Synuclein from Parkinsonian Brains

Estrazione sequenziale di solubile e insolubile sinucleina alfa da Brains parkinsoniani

Alpha-synuclein (&#945;-syn) protein is abundantly expressed mainly within neurons, and exists in a number of different forms - monomers, tetramers, ...

Bioluminescence Imaging of Neuroinflammation in Transgenic Mice After Peripheral Inoculation of Alpha-Synuclein Fibrils

Bioluminescenza Imaging di Neuroinflammation in topi transgenici Dopo periferica inoculazione di alfa-sinucleina fibrille

To study the prion-like behavior of misfolded alpha-synuclein, mouse models are needed that allow fast and simple transmission of alpha-synuclein ...

Identification of Dopamine D1-Alpha Receptor Within Rodent Nucleus Accumbens by an Innovative RNA In Situ Detection Technology

Identification of Dopamine D1-Alpha Receptor Within Rodent Nucleus Accumbens by an Innovative RNA In Situ Detection Technology

Identificazione della dopamina D1-alfa del ricevitore all'interno del roditore Nucleus Accumbens da un innovativo RNA In Situ Detection Technology

In the central nervous system, the D1-alpha subtype receptor (Drd1&#945;) is the most abundant dopamine (DA) receptor, which plays a vital role in ...

Exogenous Administration of Microsomes-associated Alpha-synuclein Aggregates to Primary Neurons As a Powerful Cell Model of Fibrils Formation

Somministrazione esogena di microsomi-collegato dell'alfa-synuclein aggregati di neuroni primari come un modello potente delle cellule di formazione di fibrille

For years, the inability of replicating formation of insoluble alpha-synuclein (&#945;S) inclusions in cell cultures has been a great limitation in the ...

Generation of Alpha-Synuclein Preformed Fibrils from Monomers and Use In Vivo

Generazione di fibrille preformate alfa-sinucleina da monomeri e uso in vivo

Use of the in vivo alpha-synuclein preformed fibril (&#945;-syn PFF) model of synucleinopathy is gaining popularity among researchers aiming to model ...

Short-Term Free-Floating Slice Cultures from the Adult Human Brain

A breve termine, le colture di fette libere dal cervello umano adulto

Organotypic, or slice cultures, have been widely employed to model aspects of the central nervous system functioning in vitro. Despite the potential of ...

Assessing Early Stage Open-Angle Glaucoma in Patients by Isolated-Check Visual Evoked Potential

Valutazione del Glaucoma ad angolo aperto in fase iniziale nei pazienti con un potenziale visivo a controllo isolato

Recently, the isolated-check visual evoked potential (icVEP) technique was designed and has been reported to detect glaucomatous damage earlier and ...