Name: targeting alpha synuclein aggregates in cutaneous peripheral nerve fibers by free-floating immunofluorescence assay
Uploaded: 2019-06-25T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Targeting Alpha Synuclein Aggregates in Cutaneous Peripheral Nerve Fibers by Free-floating Immunofluorescence Assay at JoVE.com

우리는 이 연구의 재정적지원을 위해 파킨슨 슈바이츠와 ABREOC(엔테 오스페레아에로 칸토날레의 과학 연구 자문위원회)에게 감사드립니다.

이 프로토콜은 주 윤리 위원회의 승인을 받았으며 등록된 모든 과목은 연구에 대한 서면 동의를 받았습니다.
1. 피부 생검 컬렉션
<ol><li>자격을 갖춘 의사가 적절한 임상 환경에서 피부 생검을 수행하게하십시오.</li>
	<li>피부 생검을 수행하고 알코올 면봉으로 청소 할 영역을 선택합니다.</li>
	<li>리도카인 1 cc2 %로 마취 제를 준비하십시오.</li>
	<li>바늘이 부위와 평행하게 되?...

<ol>
	<li>McArthur, J. C., Griffin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Another+Tool+for+the+neurologist's+Tollbox.">Another Tool for the neurologist's Tollbox.</a> Annals of Neurology. 57, 163-167 (2005).</li><li>Wilkinson, P. F., Millington, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Skin. , 49-50 (2009).</li><li>Weddell, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+endings+in+mammalian+skin.">Nerve endings in mammalian skin.</a> Biological reviews of the Cambridge Philosophical Society. 30, 159-195 (1954).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+gene+product+9.5-immunoreactve+nerve+fibers+and+cells+in+human+skin.">Protein gene product 9.5-immunoreactve nerve fibers and cells in human skin.</a> Cell and Tissue Research. 261 (1), 25-33 (1990).</li><li>Holland, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraepidermal+nerve+fiber+density+in+patients+with+painful+sensory+neuropathy.">Intraepidermal nerve fiber density in patients with painful sensory neuropathy.</a> Neurology. 48, 708-711 (1997).</li><li>McArthur, J. C., Stocks, E. A., Hauer, P., Cornblath, D. R., Griffin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+nerve+fiber+density:+normative+reference+range+and+diagnostic+efficiency.">Epidermal nerve fiber density: normative reference range and diagnostic efficiency.</a> Archives of Neurology. 55 (12), 1513-1520 (1998).</li><li>Lauria, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=European+Federation+of+Neurological+Societies/Peripheral+Nerve+Society+Guideline+on+the+use+of+skin+biopsy+in+the+diagnosis+of+small+fiber+neuropathy.+Report+of+a+joint+task+force+of+the+European+Federation+of+Neurological+Societies+and+the+Peripheral+Nerve+Society.">European Federation of Neurological Societies/Peripheral Nerve Society Guideline on the use of skin biopsy in the diagnosis of small fiber neuropathy. Report of a joint task force of the European Federation of Neurological Societies and the Peripheral Nerve Society.</a> European Journal of Neurology. 17, 903-912 (2010).</li><li>Provitera, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multi-center,+multinational+age-+and+gender-adjusted+normative+dataset+for+immunofluorescent+intraepidermal+nerve+fiber+density+at+the+distal+leg.">A multi-center, multinational age- and gender-adjusted normative dataset for immunofluorescent intraepidermal nerve fiber density at the distal leg.</a> European Journal of Neurology. 23, 333-338 (2016).</li><li>Wakabayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+the+peripheral+nervous+system+in+synucleinopathies,+tauopathies+and+other+neurodegenerative+proteinopathies+of+the+brain.">Involvement of the peripheral nervous system in synucleinopathies, tauopathies and other neurodegenerative proteinopathies of the brain.</a> Acta Neuropathology. 120, 1-12 (2010).</li><li>Ruffmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+alpha-synuclein+conformational+variants+from+gastro-intestinal+biopsy+tissue+as+a+potential+biomarker+for+Parkinson's+disease.">Detection of alpha-synuclein conformational variants from gastro-intestinal biopsy tissue as a potential biomarker for Parkinson's disease.</a> Neuropathology and Applied Neurobiology. 44 (7), 722-736 (2018).</li><li>Lee, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+search+for+a+peripheral+biopsy+indicator+of+alpha-synuclein+pathology+for+Parkinson+Disease.">The search for a peripheral biopsy indicator of alpha-synuclein pathology for Parkinson Disease.</a> Journal of Neuropathology &amp; Experimental Neurology. 76, 2-15 (2017).</li><li>Donadio, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+nerve+misfolded+alpha-synuclein+in+pure+autonomic+failure+and+Parkinson+disease.">Skin nerve misfolded alpha-synuclein in pure autonomic failure and Parkinson disease.</a> Annals of Neurology. 79, 306-316 (2016).</li><li>Doppler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutaneous+neuropathy+in+Parkinson's+disease:+a+window+into+brain+pathology.">Cutaneous neuropathy in Parkinson's disease: a window into brain pathology.</a> Acta Neuropathologica. 128, 99-109 (2014).</li><li>Zange, L., Noack, C., Hahn, K., Stenzel, W., Lipp, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylated+alpha-synuclein+in+skin+nerve+fibres+differentiates+Parkinson's+disease+from+multiple+system+atrophy.">Phosphorylated alpha-synuclein in skin nerve fibres differentiates Parkinson's disease from multiple system atrophy.</a> Brain. 138, 2310-2321 (2015).</li><li>Braak, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staging+of+brain+pathology+related+to+sporadic+Parkinson's+disease.">Staging of brain pathology related to sporadic Parkinson's disease.</a> Neurobiology of Aging. 24, 197-211 (2003).</li><li>Doppler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dermal+phospho-alpha-synuclein+deposits+confirm+REM+sleep+behaviour+disorder+as+prodromal+Parkinson's+disease.">Dermal phospho-alpha-synuclein deposits confirm REM sleep behaviour disorder as prodromal Parkinson's disease.</a> Acta Neuropathologica. 133 (4), 535-545 (2017).</li><li>Antelmi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+nerve+phosphorylated+&#945;-synuclein+deposits+in+idiopathic+REM+sleep+behavior+disorder.">Skin nerve phosphorylated &#945;-synuclein deposits in idiopathic REM sleep behavior disorder.</a> Neurology. 88 (22), 2128-2131 (2017).</li><li>Nolano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+fiber+pathology+parallels+disease+progression+in+Parkinson+disease:+a+longitudinal+study.">Small fiber pathology parallels disease progression in Parkinson disease: a longitudinal study.</a> Acta Neuropathologica. , (2018).</li><li>Melli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cervical+skin+denervation+associates+with+alpha-synuclein+aggregates+in+Parkinson+disease.">Cervical skin denervation associates with alpha-synuclein aggregates in Parkinson disease.</a> Annals of Clinical and Translational Neurology. 5, 1394-1407 (2018).</li><li>Kovacs, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+processing+of+disease-associated+alpha-synuclein+in+the+human+brain+suggests+prion-like+cell-to-cell+spread.">Intracellular processing of disease-associated alpha-synuclein in the human brain suggests prion-like cell-to-cell spread.</a> Neurobiology Disease. 69, 76-92 (2014).</li><li>Kovacs, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+antibody+with+high+reactivity+for+disease-associated+alpha-synuclein+reveals+extensive+brain+pathology.">An antibody with high reactivity for disease-associated alpha-synuclein reveals extensive brain pathology.</a> Acta Neuropathologica. 124, 37-50 (2012).</li></ol>

우리는 PD의 진단을 위한 피부 생검을 위한 자유 부동 면역형 광형 분석분석서를 기술합니다: 그것은 반대로 PGP9.5 항체를 가진 이중 면역 염색을 이용합니다, panaxonal 마커 및 반대로 5G4, 집합된 양식을 인식하는 형태 특정 항체 αSyn.
PD에 있는 진단 목적을 위한 피부 생검의 큰 이점은 그리고 그밖 단백질 형태 무질서에서: 1) 온화한 침략적인 기술에 의하여 질병에 수그린 신경 ...

피부 생검은 신경 장애 분야의 진단 및 연구 도구로서 큰중요성을 획득했습니다 1. 실제로, 표피와 진피는 풍부한 신체 감각 신경 섬유를 포함 (myelinated 및 unmyelinated), nociceptive 무료 신경 엔딩, 감각 수용체 및 땀샘의 자율 적 내심, 혈관, 피지선과 근육 arrector pilorum 2.
20세기 중반에, PGP9.5 항체의 면역운동화학에 대한 설정은 인간 표피 포유류 피부의 광범위한 내막의 증거를 허용했다3. PGP9.5는 중추 및 말초 신경계(PNS)의 축축을 따라 균등하게 분포된 카복실 말단 하이드라제이다. 이 항체의 가용성은 피부에서 PNS의 형태 및 해부학을 명확히 할뿐만 아니라3,4와관련된 질병에 대한 연구를 구현할 수있었습니다. 피부 생검은 새로운 임상 엔티티를 정의하는 데 기여했습니다: 작은 섬유 신경병. 몇몇 국제적인 단은 피부 생검 분석에 의하여 작은 섬유 신경병의 경피 신경 섬유의 손실 및 현상/표시 사이 협회를 보여주었고 신경 morphometry를 위한 표준화한 프로토콜을 제공했습니다. 임상 실습6,7,8에사용되는 규범적 기준값.
최근 많은 양의 증거가 중추 신경계에서 잘못 접힌 단백질 축적을 특징으로하는 신경 퇴행성 질환이 다중 시스템 병리학인것으로나타났습니다 9. 실제로, PD는 체질니그라의도파민성 뉴런에서 αSyn 축적을 특징으로 하지만, αSyn 및 그의 병리학적 형태, 인산화αSyn(P-αSyn)이 말초 조직에서도 검출될 수 있음을 입증되었다. 위장관 점막10,침샘11,땀샘 및 필로모터 근육을 둘러싼 피부 자율 섬유12,13,14,αSyn의 병원성 형태에 대한 면역 반응성, Braak 가설에 따르면 αSyn 병리학이 뇌에 축적되기 전에 PNS에서 잘 시작될 수 있다고 흥미롭게 가정합니다15. 또한, p-αSyn의 존재는 프로드로멀 PD16,17따라서 피부 병리학αSyn이 유망한 초기 말초로 간주될 수 있는 REM 행동 장애를 가진 환자의 피부 신경에서 입증되었다. 조직병리학적 세포병리학적 마커.
PD에서 작은 섬유 신경병증의 연관성은 이전에 입증되었으며 상피 내 신경 섬유 밀도가 질병 진행을 반영하는 것으로 나타났다18,19. 따라서, 피부 생검은 PD에 있는 신경 변성을 공부하고 질병의 pre-mortem 조직 병리학 진단을 설치를 위한 유용한 공구입니다. 실제로, 피부 생검은 병리학에 수그린 신경 조직의 분석을 허용하는 쉽게 접근하고 최소침습 절차인의 큰 이점이 있습니다. 마지막으로, 동일한 환자의 후속 과정에서 피부 생검을 반복할 수 있는 가능성은 질병 진행과의 세로 상관 관계를 연구할 수 있게 합니다.
우리의 실험실에서, PGP9.5및 형태 특이적 단일클론 5G4 항체로 이중 면역 염색을 이용하고, 작은 응집체20,21을포함하는 αSyn의 질병 특이적 형태를 인식하는, 유망한 높은 진단 효율성과 피부 신경에 αSyn 응집체의 존재19. 형태 질환에서 피부 생검의 면역 형광 분석은 단백질 응집체의 검출과 생체 내 신경 변성의 측정을 모두 결합하여 바이오 마커의 유망한 공급원으로 두드러집니다. 이하, 우리는 αSyn 응집체검출을 위한 피부 생검 및 자유 부동 면역형광 염색을 수행하는 것에 대한 쉽고 다양한 프로토콜을 설명한다. 더욱이, 이 프로토콜은 피부 PNS에서 발현되는 관심 있는 임의의 다른 단백질을 표적화하기 위해 적응될 수 있다.
이하의 연구 프로토콜은 피부 생검19에의한 PD의 PNS에서 응집된 αSyn 분석의 진단 유틸리티를 평가하는 데 사용되었다. PD를 위한 포함 기준은: UK Brain Bank 진단 기준에 따라 명확한 임상 진단, 질병 기간 적어도 3 년, 아니 가족력, 및 역사에 있는 중요한 인식 손상 또는 중요한 dysautonomic 현상. 배제 기준은 신경병증(당화혈색소, 크레아티닌, 비타민 B12, TSH, 혈청 면역수정, HIV, HCV, 매독 및 보렐리아증)의 원인으로 알려졌다. 각 대상체는 3개의 해부학적 부위(C8 피부 수준에서 목, 무릎 위 허벅지 10cm, 측면 malleolus 위 다리 10cm)에서 3mm 직경의 피부 생검을 시행했으며, 이는 임상적으로 더 영향을 받았습니다. 일반적으로, 이하의 프로토콜은 피부 생검을 처리하고 자유 부동 면역형광 염색 및 분석을 수행하는 것에 관한 것입니다. 따라서 피부 조직에 관심 있는 다른 단백질의 검출을 위해 적응및 사용될 수 있다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:964px;" width="964">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:264px;">5G4 (anti human &#945;Syneclein 5G4)</td>
			<td style="width:161px;">Analytik Jena Roboscreen</td>
			<td style="width:344px;">847-0102004001</td>
			<td style="width:195px;">Mouse monoclonal&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">AlexaFluor 488 Goat anti Rabbit IgG&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1971418</td>
			<td>2mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">AlexaFluor 594 Goat anti Mouse IgG&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1922849</td>
			<td>2mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Disodium hydrogen phosphate solution</td>
			<td>Merk Millipore</td>
			<td>106586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ethylene Glycol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>324558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Lysine monohydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L5626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Aldrich Chemistry</td>
			<td>441244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:264px;">PGP9.5</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab15503</td>
			<td>Rabbit polyclonal</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodium Dihydrogen Phosphate Monohydrate</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>106346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodium (meta)periodate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trizma Base</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tryton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Vectashield&#160;</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td>Mounting medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

targeting alpha synuclein aggregates in cutaneous peripheral nerve fibers by free-floating immunofluorescence assay

현재까지 대부분의 신경 퇴행성 질환의 경우 사후 조직 병리학적 결정적 진단만 가능합니다. 파킨슨 병 (PD)의 경우, 진단은 여전히 도파민성 뉴런의 대부분이 이미 손실 된 질병 과정에서 나중에 나타나는 운동 관련 의 임상 징후에만 의존합니다. 그러므로, 질병의 시작또는 그것을 개발의 위험한 상태에 환자를 확인할 수 있는 biomarker를 위한 강한 필요가 있습니다. 지난 몇 년 동안, 피부 생검은 작은 섬유 신경 병증과 같은 말초 신경 질환에 대한 훌륭한 연구 및 진단 도구로 입증되었습니다. 흥미롭게도, 작은 섬유 신경 병 증 및 알파 synuclein (αSyn) 신경 예금 PD 환자에서 피부 생 검에 의해 표시 되었습니다. 실제로, 피부 생검은 병리학에 수그린 말초 신경 조직의 분석을 허용하는 쉽게 접근할 수 있고, 최소침습및 고통없는 절차인의 큰 이점이 있습니다. 더욱이, 동일한 환자의 후속 조치 과정에서 피부 생검을 반복할 수 있는 가능성은 질병 진행과의 종방향 상관관계를 연구할 수 있게 한다. 우리는 PD 환자의 피부 신경 섬유에서 αSyn 응집체의 존재를 조사하기 위해 표준화 된 신뢰할 수있는 프로토콜을 설정합니다. 이 프로토콜은 몇 가지 짧은 고정 단계, 극저온 절편 및 다음 두 개의 특정 항체와 자유 부동 면역 형광 이중 염색을 포함: 항 단백질 유전자 제품 9.5 (PGP9.5) 검출을위한 절단 신경 섬유 및 항 5G4를 표시하기 위해 αSyn 집계. 그것은 또한 피부 신경에 관심있는 다른 단백질을 대상으로 적용 할 수있는 다재 다능하고 민감하고 수행하기 쉬운 프로토콜입니다. αSyn 응집체를 표시하는 능력은 PD의 사전 모뎀 조직 병리학 진단을 확립하기위한 도구로 피부 생검의 사용에 또 다른 단계 앞으로.

기재된 절차(그림 1)에 따라, PD 환자의 자율 구조를 내음하는 진피 신경 근막에서 5G4 항체로 표지된 αSyn 응집체를 검출하였다. 알파-시누클레인 침전물의 형태는 진피 신경의 축삭을 따라 점선신호로서 나타난다(그림 2). 실제로, 3개의 해부학적인 사이트 (자궁 경부, 허벅지 및 말단 다리)에 있는 19명의 PD 환자 그리고 17의 통제에 있는 이 프로토콜을 이...

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Targeting Alpha Synuclein Aggregates in Cutaneous Peripheral Nerve Fibers by Free-floating Immunofluorescence Assay

여기에서, 우리는 파킨슨 병및 파킨슨 병에 관여하는 알파 시누클레인의 질병 특정 형태 변이체의 식별을 허용하는 피부 생검 섹션에 자유 부동 간접 면역 형광 분석에 대한 프로토콜을 제시하고 말초 신경계.

자유 부동 면역 형광 분석에 의하여 절단 말초 신경 섬유에 있는 알파 Synuclein 응집체를 표적으로 하는

To date, for most neurodegenerative diseases only a post-mortem histopathological definitive diagnosis is available. For Parkinson&#39;s disease (PD), the ...

파킨슨 병의 진단은 여전히 실질적인 니그라의 뉴런의 대부분이 이미 손실 될 때 질병의 과정에서 나중에 나타나는 운동 참여의 임상 징후에 의존합니다. 이 프로토콜은 질병의 잠재적인 새로운 biomarker를 나타내는 피부 생검에 의한 진피 신경 분석을 임상 시험에서 사용할 수 있게 합니다. 피부 생검은 병리학에 수그리는 말초 신경 조직의 분석을 허용하는 쉽게 평가할 수 있는, 침략적이지 않은 절차입니다.알파 synuclein 피부 생검에 의한 검출은 잠재적인 치료가 가장 효과적인 때, 아마 초기 단계에서 진단 목적을 위해 사용될 수 있습니다. 같은 환자에 있는 후속 피부 생검은 인간 적인 피부 신경계에 퍼지는 알파 synuclein 집계의 시간 및 특별한 과정 분석을 허용합니다. 이들은 질병의 병기 발생에 빛을 비출 수 있습니다.이 절차를 시작하려면 텍스트 프로토콜 중 표 하나에 설명된 대로 새 PLP 고정 솔루션을 준비합니다. 피부 생검을 수집 한 직후 고정 용액의 10 밀리리터가 들어있는 튜브에 담급하십시오. 섭씨 4도에서 하룻밤 을 배양하십시오.다음 날, 연기 후드에, PLP 고정을 부드럽게 제거합니다. 같은 튜브에서 생검을 각각 5분 동안 3회 세척하여 각 세척에 대해 0.1 개의 어금니 소렌슨의 용액 5 밀리리터를 사용하십시오. 소렌슨의 용액을 폐기하고 5밀리리터의 냉동 보호용 솔루션을 추가합니다.섭씨 4도에서 하룻밤 을 배양하십시오. 다음 날, 극저온으로 절단이 1 주일 이내에 수행 될 경우 4 섭씨에 생검을 저장합니다. 먼저 극저온을 영하 20도로 설정합니다.극저온을 가지고 극저온 포함 매체로 채웁니다. 핀셋을 사용하여, 극저온 의 바닥에 평행 세로 축으로, 극저온 포함 매체에 생검을 담급. 스냅은 액체 질소로 샘플을 동결하고, 올바른 방향으로 생검을 포함하는 극저온 염기질의 고체 큐브를 얻습니다.샘플을 냉동에 넣고 생검이 적응할 수 있도록 30 분 동안 기다립니다. 그런 다음 저온 측정기의 샘플을 수정하고 50 마이크로미터 섹션으로 자른다. 작은 브러시를 사용하여 저온 섹션을 각 우물에 200 마이크로리터의 부동액용을 포함하는 96웰 플레이트로 옮춥니다.그 후, 접시를 영하 20도에 보관하십시오. 우선, 신선한 96웰 플레이트의 우물 중 일부를 100 마이크로리터의 세척 용액으로 채우도록 하십시오. 저장 플레이트에서 세척 용액을 포함하는 섹션으로 옮기는 섹션.실온에서 10 분 동안 세척 용액에 섹션을 둡니다. 그런 다음 각 섹션을 동일한 세척 용액을 포함하는 빈 우물로 옮기고 세척을 반복합니다. 다음으로, 섹션에 세척 솔루션을 추가하고 차단 용액 100 마이크로 리터를 포함하는 새로운 우물로 전송합니다.실온에서 최소 90분, 최대 4시간 동안 배양합니다. 일차 항체, 안티 PGP9.5 및 항-5G4를 작업 용액에서 희석시. 1차 항체의 작동 용액의 100 마이크로리터를 포함하는 새로운 우물로 섹션을 옮기고, 실온에서 하룻밤 동안 배양한다.다음 날, 이전에 설명한 대로 세척용액을 함유한 우물의 섹션을 세척한다. 작업 용액에서 PGP9.5 및 염소 항마우스를 검출하기 위해 이차 항체, 염소 안티래빗을 희석한다. 세척된 부분을 이차 항체의 작동 용액 100마이크로리터를 포함하는 새로운 우물로 옮는다.알루미늄 호일로 접시를 덮고 이차 항체로 공칭된 플루오로포어의 표백을 피하고 실온에서 90분 동안 배양합니다. 그 후, 앞에서 설명한 대로 세척용액으로 2회 세척한다. 실온에서 5분 동안 DAPI 100 마이크로리터가 포함된 세척된 섹션을 새로운 우물로 옮겨 넣습니다.앞에서 설명한 대로 세척 용액으로 섹션을 두 번 세척하십시오. 그런 다음 슬라이드에 섹션을 올바른 위치에 장착하여 잘못된 접이식을 피합니다. 슬라이드에 장착 매체를 몇 방울 더 추가하고 커버 슬립으로 섹션을 덮습니다.슬라이드가 하룻밤 동안 건조하게 하십시오. 다음 날, 슬라이드를 섭씨 4도에 적절한 상자에 보관하여 빛 노출을 방지합니다. 반전형 형광 현미경 또는 공초점 현미경을 사용하여 섹션을 봅니다.현미경에 연결된 카메라로 이미지를 획득합니다. 그런 다음, 형광 현미경 또는 공초점 현미경을 사용하여 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 신호의 공간 분포 및 강도 측면에서 섹션에서 양양성 신호를 분석한다. 설명된 방법에 따라, 5G4 항체로 표지된 알파 시뉴클레인 응집체는 PD 환자의 내부 직속 구조인 진피 신경 매심에서 검출된다.알파 synuclein 예금의 형태는 진피 신경의 축삭을 따라 점선 신호로 나타납니다. 이 프로토콜을 대표로 사용하는 것은 19명의 PD 환자및 3개의 해부학적인 사이트에 있는 피부 생검에 있는 17개의 통제가 건강한 통제에 비교될 때 81%의 감도 및 86%의 특이성을 가지고 있다는 것을 보여줍니다. 인광 알파 시뉴클레인은 56%의 민감도를 가지며, 100%5G4의 특이성 및 인포레이트 알파 시뉴클레인 양성 침전물은 주로 땀샘 주변에서 발견되지만, 근육 아레토르 필리, 작은 혈관, 피및 진피 플렉서스에서 발견되지만, 결코 피피연성 신경 섬유섬유에 들어가지 않는다.일반적으로 땀샘 내 루멘 내에서, 5G4 또는 인포리드 알파 synuclein 양성으로 잘못 해석될 수 있는 비특이적 신호를 관찰할 수 있다. 이러한 유형의 신호는 점선, 구형이며, 1차 및 이차 항체가 없는 기술적 제어에서 입증된 바와 같이 장루 내 자가형 물질때문일 수 있습니다. 형태학적으로 필라멘트및 길쭉한 신경 섬유를 표시하는 PGP9.5와의 공존은 올바른 신호를 식별하는 데 도움이됩니다.따라서, 5G4 신호의 특이성은 축산 마커를 가진 이중 면역염색에 의해 높게 증가된다. 생검의 정확한 고정은 양질의 면역 형광 염색을 생성하고 형광 신호의 신뢰할 수있는 해석을 위해 필요합니다. 고정제가 올바르게 준비되지 않았거나 과다 고정이 발생한 경우, 그 결과는 진피 표피 접합을 가로지르는 신경 섬유의 신호를 가하거나 주요 진피 구조를 내면으로 가리는 높은 자동 형광이 될 것입니다.이 절차의 가장 중요한 단계는 조직 고정입니다. PLP 고정 솔루션의 pH, 및 인큐베이션타이밍에 주의를 기울여 자동 불발성과 특정 신호를 피하십시오.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Oral Administration of Rotenone using a Gavage and Image Analysis of Alpha-synuclein Inclusions in the Enteric Nervous System

장용 신경계의 알파 synuclein의 흠도의 Gavage 및 이미지 분석을 사용하여 Rotenone의 구강 관리

In Parkinson's disease (PD) patients, the associated pathology follows a characteristic pattern involving inter alia the enteric nervous system (ENS) 1,2, ...

연구

신경과학

Selective Tracing of Auditory Fibers in the Avian Embryonic Vestibulocochlear Nerve

조류 배아 Vestibulocochlear 신경 청각 섬유의 선택적 추적

The embryonic chick is a widely used model for the study of peripheral and central ganglion cell projections. In the auditory system, selective labeling ...

Transplantation of Olfactory Ensheathing Cells to Evaluate Functional Recovery after Peripheral Nerve Injury

말초 신경 손상 후 기능 회복을 평가하기 위해 후각 Ensheathing 세포의 이식

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory ...

Sequential Extraction of Soluble and Insoluble Alpha-Synuclein from Parkinsonian Brains

파킨슨 뇌에서, 수용성 알파 시누 클레인의 순차 추출

Alpha-synuclein (&#945;-syn) protein is abundantly expressed mainly within neurons, and exists in a number of different forms - monomers, tetramers, ...

Bioluminescence Imaging of Neuroinflammation in Transgenic Mice After Peripheral Inoculation of Alpha-Synuclein Fibrils

알파 - 시누 클레인 브릴의 주변 접종 후 형질 전환 마우스의 신경 염증의 생물 발광 영상

To study the prion-like behavior of misfolded alpha-synuclein, mouse models are needed that allow fast and simple transmission of alpha-synuclein ...

Identification of Dopamine D1-Alpha Receptor Within Rodent Nucleus Accumbens by an Innovative RNA In Situ Detection Technology

Identification of Dopamine D1-Alpha Receptor Within Rodent Nucleus Accumbens by an Innovative RNA In Situ Detection Technology

탐지 기술 현장에서 혁신적인 RNA에 의해 설치류 핵 Accumbens에서 도파민 D1-알파 수용 체의 식별

In the central nervous system, the D1-alpha subtype receptor (Drd1&#945;) is the most abundant dopamine (DA) receptor, which plays a vital role in ...

Exogenous Administration of Microsomes-associated Alpha-synuclein Aggregates to Primary Neurons As a Powerful Cell Model of Fibrils Formation

소 대형의 강력한 셀 모델로 기본 신경 하 Microsomes 관련 알파 synuclein 집계의 외 인 관리

For years, the inability of replicating formation of insoluble alpha-synuclein (&#945;S) inclusions in cell cultures has been a great limitation in the ...

Generation of Alpha-Synuclein Preformed Fibrils from Monomers and Use In Vivo

모노 머 로부터 미리 형성 된 섬유 소의 알파-시 뉴 클레 인 생성 및 생체 내 사용

Use of the in vivo alpha-synuclein preformed fibril (&#945;-syn PFF) model of synucleinopathy is gaining popularity among researchers aiming to model ...

Short-Term Free-Floating Slice Cultures from the Adult Human Brain

성인 인간의 뇌에서 단기 자유 부동 슬라이스 문화

Organotypic, or slice cultures, have been widely employed to model aspects of the central nervous system functioning in vitro. Despite the potential of ...

Assessing Early Stage Open-Angle Glaucoma in Patients by Isolated-Check Visual Evoked Potential

격리 된 검사 시각적 으로 환자에서 초기 단계 오픈 앵글 녹내장 평가 잠재력

Recently, the isolated-check visual evoked potential (icVEP) technique was designed and has been reported to detect glaucomatous damage earlier and ...