Name: targeting alpha synuclein aggregates in cutaneous peripheral nerve fibers by free-floating immunofluorescence assay
Uploaded: 2019-06-25T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Targeting Alpha Synuclein Aggregates in Cutaneous Peripheral Nerve Fibers by Free-floating Immunofluorescence Assay at JoVE.com

Vi takker Parkinson Schweiz og ABREOC (Forskningsrådet for vitenskapelig forskning i Ente Ospedaliero Cantonale) for deres økonomiske støtte til denne studien.

Protokollen er godkjent av kantonale etikk komité og alle registrerte ga skriftlig informert samtykke til studiet.
1. Skin biopsi Collection
<ol><li>La en kvalifisert lege utføre huden biopsi i en hensiktsmessig klinisk setting.</li>
	<li>Velg området for å utføre huden biopsi og rengjør den med en alkoholserviett.</li>
	<li>Forbered bedøvelse løsning med 1 cc av lidokain 2%.</li>
	<li>Med nålen parallelt med området, injisere lokal anestesi subkutant.</li>
	<li>Etter å ha sjekket...

<ol>
	<li>McArthur, J. C., Griffin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Another+Tool+for+the+neurologist's+Tollbox.">Another Tool for the neurologist's Tollbox.</a> Annals of Neurology. 57, 163-167 (2005).</li><li>Wilkinson, P. F., Millington, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Skin. , 49-50 (2009).</li><li>Weddell, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+endings+in+mammalian+skin.">Nerve endings in mammalian skin.</a> Biological reviews of the Cambridge Philosophical Society. 30, 159-195 (1954).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+gene+product+9.5-immunoreactve+nerve+fibers+and+cells+in+human+skin.">Protein gene product 9.5-immunoreactve nerve fibers and cells in human skin.</a> Cell and Tissue Research. 261 (1), 25-33 (1990).</li><li>Holland, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraepidermal+nerve+fiber+density+in+patients+with+painful+sensory+neuropathy.">Intraepidermal nerve fiber density in patients with painful sensory neuropathy.</a> Neurology. 48, 708-711 (1997).</li><li>McArthur, J. C., Stocks, E. A., Hauer, P., Cornblath, D. R., Griffin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+nerve+fiber+density:+normative+reference+range+and+diagnostic+efficiency.">Epidermal nerve fiber density: normative reference range and diagnostic efficiency.</a> Archives of Neurology. 55 (12), 1513-1520 (1998).</li><li>Lauria, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=European+Federation+of+Neurological+Societies/Peripheral+Nerve+Society+Guideline+on+the+use+of+skin+biopsy+in+the+diagnosis+of+small+fiber+neuropathy.+Report+of+a+joint+task+force+of+the+European+Federation+of+Neurological+Societies+and+the+Peripheral+Nerve+Society.">European Federation of Neurological Societies/Peripheral Nerve Society Guideline on the use of skin biopsy in the diagnosis of small fiber neuropathy. Report of a joint task force of the European Federation of Neurological Societies and the Peripheral Nerve Society.</a> European Journal of Neurology. 17, 903-912 (2010).</li><li>Provitera, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multi-center,+multinational+age-+and+gender-adjusted+normative+dataset+for+immunofluorescent+intraepidermal+nerve+fiber+density+at+the+distal+leg.">A multi-center, multinational age- and gender-adjusted normative dataset for immunofluorescent intraepidermal nerve fiber density at the distal leg.</a> European Journal of Neurology. 23, 333-338 (2016).</li><li>Wakabayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+the+peripheral+nervous+system+in+synucleinopathies,+tauopathies+and+other+neurodegenerative+proteinopathies+of+the+brain.">Involvement of the peripheral nervous system in synucleinopathies, tauopathies and other neurodegenerative proteinopathies of the brain.</a> Acta Neuropathology. 120, 1-12 (2010).</li><li>Ruffmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+alpha-synuclein+conformational+variants+from+gastro-intestinal+biopsy+tissue+as+a+potential+biomarker+for+Parkinson's+disease.">Detection of alpha-synuclein conformational variants from gastro-intestinal biopsy tissue as a potential biomarker for Parkinson's disease.</a> Neuropathology and Applied Neurobiology. 44 (7), 722-736 (2018).</li><li>Lee, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+search+for+a+peripheral+biopsy+indicator+of+alpha-synuclein+pathology+for+Parkinson+Disease.">The search for a peripheral biopsy indicator of alpha-synuclein pathology for Parkinson Disease.</a> Journal of Neuropathology &amp; Experimental Neurology. 76, 2-15 (2017).</li><li>Donadio, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+nerve+misfolded+alpha-synuclein+in+pure+autonomic+failure+and+Parkinson+disease.">Skin nerve misfolded alpha-synuclein in pure autonomic failure and Parkinson disease.</a> Annals of Neurology. 79, 306-316 (2016).</li><li>Doppler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutaneous+neuropathy+in+Parkinson's+disease:+a+window+into+brain+pathology.">Cutaneous neuropathy in Parkinson's disease: a window into brain pathology.</a> Acta Neuropathologica. 128, 99-109 (2014).</li><li>Zange, L., Noack, C., Hahn, K., Stenzel, W., Lipp, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylated+alpha-synuclein+in+skin+nerve+fibres+differentiates+Parkinson's+disease+from+multiple+system+atrophy.">Phosphorylated alpha-synuclein in skin nerve fibres differentiates Parkinson's disease from multiple system atrophy.</a> Brain. 138, 2310-2321 (2015).</li><li>Braak, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staging+of+brain+pathology+related+to+sporadic+Parkinson's+disease.">Staging of brain pathology related to sporadic Parkinson's disease.</a> Neurobiology of Aging. 24, 197-211 (2003).</li><li>Doppler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dermal+phospho-alpha-synuclein+deposits+confirm+REM+sleep+behaviour+disorder+as+prodromal+Parkinson's+disease.">Dermal phospho-alpha-synuclein deposits confirm REM sleep behaviour disorder as prodromal Parkinson's disease.</a> Acta Neuropathologica. 133 (4), 535-545 (2017).</li><li>Antelmi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+nerve+phosphorylated+&#945;-synuclein+deposits+in+idiopathic+REM+sleep+behavior+disorder.">Skin nerve phosphorylated &#945;-synuclein deposits in idiopathic REM sleep behavior disorder.</a> Neurology. 88 (22), 2128-2131 (2017).</li><li>Nolano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+fiber+pathology+parallels+disease+progression+in+Parkinson+disease:+a+longitudinal+study.">Small fiber pathology parallels disease progression in Parkinson disease: a longitudinal study.</a> Acta Neuropathologica. , (2018).</li><li>Melli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cervical+skin+denervation+associates+with+alpha-synuclein+aggregates+in+Parkinson+disease.">Cervical skin denervation associates with alpha-synuclein aggregates in Parkinson disease.</a> Annals of Clinical and Translational Neurology. 5, 1394-1407 (2018).</li><li>Kovacs, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+processing+of+disease-associated+alpha-synuclein+in+the+human+brain+suggests+prion-like+cell-to-cell+spread.">Intracellular processing of disease-associated alpha-synuclein in the human brain suggests prion-like cell-to-cell spread.</a> Neurobiology Disease. 69, 76-92 (2014).</li><li>Kovacs, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+antibody+with+high+reactivity+for+disease-associated+alpha-synuclein+reveals+extensive+brain+pathology.">An antibody with high reactivity for disease-associated alpha-synuclein reveals extensive brain pathology.</a> Acta Neuropathologica. 124, 37-50 (2012).</li></ol>

Vi beskriver en fri-flytende immunofluorescence analysen for hud biopsier for diagnostisering av PD: den utnytter dobbelt immunostaining med anti-PGP 9.5 antistoff, en panaxonal markør, og anti-5G4, en konformasjon bestemt antistoff som anerkjenner aggregert form av αSyn.
De store fordelene med hud biopsi for diagnostiske formål i PD og muligens i andre protein conformational lidelser er: 1) direkte tilgang til nervøs vev utsatt for sykdom ved en mildt invasiv teknikk og dermed med en forv...

Skin biopsi har fått en stor betydning som diagnostiske og forskning verktøy innen nevrologiske lidelser1. Faktisk, epidermis og dermis inneholder rikelig somatiske sensoriske nervefibre (myelinated og unmyelinated), nociceptive frie nerve avslutninger, sensoriske reseptorer og autonome innervasjon av svette kjertler, fartøy, talgkjertler og muskel arrector pilorum 2i det.
I midten av 20th århundre, oppsettet for IMMUNHISTOKJEMI av PGP 9.5 antistoff tillot bevis for en omfattende innervasjon av menneskelig epidermis pattedyr hud3. PGP 9.5 er en kar bok syl-Hydrolase like fordelt langs axons av både det sentrale og perifere nervesystemet (PNS). Tilgjengeligheten av dette antistoff tillot ikke bare å avklare morfologi og anatomi av PNS i huden, men også implementert studiet av sykdommer knyttet til den3,4. Hud biopsi bidro til å definere en ny klinisk enhet: den lille fiber nevropati. Flere internasjonale grupper demonstrerte foreningen mellom tap av intraepidermal nervefibre og symptomer/tegn på liten fiber nevropati5 av huden biopsi analyse og gitt standardiserte protokoller for nerve morphometry samt normative referanseverdier som skal brukes i klinisk praksis6,7,8.
Nylig en stor mengde bevis har vist at nevrodegenerative sykdommer, karakterisert ved misfolded protein ansamlinger i sentralnervesystemet, er multi-system patologi9. Faktisk er PD preget av αSyn akkumulering i den dopaminerg Nevron av substantia Nigra, men det har blitt demonstrert at αSyn og patologisk form, fosforylert ΑSyn (P-αSyn), kunne oppdages også i perifere vev. Gastro-intestinal mucosa10, spyttkjertler11, huden autonome fibre rundt svette kjertler og pilomotor muskler12,13,14, Vis immunoreactivity til patogene former for αSyn, i samsvar med Braak hypotese som intriguingly postulatet at αSyn patologi kan begynne i PNS i god tid, før akkumulering i hjernen15. Videre, tilstedeværelsen av p-αSyn har blitt demonstrert i huden nerver av pasienter med REM atferd lidelser som anses prodromal PD16,17 dermed huden patologisk αSyn kan betraktes som en lovende tidlig perifer histopathological markør for synucleinopathy.
Foreningen av små fiber nevropati i PD har blitt demonstrert tidligere, og det har blitt funnet at intraepidermal nervefibre tetthet reflekterer sykdomsprogresjon18,19. Derfor er huden biopsi et nyttig verktøy for å studere neurodegeneration i PD og for å etablere en pre-obduksjon histopathological diagnose av sykdommen. Faktisk, hud biopsi har en stor fordel av å være en lett tilgjengelig og minimalt invasiv prosedyre, slik at analysen av nervøse vev utsatt for patologi. Til slutt, muligheten for å gjenta huden biopsi i løpet av oppfølging av de samme pasientene kan studere langsgående korrelasjon med sykdomsprogresjon.
I vårt laboratorium, utnytte en dobbel Immuno-farging med PGP 9.5 og konformasjon spesifikke monoklonale 5G4 antistoff, som gjenkjenner sykdom spesifikke former for αSyn inkludert små aggregater20,21, kunne vi vise tilstedeværelsen av αSyn aggregater i huden nerver med en lovende høy diagnostisk effektivitet19. Immunofluorescence analyse av huden biopsi i conformational sykdommer skiller seg ut som en lovende kilde til biomarkører ved å kombinere både påvisning av protein aggregater og mål på neurodegeneration in vivo. Heretter illustrerer vi en enkel og allsidig protokoll om håndtering av huden biopsi og utføre fri-flytende immunofluorescence farging for å oppdage αSyn aggregater. Videre kan denne protokollen bli tilpasset for å målrette andre protein av interesse uttrykt i huden PNS.
Følgende studie protokoll har blitt brukt til å evaluere diagnostisk nytte av aggregert αSyn analyse i PNS av PD av huden biopsi19. Inkludering kriterier for PD var: en klar klinisk diagnose i henhold til UK Brain bank diagnostiske kriterier, sykdom varighet minst 3 år, ingen slektshistorie, og ingen større kognitiv svekkelse eller store dysautonomic symptomer i historien. Utelukkelse kriterier ble kjent årsaker til nevropati (glykosylert hemoglobin, kreatinin, vitamin B12, TSH, serum immun fikserings, HIV, HCV, syfilis, og borreliose). Hvert emne gjennomgikk 3 mm-diameter hud biopsier på tre anatomiske områder (halsen på C8 dermatomal nivå, lår 10 cm over kneet, etappe 10 cm over lateral Malleolus) på siden, som var klinisk mer berørt. Generelt, er følgende protokoll om håndtering av huden biopsi og utføre fri-flytende immunofluorescence farging og analyse. Derfor kan det tilpasses og brukes for påvisning av andre proteiner av interesse for hud vev.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:964px;" width="964">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:264px;">5G4 (anti human &#945;Syneclein 5G4)</td>
			<td style="width:161px;">Analytik Jena Roboscreen</td>
			<td style="width:344px;">847-0102004001</td>
			<td style="width:195px;">Mouse monoclonal&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">AlexaFluor 488 Goat anti Rabbit IgG&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1971418</td>
			<td>2mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">AlexaFluor 594 Goat anti Mouse IgG&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1922849</td>
			<td>2mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Disodium hydrogen phosphate solution</td>
			<td>Merk Millipore</td>
			<td>106586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ethylene Glycol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>324558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Lysine monohydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L5626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Aldrich Chemistry</td>
			<td>441244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:264px;">PGP9.5</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab15503</td>
			<td>Rabbit polyclonal</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodium Dihydrogen Phosphate Monohydrate</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>106346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodium (meta)periodate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trizma Base</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tryton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Vectashield&#160;</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td>Mounting medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

targeting alpha synuclein aggregates in cutaneous peripheral nerve fibers by free-floating immunofluorescence assay

Hittil, for de fleste nevrodegenerative sykdommer bare en post-obduksjon histopathological definitive diagnosen er tilgjengelig. For Parkinsons sykdom (PD), avhenger diagnosen fortsatt bare på kliniske tegn på motor involvering som vises senere i Sykdomsforløpet, når de fleste av de dopaminerg neurons er allerede tapt. Derfor er det et sterkt behov for en biomarkør som kan identifisere pasienter i begynnelsen av sykdommen eller risikoen for å utvikle den. I løpet av de siste årene, hud biopsi har vist seg å være en utmerket forskning og diagnostisk verktøy for perifere nerve sykdommer som små fiber nevropati. Interessant, en liten fiber nevropati og Alpha synuclein (αSyn) nevrale innskudd har blitt vist av huden biopsi i PD pasienter. Faktisk har huden biopsi den store fordelen av å være en lett tilgjengelig, minimalt invasiv og smertefri prosedyre som gjør at analysen av perifere nervøse vev utsatt for patologi. Videre kan muligheten for å gjenta huden biopsi i løpet av oppfølgingen av den samme pasienten studerer langsgående korrelasjon med sykdomsprogresjon. Vi setter opp en standardisert pålitelig protokoll for å undersøke tilstedeværelsen av αSyn aggregater i hudens nervefibre av PD pasienten. Denne protokollen innebærer noen korte fiksering trinn, en cryotome snitting og deretter en frittflytende immunofluorescence dobbel farging med to spesifikke antistoffer: anti protein Gene Product 9,5 (PGP 9.5) for å markere hud nervefibre og anti 5G4 for å oppdage αSyn aggregater. Det er en allsidig, følsom og lett å utføre protokollen som også kan anvendes for å målrette andre proteiner av interesse i huden nerver. Evnen til å merke αSyn aggregater er et skritt videre til bruk av hud biopsi som et verktøy for å etablere en pre-obduksjon histopathological diagnose av PD.

Etter beskrevet prosedyre (figur 1), oppdaget vi αSyn aggregater, merket med 5G4 antistoff, i dermal nerve bunter innervating autonome strukturer av PD pasienter. Morfologi av Alpha-synuclein avleiringer vises som et prikket signal langs axons av dermal nerver (figur 2). Faktisk, ved å utnytte denne protokollen i 19 PD pasienter og 17 kontroller i huden biopsier på tre anatomiske området (cervical, lår og det som kan være på beina) fant vi at 5G4 hadde 81...

Watch this Scientific Journal Video about Targeting Alpha Synuclein Aggregates in Cutaneous Peripheral Nerve Fibers by Free-floating Immunofluorescence Assay at JoVE.com

Targeting Alpha Synuclein Aggregates in Cutaneous Peripheral Nerve Fibers by Free-floating Immunofluorescence Assay

Her presenterer vi en protokoll for en frittflytende indirekte immunofluorescence analysen på huden biopsi seksjoner som gjør det mulig for identifisering av sykdom spesifikke konformasjon varianter av Alpha synuclein involvert i Parkinsons sykdom og flere proteiner av perifere nervesystemet.

Målretting Alpha Synuclein aggregater i hud perifere nerve fibre av fri-flytende Immunofluorescence analysen

To date, for most neurodegenerative diseases only a post-mortem histopathological definitive diagnosis is available. For Parkinson&#39;s disease (PD), the ...

Diagnosen Parkinsons sykdom er fortsatt avhengig av kliniske tegn på motorisk involvering som vises senere i sykdomsforløpet, når de fleste nevronene i substantia nigra allerede går tapt. Denne protokollen gjør at dermal nerver analyse av hudbiopsi, som representerer en potensiell ny biomarkør av sykdommen, som skal brukes i kliniske studier. Hudbiopsi er en lett vurderes, ikke-invasiv prosedyre som gjør det mulig å analyse av perifert nervevev som er utsatt for patologien.Alfa synuclein aggregater deteksjon av hudbiopsi kan brukes til diagnostiske formål, muligens i tidlige faser, når potensiell kur er mest effektiv. Oppfølging hud biopsier hos samme pasient tillate en tid og spesiell kursanalyse av alfa synuclein aggregert spredning i humant kutan nervesystem. Disse kan kaste lys over patogenesen av sykdom.For å starte denne prosedyren, klargjør en ny PLP fixative løsning som beskrevet i tabell en av tekstprotokollen. Umiddelbart etter å ha samlet hudbiopsi, senk den ned i et rør som inneholder 10 milliliter av den fikserende løsningen. Inkuber over natten på fire grader Celsius.Neste dag, i en røykhette, fjern PLP-fikseringen forsiktig. I samme rør vasker du biopsien tre ganger i fem minutter hver, ved hjelp av fem milliliter med 0,1 molar Sorensens løsning for hver vask. Kast Sorensens løsning, og tilsett fem milliliter kryobeskyttende løsning.Inkuber over natten på fire grader Celsius. Neste dag, lagre biopsien ved fire grader Celsius hvis kuttet med en kryotomi skal utføres innen en uke. Først setter du kryotomien til minus 20 grader Celsius.Ta en kryomold og fyll den opp med kryo-embedding medium. Bruk pinsett, dypp biopsien i kryo-innebyggingsmediet, med langsgående akse parallelt med bunnen av kryomold. Snap fryse prøven med flytende nitrogen, for å få en solid kube av kryo-embedding medium som inneholder biopsi i riktig retning.Sett prøven i kryostaten, og vent i 30 minutter for å la biopsien akklimatisere seg. Deretter fikser du prøven på kryostaten og kutter i 50-mikrometerseksjoner. Bruk en liten børste til å overføre kryoseksjonene til en 96-brønns plate som inneholder 200 mikroliter frostvæskeoppløsning i hver brønn.Etter dette, lagre platen på minus 20 grader Celsius. Til å begynne med fyller du noen av brønnene på en frisk 96-brønns tallerken med 100 mikroliter vaskeoppløsning. Overfør seksjonene som skal analyseres fra oppbevaringsplaten til den som inneholder vaskeoppløsningen.La seksjonene stå i vaskeoppløsningen i 10 minutter ved romtemperatur. Deretter overfører du hver seksjon til en tom brønn som inneholder samme vaskeoppløsning, og gjentar vasken. Deretter legger du til vaskeløsning i seksjonene, og overfører dem til nye brønner som inneholder 100 mikroliter blokkeringsløsning.Inkuber ved romtemperatur i minst 90 minutter, og maksimalt fire timer. Fortynn de primære antistoffene, anti-PGP9.5 og anti-5G4, i arbeidsløsningen. Overfør seksjonene til nye brønner som inneholder 100 mikroliter av arbeidsløsningen til de primære antistoffene, og inkuber over natten ved romtemperatur.Neste dag, vask seksjonene i brønner som inneholder vaskeoppløsning som tidligere beskrevet. Fortynn de sekundære antistoffene, Geitanti-Kanin for å oppdage PGP9.5 og Geit anti-Mus for å oppdage 5G4, i arbeidsløsningen. Overfør de vasket seksjonene til nye brønner som inneholder 100 mikroliter av arbeidsløsningen til de sekundære antistoffene.Dekk platen med aluminiumsfolie for å unngå bleking av fluorofor konjugert med sekundære antistoffer, og inkuber ved romtemperatur i 90 minutter. Etter dette vasker du seksjonene to ganger i vaskeoppløsning som tidligere beskrevet. Overfør de vasket seksjonene til nye brønner som inneholder 100 mikroliter DAPI i fem minutter ved romtemperatur.Vask seksjonene to ganger i vaskeoppløsning som tidligere beskrevet. Deretter monterer du inndelingene på et lysbilde i riktig posisjon, og unngår feilfolding. Legg til noen dråper monteringsmedium til lysbildet og dekk seksjonen med en dekselslipp.La lysbildene tørke over natten. Neste dag, lagre lysbildene i en passende boks på fire grader Celsius, sørg for å unngå lyseksponering. Ved hjelp av et omvendt fluorescensmikroskop eller et konfokalt mikroskop, se seksjonene.Hent bildene med et kamera som er koblet til mikroskopet. Deretter bruker du et fluorescensmikroskop eller et konfokalt mikroskop for å analysere positive signaler i seksjoner når det gjelder romlig fordeling og intensitet av signalet som beskrevet i tekstprotokollen. Etter den beskrevne metoden oppdages alfasynucleinaggregater merket med 5G4 antistoff i dermal nervefascicles innervating autonome strukturer av PD-pasienter.Morfologien til alfa synuclein innskudd vises som et stiplet signal langs aksonene av dermal nerver. Representativ bruk av denne protokollen hos 19 PD-pasienter og 17 kontroller i hudbiopsier på tre anatomiske steder viser at 5G4 har en følsomhet på 81%og en spesifisitet på 86%sammenlignet med sunne kontroller. Fosforylert alfa synuclein har en følsomhet på 56%og en spesifisitet på 100% 5G4 og fosforylert alfa synuclein-positive innskudd finnes hovedsakelig rundt svettekjertler, men finnes også i muskel arrector pili, små fartøy, og subepidermal og dermal plexus, men aldri i intraepidermale nervefibre.Vanligvis, innenfor svettekjertlene lumen, er det mulig å observere et uspesifikt signal som kan feiltolkes som 5G4 eller fosforylert alfa synuclein positivitet. Denne typen signal er stiplet, sfærisk, og det skyldes mest sannsynlig intraluminal autofluorescerende materiale som demonstrert i tekniske kontroller uten primære og sekundære antistoffer. Colocalization med PGP9.5 som markerer nervefibrene, som morfologisk er filamentøse og langstrakte, bidrar til å identifisere riktig signal.Derfor er spesifisiteten til 5G4-signalet sterkt økt med en dobbel immunstaining med en aksonær markør. En nøyaktig fiksering av biopsien er nødvendig for å produsere en immunofluorescerende farging av god kvalitet og for pålitelig tolkning av fluorescerende signaler. Hvis fikseringen ikke er riktig forberedt, eller hvis en over-fiksering har skjedd, vil resultatet være en høy autofluorescence som vil maskere signalet av nervefibre som krysser dermal-epidermal krysset, eller innervate de viktigste dermal strukturer.Det mest kritiske trinnet i denne prosedyren er vevfiksering. Vær oppmerksom på pH av PLP fikseringsmiddelløsning, og tidspunktet for inkubasjon, for å unngå autofluorescence og et bestemt signal.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Oral Administration of Rotenone using a Gavage and Image Analysis of Alpha-synuclein Inclusions in the Enteric Nervous System

In Parkinson's disease (PD) patients, the associated pathology follows a characteristic pattern involving inter alia the enteric nervous system (ENS) 1,2, ...

Selective Tracing of Auditory Fibers in the Avian Embryonic Vestibulocochlear Nerve

Selektiv Tracing av auditiv Fibers i Avian Embryonic Vestibulocochlear Nerve

The embryonic chick is a widely used model for the study of peripheral and central ganglion cell projections. In the auditory system, selective labeling ...

Transplantation of Olfactory Ensheathing Cells to Evaluate Functional Recovery after Peripheral Nerve Injury

Transplantasjon av Olfactory Ensheathing Cells å evaluere Funksjonell Recovery etter perifer nerveskade

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory ...

Sequential Extraction of Soluble and Insoluble Alpha-Synuclein from Parkinsonian Brains

Sekvensiell Utvinning av løselig og uløselig Alpha-synuclein fra Parkinson Brains

Alpha-synuclein (&#945;-syn) protein is abundantly expressed mainly within neurons, and exists in a number of different forms - monomers, tetramers, ...

Bioluminescence Imaging of Neuroinflammation in Transgenic Mice After Peripheral Inoculation of Alpha-Synuclein Fibrils

Bioluminesens Imaging av nevroinflammasjon i transgene mus etter Peripheral Inokulering av Alfa synukleinfibriller

To study the prion-like behavior of misfolded alpha-synuclein, mouse models are needed that allow fast and simple transmission of alpha-synuclein ...

Identification of Dopamine D1-Alpha Receptor Within Rodent Nucleus Accumbens by an Innovative RNA In Situ Detection Technology

Identification of Dopamine D1-Alpha Receptor Within Rodent Nucleus Accumbens by an Innovative RNA In Situ Detection Technology

Identifikasjon av dopamin D1-Alpha reseptor i gnager Nucleus Accumbens av en nyskapende RNA i Situ oppdagelsen teknologien

In the central nervous system, the D1-alpha subtype receptor (Drd1&#945;) is the most abundant dopamine (DA) receptor, which plays a vital role in ...

Exogenous Administration of Microsomes-associated Alpha-synuclein Aggregates to Primary Neurons As a Powerful Cell Model of Fibrils Formation

Eksogene administrasjon av Microsomes-assosiert Alpha-synuclein-aggregater til primære Neurons som kraftig celle modell Fibrils formasjonen

For years, the inability of replicating formation of insoluble alpha-synuclein (&#945;S) inclusions in cell cultures has been a great limitation in the ...

Generation of Alpha-Synuclein Preformed Fibrils from Monomers and Use In Vivo

Generering av Alpha-Synuclein preformed fibrils fra monomerer og bruk in vivo

Use of the in vivo alpha-synuclein preformed fibril (&#945;-syn PFF) model of synucleinopathy is gaining popularity among researchers aiming to model ...

Short-Term Free-Floating Slice Cultures from the Adult Human Brain

Kortsiktige fritt flytende Slice kulturer fra Adult Human Brain

Organotypic, or slice cultures, have been widely employed to model aspects of the central nervous system functioning in vitro. Despite the potential of ...

Assessing Early Stage Open-Angle Glaucoma in Patients by Isolated-Check Visual Evoked Potential

Vurdere tidlig stadium åpenvinkel glaukom hos pasienter ved isolat-sjekk visuell fremkalt potensial

Recently, the isolated-check visual evoked potential (icVEP) technique was designed and has been reported to detect glaucomatous damage earlier and ...