Name: targeting alpha synuclein aggregates in cutaneous peripheral nerve fibers by free-floating immunofluorescence assay
Uploaded: 2019-06-25T13:30:00
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Agradecemos a Parkinson Schweiz e ABREOC (o Conselho Consultivo de pesquisa científica do ente Ospedaliero CANTONALE) por seu apoio financeiro deste estudo.

O protocolo foi aprovado pelo Comitê de ética cantonal e todos os sujeitos inscritos deram o consentimento informado por escrito ao estudo.
1. coleção da biópsia da pele
<ol><li>Deixe um médico qualificado realizar a biópsia da pele em um ajuste clínico apropriado.</li>
	<li>Escolha a área para realizar a biópsia da pele e limpe-a com um cotonete de álcool.</li>
	<li>Prepare a solução anestésica com 1 cc de lidocaína 2%.</li>
	<li>Com a agulha paralela à área, injete a anest...

<ol>
	<li>McArthur, J. C., Griffin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Another+Tool+for+the+neurologist's+Tollbox.">Another Tool for the neurologist's Tollbox.</a> Annals of Neurology. 57, 163-167 (2005).</li><li>Wilkinson, P. F., Millington, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Skin. , 49-50 (2009).</li><li>Weddell, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+endings+in+mammalian+skin.">Nerve endings in mammalian skin.</a> Biological reviews of the Cambridge Philosophical Society. 30, 159-195 (1954).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+gene+product+9.5-immunoreactve+nerve+fibers+and+cells+in+human+skin.">Protein gene product 9.5-immunoreactve nerve fibers and cells in human skin.</a> Cell and Tissue Research. 261 (1), 25-33 (1990).</li><li>Holland, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraepidermal+nerve+fiber+density+in+patients+with+painful+sensory+neuropathy.">Intraepidermal nerve fiber density in patients with painful sensory neuropathy.</a> Neurology. 48, 708-711 (1997).</li><li>McArthur, J. C., Stocks, E. A., Hauer, P., Cornblath, D. R., Griffin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+nerve+fiber+density:+normative+reference+range+and+diagnostic+efficiency.">Epidermal nerve fiber density: normative reference range and diagnostic efficiency.</a> Archives of Neurology. 55 (12), 1513-1520 (1998).</li><li>Lauria, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=European+Federation+of+Neurological+Societies/Peripheral+Nerve+Society+Guideline+on+the+use+of+skin+biopsy+in+the+diagnosis+of+small+fiber+neuropathy.+Report+of+a+joint+task+force+of+the+European+Federation+of+Neurological+Societies+and+the+Peripheral+Nerve+Society.">European Federation of Neurological Societies/Peripheral Nerve Society Guideline on the use of skin biopsy in the diagnosis of small fiber neuropathy. Report of a joint task force of the European Federation of Neurological Societies and the Peripheral Nerve Society.</a> European Journal of Neurology. 17, 903-912 (2010).</li><li>Provitera, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multi-center,+multinational+age-+and+gender-adjusted+normative+dataset+for+immunofluorescent+intraepidermal+nerve+fiber+density+at+the+distal+leg.">A multi-center, multinational age- and gender-adjusted normative dataset for immunofluorescent intraepidermal nerve fiber density at the distal leg.</a> European Journal of Neurology. 23, 333-338 (2016).</li><li>Wakabayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+the+peripheral+nervous+system+in+synucleinopathies,+tauopathies+and+other+neurodegenerative+proteinopathies+of+the+brain.">Involvement of the peripheral nervous system in synucleinopathies, tauopathies and other neurodegenerative proteinopathies of the brain.</a> Acta Neuropathology. 120, 1-12 (2010).</li><li>Ruffmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+alpha-synuclein+conformational+variants+from+gastro-intestinal+biopsy+tissue+as+a+potential+biomarker+for+Parkinson's+disease.">Detection of alpha-synuclein conformational variants from gastro-intestinal biopsy tissue as a potential biomarker for Parkinson's disease.</a> Neuropathology and Applied Neurobiology. 44 (7), 722-736 (2018).</li><li>Lee, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+search+for+a+peripheral+biopsy+indicator+of+alpha-synuclein+pathology+for+Parkinson+Disease.">The search for a peripheral biopsy indicator of alpha-synuclein pathology for Parkinson Disease.</a> Journal of Neuropathology &amp; Experimental Neurology. 76, 2-15 (2017).</li><li>Donadio, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+nerve+misfolded+alpha-synuclein+in+pure+autonomic+failure+and+Parkinson+disease.">Skin nerve misfolded alpha-synuclein in pure autonomic failure and Parkinson disease.</a> Annals of Neurology. 79, 306-316 (2016).</li><li>Doppler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutaneous+neuropathy+in+Parkinson's+disease:+a+window+into+brain+pathology.">Cutaneous neuropathy in Parkinson's disease: a window into brain pathology.</a> Acta Neuropathologica. 128, 99-109 (2014).</li><li>Zange, L., Noack, C., Hahn, K., Stenzel, W., Lipp, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylated+alpha-synuclein+in+skin+nerve+fibres+differentiates+Parkinson's+disease+from+multiple+system+atrophy.">Phosphorylated alpha-synuclein in skin nerve fibres differentiates Parkinson's disease from multiple system atrophy.</a> Brain. 138, 2310-2321 (2015).</li><li>Braak, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staging+of+brain+pathology+related+to+sporadic+Parkinson's+disease.">Staging of brain pathology related to sporadic Parkinson's disease.</a> Neurobiology of Aging. 24, 197-211 (2003).</li><li>Doppler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dermal+phospho-alpha-synuclein+deposits+confirm+REM+sleep+behaviour+disorder+as+prodromal+Parkinson's+disease.">Dermal phospho-alpha-synuclein deposits confirm REM sleep behaviour disorder as prodromal Parkinson's disease.</a> Acta Neuropathologica. 133 (4), 535-545 (2017).</li><li>Antelmi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+nerve+phosphorylated+&#945;-synuclein+deposits+in+idiopathic+REM+sleep+behavior+disorder.">Skin nerve phosphorylated &#945;-synuclein deposits in idiopathic REM sleep behavior disorder.</a> Neurology. 88 (22), 2128-2131 (2017).</li><li>Nolano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+fiber+pathology+parallels+disease+progression+in+Parkinson+disease:+a+longitudinal+study.">Small fiber pathology parallels disease progression in Parkinson disease: a longitudinal study.</a> Acta Neuropathologica. , (2018).</li><li>Melli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cervical+skin+denervation+associates+with+alpha-synuclein+aggregates+in+Parkinson+disease.">Cervical skin denervation associates with alpha-synuclein aggregates in Parkinson disease.</a> Annals of Clinical and Translational Neurology. 5, 1394-1407 (2018).</li><li>Kovacs, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+processing+of+disease-associated+alpha-synuclein+in+the+human+brain+suggests+prion-like+cell-to-cell+spread.">Intracellular processing of disease-associated alpha-synuclein in the human brain suggests prion-like cell-to-cell spread.</a> Neurobiology Disease. 69, 76-92 (2014).</li><li>Kovacs, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+antibody+with+high+reactivity+for+disease-associated+alpha-synuclein+reveals+extensive+brain+pathology.">An antibody with high reactivity for disease-associated alpha-synuclein reveals extensive brain pathology.</a> Acta Neuropathologica. 124, 37-50 (2012).</li></ol>

Nós descrevemos um ensaio de flutuação livre da imunofluorescência para biópsias da pele para o diagnóstico do paládio: explora a imunocoloração dobro com o anticorpo de anti-PGP 9.5, um marcador panaxonal, e o anti-5G4, um anticorpo específico da conformação que reconheça a forma agregada de αSyn.
As grandes vantagens da biópsia da pele para a finalidade diagnóstica no paládio e possivelmente em outras desordens conformacional da proteína são: 1) o acesso direto ao tecido n...

A biópsia cutânea adquiriu grande importância como ferramenta diagnóstica e de pesquisa no campo das desordens neurológicas1. Na verdade, a epiderme e a derme contêm abundantes fibras nervosas sensoriais somáticas (mielinizadas e não mielinizadas), terminações nervosas livres nociceptivas, receptores sensoriais e inervação autonômica de glândulas sudoríparas, vasos, glândulas sebáceas e músculo arrector arrectores o 2.
Em meados do século 20 , a instalação de imunoistoquímica do anticorpo PGP 9.5 permitiu a evidência de uma extensa inervação da epiderme humana3. O PGP 9.5 é um hidrolase do carboxyl-terminal distribuído ingualmente ao longo dos axônios do sistema nervoso central e periférico (PNS). A disponibilidade deste anticorpo permitiu não apenas esclarecer a morfologia e a anatomia da PNS na pele, mas também implementar o estudo de doenças associadas a ele3,4. A biópsia da pele contribuiu a definir uma entidade clínica nova: a neuropatia pequena da fibra. Diversos grupos internacionais demonstraram a associação entre a perda de fibras de nervo intraepidérmicas e os sintomas/sinais da neuropatia pequena da fibra5 pela análise da biópsia da pele e forneceram protocolos estandardizados para a morfometria do nervo assim como valores de referência normativos a serem utilizados na prática clínica6,7,8.
Recentemente, uma grande quantidade de evidências mostrou que as doenças neurodegenerativas, caracterizadas por acumulações de proteínas desdobradas no sistema nervoso central, são patologias multissistema9. Na verdade, a DP é caracterizada por acúmulo de αsyn no neurônio dopaminérgico de substância negra nigra, mas tem sido demonstrado que αsyn e sua forma patológica, αsyn fosforilada (P-αsyn), poderiam ser detectadas também nos tecidos periféricos. Mucosa gastro-intestinal10, glândulas salivares11, fibras autonômicas da pele que cercam as glândulas sudoríparas e os músculos pilomotores12,13,14, mostram imunoreatividade a formas patogênicas de αsyn, em acordo com a hipótese de Braak que postular intrigantemente que a patologia de αSyn pode começar no PNS bem adiantado, antes de sua acumulação no cérebro15. Além disso, a presença de p-αsyn foi demonstrada em nervos cutâneos de pacientes com distúrbios do comportamento REM, que são considerados PD16,17 assim, a pele patológica αsyn pode ser considerada um promissor periférico precoce marcador histopatológico de sinucleinopatia.
A associação da neuropatia pequena da fibra no paládio foi demonstrada previamente e verificou-se que a densidade intraepidérmicas das fibras de nervo reflete a progressão da doença18,19. Daqui, a biópsia da pele é uma ferramenta útil para estudar a neurodegeneração no paládio e para estabelecer um diagnóstico histopatológico pre-mortem da doença. Na verdade, a biópsia da pele tem uma grande vantagem de ser um procedimento facilmente acessível e minimamente invasivo, permitindo a análise do tecido nervoso propenso à patologia. Finalmente, a possibilidade de repetição da biópsia cutânea no decorrer do seguimento dos mesmos pacientes permite estudar a correlação longitudinal com a progressão da doença.
Em nosso laboratório, explorando um immuno-mancha dobro com PGP 9.5 e o anticorpo 5g4 monoclonal conformation-específico, que reconhece formulários específicos da doença de αsyn que incluem agregados pequenos20,21, nós pudemos mostrar o presença de agregados de αSyn nos nervos da pele com uma eficiência diagnóstica elevada prometedora19. A análise da imunofluorescência da biópsia da pele em doenças conformacional destaca-se como uma fonte promissora de biomarcadores, combinando tanto a detecção de agregados proteicos quanto a medida da neurodegeneração in vivo. Daqui por diante, nós ilustramos um protocolo fácil e versátil em segurar a biópsia da pele e em executar a mancha da imunofluorescência da livre-flutuação para detectar agregados do αSyn. Além disso, este protocolo pode ser adaptado para alvejar toda a outra proteína do interesse expressada no PNS da pele.
O seguinte protocolo de estudo tem sido utilizado para avaliar a utilidade diagnóstica da análise de αSyn agregada na PNS de DP por biópsia cutânea19. Os critérios de inclusão para DP foram: um diagnóstico clínico definitivo de acordo com os critérios diagnósticos do banco do cérebro do Reino Unido, duração da doença pelo menos 3 anos, sem antecedentes familiares e sem comprometimento cognitivo maior ou sintomas dissautonômicos maiores na história. Os critérios de exclusão foram causas conhecidas de neuropatia (hemoglobina glicada, creatinina, vitamina B12, TSH, Imunofixação sérica, HIV, HCV, sífilis e borreliose). Cada sujeito foi submetido a biópsias cutâneas de 3 mm de diâmetro em três sítios anatômicos (pescoço no nível dermatomal C8, coxa 10 cm acima do joelho, perna 10 cm acima do maléolo lateral) no lado, o que foi clinicamente mais afetado. Geralmente, o seguinte protocolo é sobre a manipulação da biópsia da pele e a realização da coloração e da análise livre-flutuantes da imunofluorescência. Daqui pode ser adaptado e usado para a deteção de outras proteínas do interesse no tecido da pele.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:964px;" width="964">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:264px;">5G4 (anti human &#945;Syneclein 5G4)</td>
			<td style="width:161px;">Analytik Jena Roboscreen</td>
			<td style="width:344px;">847-0102004001</td>
			<td style="width:195px;">Mouse monoclonal&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">AlexaFluor 488 Goat anti Rabbit IgG&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1971418</td>
			<td>2mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">AlexaFluor 594 Goat anti Mouse IgG&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1922849</td>
			<td>2mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Disodium hydrogen phosphate solution</td>
			<td>Merk Millipore</td>
			<td>106586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ethylene Glycol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>324558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Lysine monohydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L5626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Aldrich Chemistry</td>
			<td>441244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:264px;">PGP9.5</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab15503</td>
			<td>Rabbit polyclonal</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodium Dihydrogen Phosphate Monohydrate</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>106346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodium (meta)periodate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trizma Base</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tryton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Vectashield&#160;</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td>Mounting medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

targeting alpha synuclein aggregates in cutaneous peripheral nerve fibers by free-floating immunofluorescence assay

Até agora, para a maioria de doenças neurodegenerativas somente um diagnóstico definitivo histopatológico post-mortem está disponível. Para a doença de Parkinson (DP), o diagnóstico ainda depende apenas de sinais clínicos de comprometimento motor que aparecem mais tarde no curso da doença, quando a maioria dos neurônios dopaminérgicos já estão perdidos. Assim, há uma forte necessidade de um biomarcador que possa identificar os pacientes no início da doença ou com o risco de desenvolvê-lo. Durante os últimos anos, a biópsia da pele provou ser uma pesquisa excelente e uma ferramenta diagnóstica para doenças periféricas do nervo tais como a neuropatia pequena da fibra. Curiosamente, uma pequena neuropatia de fibra e alfa sinucleína (αsyn) depósitos neurais têm sido mostrados por biópsia de pele em pacientes com DP. Na verdade, a biópsia da pele tem a grande vantagem de ser um procedimento facilmente acessível, minimamente invasivo e indolor que permite a análise do tecido nervoso periférico propenso à patologia. Além disso, a possibilidade de repetição da biópsia cutânea no decorrer do seguimento do mesmo paciente permite estudar a correlação longitudinal com a progressão da doença. Nós definimos um protocolo confiável padronizado para investigar a presença de agregados αSyn em fibras nervosas da pele do paciente com DP. Este protocolo envolve poucas etapas curtas da fixação, um seccionamento do cryotome e então uma imunofluorescência livre-flutuante que mancha dobro com dois anticorpos específicos: anti produto 9,5 do gene da proteína (PGP 9.5) para marcar as fibras de nervo Cutaneous e o anti 5G4 para detectar agregados αSyn. É um protocolo versátil, sensível e fácil de executar que também pode ser aplicado para direcionar outras proteínas de interesse em nervos da pele. A capacidade de marcar agregados αSyn é outro passo em frente para o uso da biópsia cutânea como ferramenta para o estabelecimento de um diagnóstico histopatológico pré-morte de DP.

Após o procedimento descrito (Figura 1), foram detectados agregados αsyn, rotulados com anticorpo 5G4, em fascículos do nervo dérmico inervação de estruturas autonômicas de pacientes com DP. A morfologia dos depósitos de alfa-sinucleina aparece como um sinal pontilhado ao longo dos axônios dos nervos dérmicos (Figura 2). De fato, explorando esse protocolo em 19 pacientes com DP e 17 controles em biópsias cutâneas em três sítios anatômicos (cervica...

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Targeting Alpha Synuclein Aggregates in Cutaneous Peripheral Nerve Fibers by Free-floating Immunofluorescence Assay

Aqui, nós apresentamos um protocolo para um ensaio indireto deflutuação da imunofluorescência em seções da biópsia da pele que permita a identificação de variações específicas da conformação da doença do sinucleína alfa envolvido na doença de Parkinson e nas proteínas múltiplas do sistema nervoso periférico.

Segmentação de agregados Alpha synuclein em fibras nervosas periféricas cutâneas por ensaio de imunofluorescência livre-flutuante

To date, for most neurodegenerative diseases only a post-mortem histopathological definitive diagnosis is available. For Parkinson&#39;s disease (PD), the ...

O diagnóstico da doença de Parkinson ainda se baseia em sinais clínicos de envolvimento motor que aparecem mais tarde no curso da doença, quando a maioria dos neurônios da substantia nigra já estão perdidos. Este protocolo permite que a análise dos nervos dérmicos por biópsia da pele, que representa um potencial novo biomarcador da doença, seja usada em ensaios clínicos. A biópsia da pele é um procedimento facilmente avaliável, não invasivo que permite a análise do tecido nervoso periférico que é propenso à patologia.A synucleína alfa agrega a detecção por biópsia da pele pode ser usada para fins diagnósticos, possivelmente em fases iniciais, quando a cura potencial é mais eficaz. Biópsias de pele de acompanhamento no mesmo paciente permitem uma análise temporal e especial do curso de synucleína alfa se espalhando no sistema nervoso cutâneo humano. Estes podem lançar luz sobre a patogênese da doença.Para iniciar este procedimento, prepare uma nova solução fixativa PLP conforme descrito na Tabela Um do protocolo de texto. Imediatamente após a coleta da biópsia da pele, submerse-a em um tubo contendo 10 mililitros da solução fixa. Incubar durante a noite a quatro graus Celsius.No dia seguinte, em um capô de fumaça, remova o PLP fixativo suavemente. No mesmo tubo, lave a biópsia três vezes por cinco minutos cada, usando cinco mililitros da solução de 0,1 molar Sorensen para cada lavagem. Descarte a solução do Sorensen e adicione cinco mililitros de solução crioprotetor.Incubar durante a noite a quatro graus Celsius. No dia seguinte, armazene a biópsia a quatro graus Celsius se o corte com um criotome for realizado dentro de uma semana. Primeiro, coloque o criotome para menos 20 graus Celsius.Pegue uma criomold e encha-a com meio crio-incorporando. Usando pinças, mergulhe a biópsia no meio de incorporação crio-inscrita, com o eixo longitudinal paralelo ao fundo do criomold. Es clique congelar a amostra com nitrogênio líquido, para obter um cubo sólido de meio de incorporação crio-incorporador contendo a biópsia na orientação correta.Coloque a amostra no criostat, e espere 30 minutos para permitir que a biópsia se aclimata. Em seguida, fixar a amostra no criostat e cortar em seções de 50 micrômetros. Usando uma pequena escova, transfira as crio-seções para uma placa de 96 poços contendo 200 microliters de solução anticongelante em cada poço.Depois disso, armazene a placa a menos 20 graus Celsius. Para começar, encha alguns dos poços de uma placa fresca de 96 poços com 100 microliters de solução de lavagem. Transfira as seções a serem analisadas da placa de armazenamento para aquela que contém a solução de lavagem.Deixe as seções na solução de lavagem por 10 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, transfira cada seção para um poço vazio contendo a mesma solução de lavagem e repita a lavagem. Em seguida, adicione a solução de lavagem às seções e transfira-as para novos poços contendo 100 microliters de solução de bloqueio.Incubar em temperatura ambiente por pelo menos 90 minutos, e no máximo quatro horas. Diluir os anticorpos primários, anti-PGP9.5 e anti-5G4, na solução de trabalho. Transfira as seções para novos poços contendo 100 microlitadores da solução de trabalho dos anticorpos primários e incubar durante a noite à temperatura ambiente.No dia seguinte, lave as seções em poços contendo solução de lavagem como descrito anteriormente. Diluir os anticorpos secundários, anti-coelho de cabra para detectar PGP9.5 e anti-rato de cabra para detectar 5G4, na solução de trabalho. Transfira as seções lavadas para novos poços contendo 100 microliters da solução de trabalho dos anticorpos secundários.Cubra a placa com papel alumínio para evitar o branqueamento do fluorohore conjugado com anticorpos secundários e incubar à temperatura ambiente por 90 minutos. Depois disso, lave as seções duas vezes na solução de lavagem como descrito anteriormente. Transfira as seções lavadas para novos poços contendo 100 microliters de DAPI por cinco minutos em temperatura ambiente.Lave as seções duas vezes na solução de lavagem como descrito anteriormente. Em seguida, monte as seções em um slide na posição correta, evitando dobras erradas. Adicione algumas gotas de meio de montagem ao slide e cubra a seção com um deslizamento de cobertura.Deixe os slides secarem durante a noite. No dia seguinte, armazene os slides em uma caixa apropriada a quatro graus Celsius, certificando-se de evitar a exposição à luz. Usando um microscópio de fluorescência invertida ou um microscópio confocal, visualize as seções.Adquira as imagens por uma câmera conectada ao microscópio. Em seguida, use um microscópio de fluorescência ou um microscópio confocal para analisar sinais positivos em seções em termos de distribuição espacial e intensidade do sinal, conforme descrito no protocolo de texto. Seguindo o método descrito, os agregados de sinucleína alfa rotulados com anticorpo 5G4 são detectados em fascicles nervosos dérmicos inervando estruturas autônomas de pacientes com DP.A morfologia dos depósitos de sinucleína alfa aparece como um sinal pontilhado ao longo dos axônios dos nervos dérmicos. O uso representativo deste protocolo em 19 pacientes com DP e 17 controles em biópsias de pele em três locais anatômicos mostra que o 5G4 tem sensibilidade de 81% e uma especificidade de 86% quando comparado a controles saudáveis. A sinucleína alfa fosforilada tem uma sensibilidade de 56% e uma especificidade de 100%5G4 e depósitos alfa fosfoilados alfa sinucleína positivo são encontrados principalmente em torno de glândulas sudoríparas, mas também são encontrados em pili musculares, pequenos vasos e plexo subepidérmico e dérmico, mas nunca em fibras nervosas intraepidérmicas.Geralmente, dentro das glândulas sudoríparas lúmen, é possível observar um sinal inespecífico que poderia ser mal interpretado como 5G4 ou positividade alfa sinucleína fosforilada. Este tipo de sinal é pontilhado, esférico, e é provavelmente devido ao material autofluorescente intraluminal, como demonstrado em controles técnicos sem anticorpos primários e secundários. A colocalização com PGP9.5 que marca as fibras nervosas, que são morfologicamente filamentosas e alongadas, ajuda a identificar o sinal correto.Portanto, a especificidade do sinal 5G4 é altamente aumentada por um imunostaining duplo com um marcador axonal. Uma fixação precisa da biópsia é necessária para produzir uma coloração imunofluorescente de boa qualidade e para a interpretação confiável dos sinais fluorescentes. Se o fixador não estiver preparado corretamente, ou se ocorreu uma super-fixação, o resultado será uma alta autofluorescência que irá mascarar o sinal de fibras nervosas cruzando a junção dérmico-epidérmico, ou inerterar as principais estruturas dérmicas.A etapa mais crítica deste procedimento é a fixação tecidual. Preste atenção ao pH da solução fixativa PLP, e ao tempo de incubação, para evitar autofluorescência e um sinal específico.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Oral Administration of Rotenone using a Gavage and Image Analysis of Alpha-synuclein Inclusions in the Enteric Nervous System

Administração oral de rotenona usando um Gavage e Análise de Imagem de Alpha-sinucleína Inclusões no sistema nervoso entérico

In Parkinson's disease (PD) patients, the associated pathology follows a characteristic pattern involving inter alia the enteric nervous system (ENS) 1,2, ...

Neurociência

Selective Tracing of Auditory Fibers in the Avian Embryonic Vestibulocochlear Nerve

Rastreamento seletiva de fibras no nervo auditivo embrionário aviária Vestibulococlear

The embryonic chick is a widely used model for the study of peripheral and central ganglion cell projections. In the auditory system, selective labeling ...

Transplantation of Olfactory Ensheathing Cells to Evaluate Functional Recovery after Peripheral Nerve Injury

Transplante de células olfativas Ensheathing para avaliar a recuperação funcional após a lesão do nervo periférico

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory ...

Sequential Extraction of Soluble and Insoluble Alpha-Synuclein from Parkinsonian Brains

Extração seqüencial de solúveis e insolúveis alfa-sinucleína de Brains parkinsonianos

Alpha-synuclein (&#945;-syn) protein is abundantly expressed mainly within neurons, and exists in a number of different forms - monomers, tetramers, ...

Bioluminescence Imaging of Neuroinflammation in Transgenic Mice After Peripheral Inoculation of Alpha-Synuclein Fibrils

Imagem de bioluminescência de Neuroinflammation em Ratinhos Transgénicos Após inoculação periférica de alfa-sinucleína fibrilas

To study the prion-like behavior of misfolded alpha-synuclein, mouse models are needed that allow fast and simple transmission of alpha-synuclein ...

Identification of Dopamine D1-Alpha Receptor Within Rodent Nucleus Accumbens by an Innovative RNA In Situ Detection Technology

Identification of Dopamine D1-Alpha Receptor Within Rodent Nucleus Accumbens by an Innovative RNA In Situ Detection Technology

Identificação de Receptor de dopamina D1-alfa dentro roedores núcleo Accumbens por uma inovador RNA In Situ tecnologia da deteção

In the central nervous system, the D1-alpha subtype receptor (Drd1&#945;) is the most abundant dopamine (DA) receptor, which plays a vital role in ...

Exogenous Administration of Microsomes-associated Alpha-synuclein Aggregates to Primary Neurons As a Powerful Cell Model of Fibrils Formation

Administração exógena de agregados de microssomas associados alfa-synuclein para os neurônios primários como um modelo de célula poderosos de formação de fibrilas

For years, the inability of replicating formation of insoluble alpha-synuclein (&#945;S) inclusions in cell cultures has been a great limitation in the ...

Generation of Alpha-Synuclein Preformed Fibrils from Monomers and Use In Vivo

Geração de fibrilas pré-formadas Alpha-synuclein de monômeros e uso in vivo

Use of the in vivo alpha-synuclein preformed fibril (&#945;-syn PFF) model of synucleinopathy is gaining popularity among researchers aiming to model ...

Short-Term Free-Floating Slice Cultures from the Adult Human Brain

Culturas de fatias flutuantes de curto prazo do cérebro humano adulto

Organotypic, or slice cultures, have been widely employed to model aspects of the central nervous system functioning in vitro. Despite the potential of ...

Assessing Early Stage Open-Angle Glaucoma in Patients by Isolated-Check Visual Evoked Potential

Avaliação do glaucoma de ângulo aberto em estágio inicial em pacientes por um potencial visual evocado por verificação isolada

Recently, the isolated-check visual evoked potential (icVEP) technique was designed and has been reported to detect glaucomatous damage earlier and ...