Name: targeting alpha synuclein aggregates in cutaneous peripheral nerve fibers by free-floating immunofluorescence assay
Uploaded: 2019-06-25T13:30:00
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Agradecemos a Parkinson Schweiz y ABREOC (el Consejo Asesor de Investigación Científica del Ente Ospedaliero Cantonale) por su apoyo financiero a este estudio.

El protocolo ha sido aprobado por el Comité Cantonal de ética y todos los sujetos inscritos dieron su consentimiento informado por escrito al estudio.
1. Colección de biopsia de piel
<ol><li>Permita que un médico calificado realice la biopsia de piel en un entorno clínico adecuado.</li>
	<li>Elija el área para realizar la biopsia de piel y límpiela con un hisopo de alcohol.</li>
	<li>Preparar la solución anestésica con 1 cc de lidocaína 2%.</li>
	<li>Con la aguja paralela a la zona...

<ol>
	<li>McArthur, J. C., Griffin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Another+Tool+for+the+neurologist's+Tollbox.">Another Tool for the neurologist's Tollbox.</a> Annals of Neurology. 57, 163-167 (2005).</li><li>Wilkinson, P. F., Millington, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Skin. , 49-50 (2009).</li><li>Weddell, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+endings+in+mammalian+skin.">Nerve endings in mammalian skin.</a> Biological reviews of the Cambridge Philosophical Society. 30, 159-195 (1954).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+gene+product+9.5-immunoreactve+nerve+fibers+and+cells+in+human+skin.">Protein gene product 9.5-immunoreactve nerve fibers and cells in human skin.</a> Cell and Tissue Research. 261 (1), 25-33 (1990).</li><li>Holland, N. 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Report of a joint task force of the European Federation of Neurological Societies and the Peripheral Nerve Society.</a> European Journal of Neurology. 17, 903-912 (2010).</li><li>Provitera, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multi-center,+multinational+age-+and+gender-adjusted+normative+dataset+for+immunofluorescent+intraepidermal+nerve+fiber+density+at+the+distal+leg.">A multi-center, multinational age- and gender-adjusted normative dataset for immunofluorescent intraepidermal nerve fiber density at the distal leg.</a> European Journal of Neurology. 23, 333-338 (2016).</li><li>Wakabayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+the+peripheral+nervous+system+in+synucleinopathies,+tauopathies+and+other+neurodegenerative+proteinopathies+of+the+brain.">Involvement of the peripheral nervous system in synucleinopathies, tauopathies and other neurodegenerative proteinopathies of the brain.</a> Acta Neuropathology. 120, 1-12 (2010).</li><li>Ruffmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+alpha-synuclein+conformational+variants+from+gastro-intestinal+biopsy+tissue+as+a+potential+biomarker+for+Parkinson's+disease.">Detection of alpha-synuclein conformational variants from gastro-intestinal biopsy tissue as a potential biomarker for Parkinson's disease.</a> Neuropathology and Applied Neurobiology. 44 (7), 722-736 (2018).</li><li>Lee, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+search+for+a+peripheral+biopsy+indicator+of+alpha-synuclein+pathology+for+Parkinson+Disease.">The search for a peripheral biopsy indicator of alpha-synuclein pathology for Parkinson Disease.</a> Journal of Neuropathology &amp; Experimental Neurology. 76, 2-15 (2017).</li><li>Donadio, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+nerve+misfolded+alpha-synuclein+in+pure+autonomic+failure+and+Parkinson+disease.">Skin nerve misfolded alpha-synuclein in pure autonomic failure and Parkinson disease.</a> Annals of Neurology. 79, 306-316 (2016).</li><li>Doppler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutaneous+neuropathy+in+Parkinson's+disease:+a+window+into+brain+pathology.">Cutaneous neuropathy in Parkinson's disease: a window into brain pathology.</a> Acta Neuropathologica. 128, 99-109 (2014).</li><li>Zange, L., Noack, C., Hahn, K., Stenzel, W., Lipp, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylated+alpha-synuclein+in+skin+nerve+fibres+differentiates+Parkinson's+disease+from+multiple+system+atrophy.">Phosphorylated alpha-synuclein in skin nerve fibres differentiates Parkinson's disease from multiple system atrophy.</a> Brain. 138, 2310-2321 (2015).</li><li>Braak, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staging+of+brain+pathology+related+to+sporadic+Parkinson's+disease.">Staging of brain pathology related to sporadic Parkinson's disease.</a> Neurobiology of Aging. 24, 197-211 (2003).</li><li>Doppler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dermal+phospho-alpha-synuclein+deposits+confirm+REM+sleep+behaviour+disorder+as+prodromal+Parkinson's+disease.">Dermal phospho-alpha-synuclein deposits confirm REM sleep behaviour disorder as prodromal Parkinson's disease.</a> Acta Neuropathologica. 133 (4), 535-545 (2017).</li><li>Antelmi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+nerve+phosphorylated+&#945;-synuclein+deposits+in+idiopathic+REM+sleep+behavior+disorder.">Skin nerve phosphorylated &#945;-synuclein deposits in idiopathic REM sleep behavior disorder.</a> Neurology. 88 (22), 2128-2131 (2017).</li><li>Nolano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+fiber+pathology+parallels+disease+progression+in+Parkinson+disease:+a+longitudinal+study.">Small fiber pathology parallels disease progression in Parkinson disease: a longitudinal study.</a> Acta Neuropathologica. , (2018).</li><li>Melli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cervical+skin+denervation+associates+with+alpha-synuclein+aggregates+in+Parkinson+disease.">Cervical skin denervation associates with alpha-synuclein aggregates in Parkinson disease.</a> Annals of Clinical and Translational Neurology. 5, 1394-1407 (2018).</li><li>Kovacs, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+processing+of+disease-associated+alpha-synuclein+in+the+human+brain+suggests+prion-like+cell-to-cell+spread.">Intracellular processing of disease-associated alpha-synuclein in the human brain suggests prion-like cell-to-cell spread.</a> Neurobiology Disease. 69, 76-92 (2014).</li><li>Kovacs, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+antibody+with+high+reactivity+for+disease-associated+alpha-synuclein+reveals+extensive+brain+pathology.">An antibody with high reactivity for disease-associated alpha-synuclein reveals extensive brain pathology.</a> Acta Neuropathologica. 124, 37-50 (2012).</li></ol>

Describimos un ensayo de inmunofluorescencia flotante para biopsias de piel para el diagnóstico de DP: explota la inmunomancha doble con anticuerpo anti-PGP9.5, un marcador panaxonal y anti-5G4, un anticuerpo específico de conformación que reconoce la forma agregada de Syn.
Las grandes ventajas de la biopsia de piel con fines diagnósticos en DP y posiblemente en otros trastornos de la conformación de proteínas son: 1) el acceso directo al tejido nervioso propenso a la enfermedad mediante...

La biopsia de piel ha adquirido una gran importancia como herramienta de diagnóstico e investigación en el campo de los trastornos neurológicos1. De hecho, la epidermis y la dermis contienen abundantes fibras nerviosas sensoriales somáticas (mielinizadas y no mielinizadas), terminaciones nerviosas libres nociceptivas, receptores sensoriales e inervación autonómica de glándulas sudoríparas, vasos, glándulas sebáceas y arrector muscular pilorum 2.
A mediados del siglo XX, la configuración de la inmunohistoquímica del anticuerpo PGP9.5 permitió la evidencia de una extensa ertración de la piel de mamífero de epidermis humana3. PGP9.5 es una hidrolasa carboxilo-terminal distribuida equitativamente a lo largo de los axones del sistema nervioso central y periférico (PNS). La disponibilidad de este anticuerpo permitió no sólo aclarar la morfología y anatomía del PNS en la piel, sino que también implementó el estudio de enfermedades asociadas a él3,4. La biopsia de piel contribuyó a definir una nueva entidad clínica: la neuropatía de fibra pequeña. Varios grupos internacionales demostraron la asociación entre la pérdida de fibras nerviosas intraepidérmicas y los síntomas/signos de la neuropatía de fibra pequeña5 mediante el análisis de biopsia de piel y proporcionaron protocolos estandarizados para la morfometría nerviosa, así como valores de referencia normativaqueales que se utilizarán en la práctica clínica6,7,8.
Recientemente una gran cantidad de evidencia ha demostrado que las enfermedades neurodegenerativas, caracterizadas por acumulacionesde proteínas mal plegadas en el sistema nervioso central, son patologías multisistema 9. De hecho, la DP se caracteriza por la acumulación de Sinyn en la neurona dopaminérgica de la sustancia nigra,pero se ha demostrado que el syn y su forma patológica, fosforilado sinyn (P-Syn), podrían ser detectados también en los tejidos periféricos. Mucosa gastro-intestinal10, glándulas salivales11, fibras autonómicas de la piel que rodean las glándulas sudoríparas y los músculos pilomotor12,13,14, muestran inmunorreactividad a las formas patógenas de la sinía, en de acuerdo con la hipótesis de Braak de que intrigantemente postular que la patología de La Sinis puede comenzar en PNS con mucha antelación, antes de su acumulación en el cerebro15. Además, se ha demostrado la presencia de p-Syn en los nervios de la piel de pacientes con Trastornos del Comportamiento REM que se consideran PD16prodrómico,17 por lo tanto patológico de la piel - Syn puede ser considerado un prometedor periférico temprano periférico marcador histopatológico de la sinucleinopatía.
La asociación de la neuropatía de fibra pequeña en la DP se ha demostrado previamente y se ha encontrado que la densidad de las fibras nerviosas intraepidémicas refleja la progresión de la enfermedad18,19. Por lo tanto, la biopsia de piel es una herramienta útil para estudiar la neurodegeneración en PD y para establecer un diagnóstico histopatológico premortem de la enfermedad. De hecho, la biopsia de piel tiene una gran ventaja de ser un procedimiento fácilmente accesible y mínimamente invasivo, permitiendo el análisis de tejido nervioso propenso a la patología. Finalmente, la posibilidad de repetir la biopsia de piel en el curso del seguimiento de los mismos pacientes permite estudiar la correlación longitudinal con la progresión de la enfermedad.
En nuestro laboratorio, explotando una doble inmuno-mancha con PGP9.5 y el anticuerpo monoclonal 5G4 específico de la conformación, que reconoce las formas específicas de la enfermedad de Syn incluyendo pequeños agregados20,21, pudimos mostrar el presencia de agregados de la piel con una alta eficiencia diagnósticaprometedora 19. El análisis de inmunofluorescencia de la biopsia de piel en enfermedades conformacionales destaca como una fuente prometedora de biomarcadores al combinar tanto la detección de agregados proteicos como la medida de la neurodegeneración in vivo. A partir de ahora, ilustramos un protocolo fácil y versátil sobre el manejo de la biopsia de piel y la realización de la tinción de inmunofluorescencia flotante para detectar agregados de Syn. Además, este protocolo se puede adaptar para atacar cualquier otra proteína de interés expresada en el PNS de la piel.
El siguiente protocolo de estudio se ha utilizado para evaluar la utilidad diagnóstica del análisis agregado de Syn en el PNS de la DP mediante biopsia de piel19. Los criterios de inclusión para la DP fueron: un diagnóstico clínico definitivo de acuerdo con los criterios de diagnóstico del Banco del Cerebro del Reino Unido, duración de la enfermedad al menos 3 años, sin antecedentes familiares y sin deterioro cognitivo importante o síntomas disautonómicos importantes en la historia. Los criterios de exclusión eran causas conocidas de neuropatía (hemoglobina glicada, creatinina, vitamina B12, TSH, inmunofijación sérica, VIH, VHC, sífilis y borreliosis). Cada sujeto se sometió a biopsias cutáneas de 3 mm de diámetro en tres sitios anatómicos (cuello a nivel dermatómico C8, muslo 10 cm por encima de la rodilla, pierna 10 cm por encima del maléolo lateral) en el lado, que fue clínicamente más afectado. En general, el siguiente protocolo trata de manejar la biopsia de piel y realizar la tinción y análisis de inmunofluorescencia flotante. Por lo tanto, se puede adaptar y utilizar para la detección de otras proteínas de interés en el tejido de la piel.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:964px;" width="964">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:264px;">5G4 (anti human &#945;Syneclein 5G4)</td>
			<td style="width:161px;">Analytik Jena Roboscreen</td>
			<td style="width:344px;">847-0102004001</td>
			<td style="width:195px;">Mouse monoclonal&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">AlexaFluor 488 Goat anti Rabbit IgG&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1971418</td>
			<td>2mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">AlexaFluor 594 Goat anti Mouse IgG&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1922849</td>
			<td>2mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Disodium hydrogen phosphate solution</td>
			<td>Merk Millipore</td>
			<td>106586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ethylene Glycol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>324558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Lysine monohydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L5626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Aldrich Chemistry</td>
			<td>441244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:264px;">PGP9.5</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab15503</td>
			<td>Rabbit polyclonal</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodium Dihydrogen Phosphate Monohydrate</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>106346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodium (meta)periodate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trizma Base</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tryton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Vectashield&#160;</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td>Mounting medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

targeting alpha synuclein aggregates in cutaneous peripheral nerve fibers by free-floating immunofluorescence assay

Hasta la fecha, para la mayoría de las enfermedades neurodegenerativas sólo se dispone de un diagnóstico definitivo histopatológico post mortem. Para la enfermedad de Parkinson (PD), el diagnóstico todavía se basa sólo en los signos clínicos de afectación motora que aparecen más adelante en el curso de la enfermedad, cuando la mayoría de las neuronas dopaminérgicas ya se han perdido. Por lo tanto, existe una fuerte necesidad de un biomarcador que pueda identificar a los pacientes al comienzo de la enfermedad o a riesgo de desarrollarla. En los últimos años, la biopsia de piel ha demostrado ser una excelente herramienta de investigación y diagnóstico para enfermedades de los nervios periféricos como la neuropatía de fibra pequeña. Curiosamente, una pequeña neuropatía de fibra y depósitos neuronales alfa de sinucleína (Syn) se han demostrado mediante biopsia de piel en pacientes con DP. De hecho, la biopsia de piel tiene la gran ventaja de ser un procedimiento fácilmente accesible, mínimamente invasivo e indoloro que permite el análisis de tejido nervioso periférico propenso a la patología. Además, la posibilidad de repetir la biopsia de piel en el curso del seguimiento del mismo paciente permite estudiar la correlación longitudinal con la progresión de la enfermedad. Creamos un protocolo estandarizado y confiable para investigar la presencia de agregados de Syn en las fibras nerviosas de la piel del paciente con DP. Este protocolo implica algunos pasos cortos de fijación, un corte criotomo y luego una doble tinción de inmunofluorescencia flotante con dos anticuerpos específicos: anti Protein Gene Product 9.5 (PGP9.5) para marcar las fibras nerviosas cutáneas y anti 5G4 para detectar Agregados de Syn. Es un protocolo versátil, sensible y fácil de realizar que también se puede aplicar para apuntar a otras proteínas de interés en los nervios de la piel. La capacidad de marcar los agregados de La sinción es otro paso adelante en el uso de la biopsia de piel como herramienta para establecer un diagnóstico histopatológico premortem de DP.

Siguiendo el procedimiento descrito (Figura1), detectamos los agregados de Syn, etiquetados con anticuerpo 5G4, en fascículos nerviosos dérmicos que inercen estructuras autonómicas de pacientes con DP. La morfología de los depósitos de alfa-sinucleína aparece como una señal punteada a lo largo de los axónicos de los nervios dérmicos (Figura2). De hecho, aprovechando este protocolo en 19 pacientes con DP y 17 controles en biopsias de piel en tres sitios ...

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Targeting Alpha Synuclein Aggregates in Cutaneous Peripheral Nerve Fibers by Free-floating Immunofluorescence Assay

Aquí, presentamos un protocolo para un ensayo de inmunofluorescencia indirecta de flotación libre en secciones de biopsia de piel que permite la identificación de variantes de conformación específicas de la enfermedad de la sinucleína alfa implicadas en la enfermedad de Parkinson y múltiples proteínas de la sistema nervioso periférico.

Dirigido a agregados de alfa sinucleína en fibras nerviosas periféricas cutáneas por el ensayo de inmunofluorescencia de flotación libre

To date, for most neurodegenerative diseases only a post-mortem histopathological definitive diagnosis is available. For Parkinson&#39;s disease (PD), the ...

El diagnóstico de la enfermedad de Parkinson todavía se basa en signos clínicos de afectación motora que aparecen más adelante en el curso de la enfermedad, cuando la mayoría de las neuronas de la sustancia nigra ya están perdidas. Este protocolo permite que el análisis de los nervios dérmicos mediante biopsia de piel, que representa un posible nuevo biomarcador de la enfermedad, se utilice en ensayos clínicos. La biopsia de piel es un procedimiento fácilmente evaluable y no invasivo que permite el análisis del tejido nervioso periférico que es propenso a la patología.La detección de agregados de alfa sinucleína mediante biopsia de piel se puede utilizar con fines de diagnóstico, posiblemente en fases tempranas, cuando la cura potencial es más eficaz. Las biopsias cutáneas de seguimiento en el mismo paciente permiten un análisis de tiempo y curso especial de la propagación agregada de sinucleína alfa en el sistema nervioso cutáneo humano. Estos pueden arrojar luz sobre la patogénesis de la enfermedad.Para comenzar este procedimiento, prepare una nueva solución fijativa plP como se describe en la Tabla Uno del protocolo de texto. Inmediatamente después de recoger la biopsia de piel, sumerja en un tubo que contenga 10 mililitros de la solución fijadora. Incubar durante la noche a cuatro grados centígrados.Al día siguiente, en una campana de humos, retire suavemente el fijador PLP. En el mismo tubo, lave la biopsia tres veces durante cinco minutos cada una, utilizando cinco mililitros de solución de Sorensen molar 0.1 para cada lavado. Deseche la solución de Sorensen y añada cinco mililitros de solución crioprotectora.Incubar durante la noche a cuatro grados centígrados. Al día siguiente, guarde la biopsia a cuatro grados centígrados si el corte con un criotomo se va a realizar dentro de una semana. Primero, pon el criotomo a menos 20 grados centígrados.Toma una lloron y llénala con un medio de crio-embedding. Usando pinzas, sumerja la biopsia en el medio crio-embedding, con el eje longitudinal paralelo a la parte inferior de la crioomold. Enganche la muestra con nitrógeno líquido, para obtener un cubo sólido de medio crio-embedding que contiene la biopsia en la orientación correcta.Ponga la muestra en el criostato y espere 30 minutos para permitir que la biopsia se aclimate. A continuación, fije la muestra en el criostato y corte en secciones de 50 micrómetros. Con un cepillo pequeño, transfiera las secciones criosquetas a una placa de 96 pozos que contenga 200 microlitros de solución anticongelante en cada pozo.Después de esto, guarde la placa a menos 20 grados centígrados. Para empezar, llene algunos de los pozos de una placa fresca de 96 pozos con 100 microlitros de solución de lavado. Transfiera las secciones a analizar desde la placa de almacenamiento a la que contiene la solución de lavado.Dejar las secciones en la solución de lavado durante 10 minutos a temperatura ambiente. A continuación, transfiera cada sección a un pozo vacío que contenga la misma solución de lavado y repita el lavado. A continuación, agregue la solución de lavado a las secciones y transfiéralas a nuevos pozos que contengan 100 microlitros de solución de bloqueo.Incubar a temperatura ambiente durante al menos 90 minutos, y un máximo de cuatro horas. Diluir los anticuerpos primarios, anti-PGP9.5 y anti-5G4, en la solución de trabajo. Transfiera las secciones a nuevos pozos que contengan 100 microlitros de la solución de trabajo de los anticuerpos primarios, e incubar durante la noche a temperatura ambiente.Al día siguiente, lave las secciones en pozos que contengan solución de lavado como se describió anteriormente. Diluir los anticuerpos secundarios, Cabra anti-Conejo para detectar PGP9.5, y Cabra anti-Ratón para detectar 5G4, en la solución de trabajo. Transfiera las secciones lavadas a nuevos pozos que contengan 100 microlitros de la solución de trabajo de los anticuerpos secundarios.Cubra la placa con papel de aluminio para evitar el blanqueo de fluoróforos conjugados con anticuerpos secundarios, e incubar a temperatura ambiente durante 90 minutos. Después de esto, lave las secciones dos veces en la solución de lavado como se describió anteriormente. Transfiera las secciones lavadas a nuevos pozos que contengan 100 microlitros de DAPI durante cinco minutos a temperatura ambiente.Lave las secciones dos veces en la solución de lavado como se describió anteriormente. A continuación, monte las secciones en una diapositiva en la posición correcta, evitando el mal deslizamiento. Agregue unas gotas de medio de montaje a la corredera y cubra la sección con un resbalón de cubierta.Deje que los portaobjetos se sequen durante la noche. Al día siguiente, guarde los portaobjetos en una caja apropiada a cuatro grados centígrados, asegurándose de evitar la exposición a la luz. Con un microscopio de fluorescencia invertido o un microscopio confocal, vea las secciones.Adquiera las imágenes mediante una cámara conectada al microscopio. A continuación, utilice un microscopio de fluorescencia o un microscopio confocal para analizar señales positivas en secciones en términos de distribución espacial e intensidad de la señal como se describe en el protocolo de texto. Siguiendo el método descrito, los agregados de alfa sinucleina etiquetados con anticuerpos 5G4 se detectan en las estructuras autonómicas de los pacientes con DP de fascículos del nervio dérmico.La morfología de los depósitos de alfa sinucleína aparece como una señal punteada a lo largo de los axones de los nervios dérmicos. El uso representativo de este protocolo en 19 pacientes con DP y 17 controles en biopsias de piel en tres sitios anatómicos muestra que 5G4 tiene una sensibilidad del 81% y una especificidad del 86% en comparación con controles saludables. La sinucleína alfa fosforilada tiene una sensibilidad del 56% y una especificidad de 100%5G4 y los depósitos fosforilados alfa sinucleína positivos se encuentran principalmente alrededor de las glándulas sudoríparas, pero también se encuentran en el pili arrector muscular, vasos pequeños, y el plexo subepidérmico y dérmico, pero nunca en las fibras nerviosas intraepidérmicas.Generalmente, dentro de las glándulas sudoríparas lumen, es posible observar una señal no específica que podría ser malinterpretada como 5G4 o positividad de la sinucleína alfa fosforilada. Este tipo de señal es punteada, esférica, y lo más probable es que se deba al material autofluorescente intraluminal como se demuestra en controles técnicos sin anticuerpos primarios y secundarios. La colocación con PGP9.5 que marca las fibras nerviosas, que morfológicamente son filamentosas y alargadas, ayuda a identificar la señal correcta.Por lo tanto, la especificidad de la señal 5G4 se incrementa en gran medida por una doble inmunosumanidad con un marcador axonal. Una fijación precisa de la biopsia es necesaria para producir una tinción inmunofluorescente de buena calidad y para la interpretación confiable de las señales fluorescentes. Si el fijador no está preparado correctamente, o si se ha producido una sobre-fijación, el resultado será una alta autofluorescencia que enmascarará la señal de las fibras nerviosas que cruzan la unión dérmica-epidérmica, o invadirá las estructuras dérmicas principales.El paso más crítico de este procedimiento es la fijación del tejido. Preste atención al pH de la solución fijadora PLP, y el momento de la incubación, para evitar la autofluorescencia y una señal específica.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Oral Administration of Rotenone using a Gavage and Image Analysis of Alpha-synuclein Inclusions in the Enteric Nervous System

La administración oral de la rotenona con una sonda y Análisis de Imágenes de la alfa-sinucleína inclusiones en el sistema nervioso entérico

In Parkinson's disease (PD) patients, the associated pathology follows a characteristic pattern involving inter alia the enteric nervous system (ENS) 1,2, ...

Investigación

Neurociencias

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Rastreo Selectivo de Fibras auditivo en el nervio vestíbulo coclear aviar embrionarias

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