Name: targeting alpha synuclein aggregates in cutaneous peripheral nerve fibers by free-floating immunofluorescence assay
Uploaded: 2019-06-25T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Targeting Alpha Synuclein Aggregates in Cutaneous Peripheral Nerve Fibers by Free-floating Immunofluorescence Assay at JoVE.com

Vi tackar Parkinson Schweiz och ABREOC (den vetenskapliga forsknings råd givande nämnden för Ente Ospedaliero Cantonale) för deras ekonomiska stöd för denna studie.

Protokollet har godkänts av kantonala etik kommittén och alla inskrivna försöks personer gav skriftligt informerat samtycke till studien.
1. hudbiopsi samling
<ol><li>Låt en kvalificerad läkare utföra hudbiopsi i en lämplig klinisk miljö.</li>
	<li>Välj området för att utföra hudbiopsi och rengör den med en spritsudd.</li>
	<li>Bered bedövnings lösningen med 1 cc lidokain 2%.</li>
	<li>Med nålen parallellt med området, injicera lokal bedövning subkutant.</li>
	<li>Efter at...

<ol>
	<li>McArthur, J. C., Griffin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Another+Tool+for+the+neurologist's+Tollbox.">Another Tool for the neurologist's Tollbox.</a> Annals of Neurology. 57, 163-167 (2005).</li><li>Wilkinson, P. F., Millington, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Skin. , 49-50 (2009).</li><li>Weddell, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+endings+in+mammalian+skin.">Nerve endings in mammalian skin.</a> Biological reviews of the Cambridge Philosophical Society. 30, 159-195 (1954).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+gene+product+9.5-immunoreactve+nerve+fibers+and+cells+in+human+skin.">Protein gene product 9.5-immunoreactve nerve fibers and cells in human skin.</a> Cell and Tissue Research. 261 (1), 25-33 (1990).</li><li>Holland, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraepidermal+nerve+fiber+density+in+patients+with+painful+sensory+neuropathy.">Intraepidermal nerve fiber density in patients with painful sensory neuropathy.</a> Neurology. 48, 708-711 (1997).</li><li>McArthur, J. C., Stocks, E. A., Hauer, P., Cornblath, D. R., Griffin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+nerve+fiber+density:+normative+reference+range+and+diagnostic+efficiency.">Epidermal nerve fiber density: normative reference range and diagnostic efficiency.</a> Archives of Neurology. 55 (12), 1513-1520 (1998).</li><li>Lauria, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=European+Federation+of+Neurological+Societies/Peripheral+Nerve+Society+Guideline+on+the+use+of+skin+biopsy+in+the+diagnosis+of+small+fiber+neuropathy.+Report+of+a+joint+task+force+of+the+European+Federation+of+Neurological+Societies+and+the+Peripheral+Nerve+Society.">European Federation of Neurological Societies/Peripheral Nerve Society Guideline on the use of skin biopsy in the diagnosis of small fiber neuropathy. Report of a joint task force of the European Federation of Neurological Societies and the Peripheral Nerve Society.</a> European Journal of Neurology. 17, 903-912 (2010).</li><li>Provitera, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multi-center,+multinational+age-+and+gender-adjusted+normative+dataset+for+immunofluorescent+intraepidermal+nerve+fiber+density+at+the+distal+leg.">A multi-center, multinational age- and gender-adjusted normative dataset for immunofluorescent intraepidermal nerve fiber density at the distal leg.</a> European Journal of Neurology. 23, 333-338 (2016).</li><li>Wakabayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+the+peripheral+nervous+system+in+synucleinopathies,+tauopathies+and+other+neurodegenerative+proteinopathies+of+the+brain.">Involvement of the peripheral nervous system in synucleinopathies, tauopathies and other neurodegenerative proteinopathies of the brain.</a> Acta Neuropathology. 120, 1-12 (2010).</li><li>Ruffmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+alpha-synuclein+conformational+variants+from+gastro-intestinal+biopsy+tissue+as+a+potential+biomarker+for+Parkinson's+disease.">Detection of alpha-synuclein conformational variants from gastro-intestinal biopsy tissue as a potential biomarker for Parkinson's disease.</a> Neuropathology and Applied Neurobiology. 44 (7), 722-736 (2018).</li><li>Lee, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+search+for+a+peripheral+biopsy+indicator+of+alpha-synuclein+pathology+for+Parkinson+Disease.">The search for a peripheral biopsy indicator of alpha-synuclein pathology for Parkinson Disease.</a> Journal of Neuropathology &amp; Experimental Neurology. 76, 2-15 (2017).</li><li>Donadio, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+nerve+misfolded+alpha-synuclein+in+pure+autonomic+failure+and+Parkinson+disease.">Skin nerve misfolded alpha-synuclein in pure autonomic failure and Parkinson disease.</a> Annals of Neurology. 79, 306-316 (2016).</li><li>Doppler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutaneous+neuropathy+in+Parkinson's+disease:+a+window+into+brain+pathology.">Cutaneous neuropathy in Parkinson's disease: a window into brain pathology.</a> Acta Neuropathologica. 128, 99-109 (2014).</li><li>Zange, L., Noack, C., Hahn, K., Stenzel, W., Lipp, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylated+alpha-synuclein+in+skin+nerve+fibres+differentiates+Parkinson's+disease+from+multiple+system+atrophy.">Phosphorylated alpha-synuclein in skin nerve fibres differentiates Parkinson's disease from multiple system atrophy.</a> Brain. 138, 2310-2321 (2015).</li><li>Braak, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staging+of+brain+pathology+related+to+sporadic+Parkinson's+disease.">Staging of brain pathology related to sporadic Parkinson's disease.</a> Neurobiology of Aging. 24, 197-211 (2003).</li><li>Doppler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dermal+phospho-alpha-synuclein+deposits+confirm+REM+sleep+behaviour+disorder+as+prodromal+Parkinson's+disease.">Dermal phospho-alpha-synuclein deposits confirm REM sleep behaviour disorder as prodromal Parkinson's disease.</a> Acta Neuropathologica. 133 (4), 535-545 (2017).</li><li>Antelmi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+nerve+phosphorylated+&#945;-synuclein+deposits+in+idiopathic+REM+sleep+behavior+disorder.">Skin nerve phosphorylated &#945;-synuclein deposits in idiopathic REM sleep behavior disorder.</a> Neurology. 88 (22), 2128-2131 (2017).</li><li>Nolano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+fiber+pathology+parallels+disease+progression+in+Parkinson+disease:+a+longitudinal+study.">Small fiber pathology parallels disease progression in Parkinson disease: a longitudinal study.</a> Acta Neuropathologica. , (2018).</li><li>Melli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cervical+skin+denervation+associates+with+alpha-synuclein+aggregates+in+Parkinson+disease.">Cervical skin denervation associates with alpha-synuclein aggregates in Parkinson disease.</a> Annals of Clinical and Translational Neurology. 5, 1394-1407 (2018).</li><li>Kovacs, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+processing+of+disease-associated+alpha-synuclein+in+the+human+brain+suggests+prion-like+cell-to-cell+spread.">Intracellular processing of disease-associated alpha-synuclein in the human brain suggests prion-like cell-to-cell spread.</a> Neurobiology Disease. 69, 76-92 (2014).</li><li>Kovacs, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+antibody+with+high+reactivity+for+disease-associated+alpha-synuclein+reveals+extensive+brain+pathology.">An antibody with high reactivity for disease-associated alpha-synuclein reveals extensive brain pathology.</a> Acta Neuropathologica. 124, 37-50 (2012).</li></ol>

Vi beskriver en fritt flytande immunofluorescens test för hudbiopsier för diagnos av PD: det utnyttjar dubbel immunofärgning med anti-PGP 9.5 anti kropp, en panaxonal markör, och anti-5G4, en kon formation specifik anti kropp som erkänner den aggregerade formen av αSyn.
De stora fördelarna med hudbiopsi för diagnostiskt syfte i PD och möjligen i andra proteiner kon Formations rubbningar är: 1) direkt till gång till nervvävnad benägna att sjukdomen genom en milt invasiv teknik och ...

Hudbiopsi har fått en stor betydelse som diagnostiska och forsknings verktyg inom området neurologiska sjukdomar1. I själva verket innehåller epidermis och dermis rikliga somatiska sensoriska nerv fibrer (myeliniserade och unmyelinated), nociceptiva fria nerv ändar, sensoriska receptorer och autonom innervation av svett körtlar, fartyg, talgkörtlar och muskel arrector pilorum och 2.
I mitten av 20- talet, den setup för immunhistokemi av PGP 9.5 anti kropp tillät bevis på en omfattande innervation av mänskliga epidermis däggdjur hud3. PGP 9.5 är en carboxyl-Terminal hydrolas jämnt fördelad längs axoner av både centrala och perifera nerv systemet (PNS). Tillgängligheten av denna anti kropp tillät inte bara att klargöra morfologi och anatomi PNS i huden utan också genomfört studiet av sjukdomar i samband med det3,4. Hudbiopsi bidrog till att definiera en ny klinisk enhet: den lilla fiber neuropati. Flera internationella grupper visade sambandet mellan förlusten av intraepidermal nerv fibrer och symtom/tecken på små fiber neuropati5 av hudbiopsi analys och förutsatt standardiserade protokoll för nervmorphometry samt normativa referensvärden som skall användas i den kliniska praxisen6,7,8.
Nyligen en stor mängd bevis har visat att neurodegenerativa sjukdomar, som kännetecknas av felvikt protein ackumulationer i centrala nerv systemet, är flera system patologier9. I själva verket kännetecknas PD av αSyn ackumulering i dopaminerga neuron i substantia nigra, men det har visats att αsyn och dess patologisk form, fosforylerade αsyn (P-αsyn), kunde upptäckas också i perifera vävnader. Gastrointestinalt slem hinna10, saliv körtlar11, hud autonoma fibrer som omger svett körtlar och pilomotor muskler12,13,14, Visa immunoreaktivitet mot patogena former av αsyn, i enlighet med Braak hypotes som spännande postulat att αsyn patologi kan börja i PNS i god tid, innan dess ackumulering i hjärnan15. Vidare har förekomsten av p-αsyn påvisats i hud nerver hos patienter med rem-beteende störningar som anses prodromala PD16,17 på så sätt kan hudpatologiskt αsyn anses vara en lovande tidig perifer histopatologisk markör för synucleinopati.
Föreningen av små fiber neuropati i PD har visats tidigare och det har kon stater ATS att intraepidermal nerv fibrer densitet återspeglar sjukdomsprogression18,19. Därför är hudbiopsi ett användbart verktyg för att studera neurodegeneration i PD och för att etablera en pre-mortem histopatologisk diagnos av sjukdomen. I själva verket har hudbiopsi en stor fördel av att vara en lättillgänglig och minimalt invasiva förfarande, vilket gör att analysen av nervvävnad benägna att patologin. Slutligen, möjligheten att upprepa hudbiopsi i samband med uppföljning av samma patienter gör det möjligt att studera den längsgående korrelation med sjukdomsprogression.
I vårt laboratorium, utnyttja en dubbel immuno-färgning med PGP 9.5 och kon formation specifika monoklonala 5g4 anti kropp, som erkänner sjukdomsspecifika former av αsyn inklusive små aggregat20,21, kunde vi Visa den förekomst av αSyn aggregat i hudens nerver med en lovande hög diagnostisk verknings grad19. Immunofluorescens analys av hudbiopsi i överensstämningssjukdomar framstår som en lovande källa till bio markörer genom att kombinera både upptäckten av protein aggregat och måttet på neurodegeneration in vivo. Härefter illustrerar vi ett enkelt och mångsidigt protokoll om hantering av hudbiopsi och utförande av fritt flytande immunofluorescens-färgning för detektion av αSyn-aggregat. Dessutom kan detta protokoll anpassas för att inrikta sig på alla andra intresse proteiner som uttrycks i hud-PNS.
Följande studie protokoll har använts för att utvärdera diagnos nyttan av aggregerad αSyn-analys i PNS för PD med hudbiopsi19. Inklusionskriterier för PD var: en definitiv klinisk diagnos enligt den brittiska Brain Bank diagnostiska kriterier, sjukdoms tid minst 3 år, ingen släkt historia, och ingen större kognitiv svikt eller stora dysautonomiska symptom i historien. Uteslutnings kriterier var kända orsaker till neuropati (glycated hemoglobin, kreatinin, vitamin B12, TSH, serum immunofixation, HIV, HCV, syfilis, och borrelios). Varje ämne genomgick 3 mm-diameter hudbiopsier på tre anatomiska platser (hals på C8 dermatomal nivå, lår 10 cm ovanför knäet, benet 10 cm över laterala fotled olus) på sidan, som var kliniskt mer drabbade. I allmänhet är följande protokoll om hantering av hudbiopsi och utföra fritt flytande immunofluorescens färgning och analys. Därför kan det anpassas och användas för att upptäcka andra proteiner av intresse för hud vävnad.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:964px;" width="964">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:264px;">5G4 (anti human &#945;Syneclein 5G4)</td>
			<td style="width:161px;">Analytik Jena Roboscreen</td>
			<td style="width:344px;">847-0102004001</td>
			<td style="width:195px;">Mouse monoclonal&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">AlexaFluor 488 Goat anti Rabbit IgG&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1971418</td>
			<td>2mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">AlexaFluor 594 Goat anti Mouse IgG&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1922849</td>
			<td>2mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Disodium hydrogen phosphate solution</td>
			<td>Merk Millipore</td>
			<td>106586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ethylene Glycol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>324558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Lysine monohydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L5626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Aldrich Chemistry</td>
			<td>441244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:264px;">PGP9.5</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab15503</td>
			<td>Rabbit polyclonal</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodium Dihydrogen Phosphate Monohydrate</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>106346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodium (meta)periodate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trizma Base</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tryton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Vectashield&#160;</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td>Mounting medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

targeting alpha synuclein aggregates in cutaneous peripheral nerve fibers by free-floating immunofluorescence assay

Hittills, för de flesta neurodegenerativa sjukdomar endast en obduktion histopatologisk definitiv diagnos är tillgänglig. För Parkinsons sjukdom (PD), diagnosen fortfarande förlitar sig endast på kliniska tecken på motorisk inblandning som visas senare i sjukdomsförloppet, när de flesta av dopaminerga nerv celler är redan förlorat. Därför finns det ett starkt behov av en bio markör som kan identifiera patienter i början av sjukdomen eller med risk att utveckla den. Under de senaste åren har hudbiopsi visat sig vara en utmärkt forskning och diagnostiska verktyg för perifera nerv sjukdomar såsom små fiber neuropati. Intressant, en liten fiber neuropati och alpha Synuclein (αSyn) neurala insättningar har visats av hudbiopsi hos PD-patienter. I själva verket har hudbiopsi den stora fördelen av att vara en lättillgänglig, minimalt invasiva och smärtfri förfarande som gör det möjligt att analysera perifera nervvävnad benägna att patologin. Dessutom, möjligheten att upprepa hudbiopsi i samband med uppföljningen av samma patient gör det möjligt att studera den längsgående korrelation med sjukdomsprogression. Vi satte upp ett standardiserat tillförlitligt protokoll för att undersöka närvaron av αSyn aggregat i hud nerv fibrer av PD-patienten. Detta protokoll innebär få kort fixering steg, en cryotome snittning och sedan en fritt flytande immunofluorescens dubbel färgning med två specifika anti kroppar: anti protein Gene produkt 9,5 (PGP 9.5) för att markera den kutana nerv fibrer och anti 5g4 för att upptäcka αSyn aggregat. Det är en mångsidig, känslig och lätt att utföra protokoll som också kan tillämpas för att rikta andra proteiner av intresse i hud nerver. Förmågan att markera αSyn aggregat är ytterligare ett steg framåt till användningen av hudbiopsi som ett verktyg för att fastställa en pre-mortem histopatologisk diagnos av PD.

Efter den beskrivna proceduren (figur 1), upptäckte vi αsyn aggregat, märkta med 5G4 anti kroppar, i dermal nerv fascicles innerverar autonoma strukturer av PD-patienter. Morfologi av alfa-Synuclein insättningar visas som en prickig signal längs axoner av dermal nerver (figur 2). Faktum är att utnyttja detta protokoll hos 19 PD patienter och 17 kontroller i hudbiopsier på tre anatomiska området (livmoder hals cancer, lår och distala benet) fann vi att 5...

Watch this Scientific Journal Video about Targeting Alpha Synuclein Aggregates in Cutaneous Peripheral Nerve Fibers by Free-floating Immunofluorescence Assay at JoVE.com

Targeting Alpha Synuclein Aggregates in Cutaneous Peripheral Nerve Fibers by Free-floating Immunofluorescence Assay

Här presenterar vi ett protokoll för en fritt flytande indirekta immunofluorescens assay på huden biopsi sektioner som gör det möjligt att identifiera sjukdomsspecifika kon formation varianter av alfa-Synuclein inblandade i Parkinsons sjukdom och flera proteiner i perifera nerv systemet.

Inriktning alpha Synuclein aggregat i kutan perifer nerv fibrer av fritt flytande immunofluorescens assay

To date, for most neurodegenerative diseases only a post-mortem histopathological definitive diagnosis is available. For Parkinson&#39;s disease (PD), the ...

Diagnosen av Parkinsons sjukdom bygger fortfarande på kliniska tecken på motorisk engagemang som visas senare i sjukdomsförloppet, när de flesta av nervcellerna i substantia nigra redan förlorat. Detta protokoll gör det möjligt för dermal nerver analys av huden biopsi, som representerar en potentiell ny biomarkör av sjukdomen, som ska användas i kliniska prövningar. Hudbiopsi är en lätt assessable, inte-invasiv förfarande som gör att analysen av perifera nervvävnad som är benägna att patologin.Alfa synuklein aggregat upptäckt av huden biopsi kan användas för diagnostiska ändamål, möjligen i tidiga faser, när potentiella bota är mest effektiva. Uppföljning huden tarmbiopsier i samma patient tillåta en tid och särskilda kurs analys av alfa synuclein sammanlagda spridning i mänskliga testning nervsystemet. Dessa kan belysa sjukdomspatogenesen.För att påbörja denna procedur, förbereda en färsk PLP fixativ lösning som beskrivs i tabell ett av textprotokollet. Omedelbart efter uppsamling av hudbiopsi, dränka den i ett rör som innehåller 10 milliliter av fixeringslösningen. Inkubera över natten vid fyra grader Celsius.Nästa dag, i en draghuv, ta bort PLP fixative försiktigt. I samma rör tvättar du biopsin tre gånger i fem minuter vardera, med hjälp av fem milliliter på 0,1 molar Sorensens lösning för varje tvätt. Kassera Sörensens lösning och tillsätt fem milliliter kryoprotektivlösning.Inkubera över natten vid fyra grader Celsius. Nästa dag, lagra biopsi vid fyra grader Celsius om snittet med en cryotome ska utföras inom en vecka. Ställ först in kryooten till minus 20 grader Celsius.Ta en kryomamma och fyll det med cryo-inbäddning medium. Med hjälp av pincett, fördjupa biopsin i kryo-inbäddningsmediet, med den längsgående axeln parallellt med botten av kryoåringen. Snap frysa provet med flytande kväve, för att få en fast kub av kryo-inbäddning medium som innehåller biopsin i rätt orientering.Sätt provet i kryostaten, och vänta i 30 minuter så att biopsin acklimatiseras. Sedan, fixa provet på kryostaten och skär i 50-mikrometer sektioner. Med hjälp av en liten borste överför du kryosektionerna till en 96-brunnsplatta som innehåller 200 mikroliter av frostskyddslösning i varje brunn.Efter detta, lagra plattan på minus 20 grader Celsius. Till att börja med fylla några av brunnarna i en fräsch 96-brunnsplatta med 100 mikroliter av tvättlösning. Överför de sektioner som ska analyseras från förvaringsplattan till den som innehåller tvättlösningen.Låt sektionerna vara i tvättlösningen i 10 minuter vid rumstemperatur. Överför sedan varje sektion till en tom brunn som innehåller samma tvättlösning och upprepa tvätten. Därefter lägger du till tvättlösning till sektionerna, och överför dem till nya brunnar som innehåller 100 mikroliter av blockerande lösning.Inkubera i rumstemperatur i minst 90 minuter, och högst fyra timmar. Späd de primära antikropparna, anti-PGP9.5 och anti-5G4, i arbetslösningen. Överför sektionerna till nya brunnar som innehåller 100 mikroliter av de primära antikropparnas arbetslösning, och inkubera över natten i rumstemperatur.Nästa dag tvättar du sektionerna i brunnar som innehåller tvättlösning som tidigare beskrivits. Späd de sekundära antikropparna, Get anti-Rabbit för att upptäcka PGP9.5, och Get anti-Mouse för att upptäcka 5G4, i arbetslösningen. Överför de tvättade sektionerna till nya brunnar som innehåller 100 mikroliter av de sekundära antikropparnas arbetslösning.Täck plattan med aluminiumfolie för att undvika blekning av fluorophore konjugerat med sekundära antikroppar, och inkubera vid rumstemperatur i 90 minuter. Efter detta tvättar du sektionerna två gånger i tvättlösning som tidigare beskrivits. Överför de tvättade sektionerna till nya brunnar som innehåller 100 mikroliter dapi under fem minuter i rumstemperatur.Tvätta sektionerna två gånger i tvättlösning som tidigare beskrivits. Montera sedan sektionerna på en glid i rätt läge, undvik felvikning. Tillsätt några droppar monteringsmedium till bilden och täck över avsnittet med en täcksli.Låt rutschkanorna torka över natten. Nästa dag, förvara bilderna i en lämplig låda vid fyra grader Celsius, se till att undvika ljusexponering. Med hjälp av ett inverterat fluorescensmikroskop eller ett konfokalmikroskop, visa sektionerna.Skaffa bilderna med en kamera ansluten till mikroskopet. Använd sedan ett fluorescensmikroskop eller ett konfokalmikroskop för att analysera positiva signaler i sektioner när det gäller rumslig fördelning och intensitet av signalen som beskrivs i textprotokollet. Efter den beskrivna metoden, alfa synuclein aggregat märkt med 5G4 antikroppen påvisas i dermal nerv fascicles innervating autonoma strukturer av PD patienter.Morfologi av alfa synuclein insättningar visas som en prickad signal längs axons av dermal nerver. Representativ användning av detta protokoll i 19 PD patienter och 17 kontroller i huden tarmbiopsier på tre anatomiska platser visar att 5G4 har en känslighet på 81%och en specificitet på 86%jämfört med friska kontroller. Fosforylerat alfa synuklein har en känslighet på 56%och en specificitet 100%5G4 och fosforylerat alfa synuklein-positiva avlagringar finns främst runt svett körtlar, men finns också i muskel arrector pili, små fartyg, och subepidermal och dermal plexus, men aldrig i intraepidermal nervfibrer.Generellt, inom svettkörtlarna lumen, är det möjligt att observera en ospecifik signal som skulle kunna misstolkas som 5G4 eller fosforylerad alfasynuclein positivitet. Denna typ av signal är prickade, sfäriska, och det beror troligen till intraluminal autofluorescent material som visas i tekniska kontroller utan primära och sekundära antikroppar. Colocalization med PGP9.5 som markerar nervfibrerna, som morfologiskt är fintrådiga och avlånga, hjälper till att identifiera rätt signal.Därför är specificiteten hos 5G4 signalen mycket ökat genom en dubbel immunostaining med en axonal markör. En exakt fixering av biopsin är nödvändig för att producera en immunfluorescerande färgning av god kvalitet och för tillförlitlig tolkning av de fluorescerande signalerna. Om fixativet inte är korrekt förberedd, eller om en över-fixering har inträffat, kommer resultatet att bli en hög autofluorescens som kommer att maskera signalen av nervfibrer som korsar den dermal-epidermala korsningen, eller innervate de viktigaste dermal strukturer.Det mest kritiska steget i detta förfarande är vävnadsfixering. Var uppmärksam på pH av PLP fixativ lösning, och timing av inkubation, för att undvika autofluorescens och en specifik signal.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Oral Administration of Rotenone using a Gavage and Image Analysis of Alpha-synuclein Inclusions in the Enteric Nervous System

Oral administrering av Rotenon med en sondmatning och bildanalys av alfa-synuklein införanden i det enteriska nervsystemet

In Parkinson's disease (PD) patients, the associated pathology follows a characteristic pattern involving inter alia the enteric nervous system (ENS) 1,2, ...

Selective Tracing of Auditory Fibers in the Avian Embryonic Vestibulocochlear Nerve

Selektiv spåra Auditiva fibrer i Avian embryonala Vestibulocochlear Nerve

The embryonic chick is a widely used model for the study of peripheral and central ganglion cell projections. In the auditory system, selective labeling ...

Transplantation of Olfactory Ensheathing Cells to Evaluate Functional Recovery after Peripheral Nerve Injury

Transplantation av Lukt Ensheathing celler att utvärdera funktionell återhämtning efter perifer nervskada

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory ...

Sequential Extraction of Soluble and Insoluble Alpha-Synuclein from Parkinsonian Brains

Sekventiell Utvinning av lösliga och olösliga alfa-synuklein från Parkinson Brains

Alpha-synuclein (&#945;-syn) protein is abundantly expressed mainly within neurons, and exists in a number of different forms - monomers, tetramers, ...

Bioluminescence Imaging of Neuroinflammation in Transgenic Mice After Peripheral Inoculation of Alpha-Synuclein Fibrils

Bioluminescence avbildning av Neuroinflammation i transgena möss efter perifer ympning av alfa-synuklein fibriller

To study the prion-like behavior of misfolded alpha-synuclein, mouse models are needed that allow fast and simple transmission of alpha-synuclein ...

Identification of Dopamine D1-Alpha Receptor Within Rodent Nucleus Accumbens by an Innovative RNA In Situ Detection Technology

Identification of Dopamine D1-Alpha Receptor Within Rodent Nucleus Accumbens by an Innovative RNA In Situ Detection Technology

Identifiering av dopamin D1-Alpha Receptor inom gnagare Nucleus Accumbens genom en innovativ RNA In Situ Detection-teknik

In the central nervous system, the D1-alpha subtype receptor (Drd1&#945;) is the most abundant dopamine (DA) receptor, which plays a vital role in ...

Exogenous Administration of Microsomes-associated Alpha-synuclein Aggregates to Primary Neurons As a Powerful Cell Model of Fibrils Formation

Exogena administrering av mikrosomer-associerade alfa-synuklein aggregat till primära nervceller som en kraftfull Cell modell av fibriller bildas

For years, the inability of replicating formation of insoluble alpha-synuclein (&#945;S) inclusions in cell cultures has been a great limitation in the ...

Generation of Alpha-Synuclein Preformed Fibrils from Monomers and Use In Vivo

Generering av alfa-Synuclein förformade fibriller från monomerer och användning in vivo

Use of the in vivo alpha-synuclein preformed fibril (&#945;-syn PFF) model of synucleinopathy is gaining popularity among researchers aiming to model ...

Short-Term Free-Floating Slice Cultures from the Adult Human Brain

Kortsiktiga fritt flytande segment kulturer från den vuxna mänskliga hjärnan

Organotypic, or slice cultures, have been widely employed to model aspects of the central nervous system functioning in vitro. Despite the potential of ...

Assessing Early Stage Open-Angle Glaucoma in Patients by Isolated-Check Visual Evoked Potential

Bedömning av glaukom i öppen vinkel i tidigt skede hos patienter genom att isolera visuellt framkallat potential

Recently, the isolated-check visual evoked potential (icVEP) technique was designed and has been reported to detect glaucomatous damage earlier and ...