Name: targeting alpha synuclein aggregates in cutaneous peripheral nerve fibers by free-floating immunofluorescence assay
Uploaded: 2019-06-25T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Targeting Alpha Synuclein Aggregates in Cutaneous Peripheral Nerve Fibers by Free-floating Immunofluorescence Assay at JoVE.com

Bu çalışmanın mali desteği için Parkinson Schweiz ve ABREOC (Ente Ospedaliero Cantonale bilimsel araştırma Danışma Kurulu) teşekkür ederiz.

Protokol, Cantonal Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır ve tüm kayıtlı konular araştırmaya yazılı onay verdi.
1. cilt biyopsisi koleksiyonu
<ol><li>Nitelikli bir doktorun, deri biyopsisi uygun bir klinik ortamda gerçekleştirmesini sağlar.</li>
	<li>Cilt biyopsisi yapmak ve bir alkol çubuk ile temizlemek için alanı seçin.</li>
	<li>Anestezik solüsyonu 1 cc lidokain% 2 ile hazırlayın.</li>
	<li>Alana paralel iğne ile lokal anestezi subkutan enjekte edilir.</li>
	<li>Ane...

<ol>
	<li>McArthur, J. C., Griffin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Another+Tool+for+the+neurologist's+Tollbox.">Another Tool for the neurologist's Tollbox.</a> Annals of Neurology. 57, 163-167 (2005).</li><li>Wilkinson, P. F., Millington, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Skin. , 49-50 (2009).</li><li>Weddell, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nerve+endings+in+mammalian+skin.">Nerve endings in mammalian skin.</a> Biological reviews of the Cambridge Philosophical Society. 30, 159-195 (1954).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+gene+product+9.5-immunoreactve+nerve+fibers+and+cells+in+human+skin.">Protein gene product 9.5-immunoreactve nerve fibers and cells in human skin.</a> Cell and Tissue Research. 261 (1), 25-33 (1990).</li><li>Holland, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraepidermal+nerve+fiber+density+in+patients+with+painful+sensory+neuropathy.">Intraepidermal nerve fiber density in patients with painful sensory neuropathy.</a> Neurology. 48, 708-711 (1997).</li><li>McArthur, J. C., Stocks, E. A., Hauer, P., Cornblath, D. R., Griffin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+nerve+fiber+density:+normative+reference+range+and+diagnostic+efficiency.">Epidermal nerve fiber density: normative reference range and diagnostic efficiency.</a> Archives of Neurology. 55 (12), 1513-1520 (1998).</li><li>Lauria, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=European+Federation+of+Neurological+Societies/Peripheral+Nerve+Society+Guideline+on+the+use+of+skin+biopsy+in+the+diagnosis+of+small+fiber+neuropathy.+Report+of+a+joint+task+force+of+the+European+Federation+of+Neurological+Societies+and+the+Peripheral+Nerve+Society.">European Federation of Neurological Societies/Peripheral Nerve Society Guideline on the use of skin biopsy in the diagnosis of small fiber neuropathy. Report of a joint task force of the European Federation of Neurological Societies and the Peripheral Nerve Society.</a> European Journal of Neurology. 17, 903-912 (2010).</li><li>Provitera, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multi-center,+multinational+age-+and+gender-adjusted+normative+dataset+for+immunofluorescent+intraepidermal+nerve+fiber+density+at+the+distal+leg.">A multi-center, multinational age- and gender-adjusted normative dataset for immunofluorescent intraepidermal nerve fiber density at the distal leg.</a> European Journal of Neurology. 23, 333-338 (2016).</li><li>Wakabayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+the+peripheral+nervous+system+in+synucleinopathies,+tauopathies+and+other+neurodegenerative+proteinopathies+of+the+brain.">Involvement of the peripheral nervous system in synucleinopathies, tauopathies and other neurodegenerative proteinopathies of the brain.</a> Acta Neuropathology. 120, 1-12 (2010).</li><li>Ruffmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+alpha-synuclein+conformational+variants+from+gastro-intestinal+biopsy+tissue+as+a+potential+biomarker+for+Parkinson's+disease.">Detection of alpha-synuclein conformational variants from gastro-intestinal biopsy tissue as a potential biomarker for Parkinson's disease.</a> Neuropathology and Applied Neurobiology. 44 (7), 722-736 (2018).</li><li>Lee, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+search+for+a+peripheral+biopsy+indicator+of+alpha-synuclein+pathology+for+Parkinson+Disease.">The search for a peripheral biopsy indicator of alpha-synuclein pathology for Parkinson Disease.</a> Journal of Neuropathology &amp; Experimental Neurology. 76, 2-15 (2017).</li><li>Donadio, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+nerve+misfolded+alpha-synuclein+in+pure+autonomic+failure+and+Parkinson+disease.">Skin nerve misfolded alpha-synuclein in pure autonomic failure and Parkinson disease.</a> Annals of Neurology. 79, 306-316 (2016).</li><li>Doppler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutaneous+neuropathy+in+Parkinson's+disease:+a+window+into+brain+pathology.">Cutaneous neuropathy in Parkinson's disease: a window into brain pathology.</a> Acta Neuropathologica. 128, 99-109 (2014).</li><li>Zange, L., Noack, C., Hahn, K., Stenzel, W., Lipp, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylated+alpha-synuclein+in+skin+nerve+fibres+differentiates+Parkinson's+disease+from+multiple+system+atrophy.">Phosphorylated alpha-synuclein in skin nerve fibres differentiates Parkinson's disease from multiple system atrophy.</a> Brain. 138, 2310-2321 (2015).</li><li>Braak, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staging+of+brain+pathology+related+to+sporadic+Parkinson's+disease.">Staging of brain pathology related to sporadic Parkinson's disease.</a> Neurobiology of Aging. 24, 197-211 (2003).</li><li>Doppler, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dermal+phospho-alpha-synuclein+deposits+confirm+REM+sleep+behaviour+disorder+as+prodromal+Parkinson's+disease.">Dermal phospho-alpha-synuclein deposits confirm REM sleep behaviour disorder as prodromal Parkinson's disease.</a> Acta Neuropathologica. 133 (4), 535-545 (2017).</li><li>Antelmi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skin+nerve+phosphorylated+&#945;-synuclein+deposits+in+idiopathic+REM+sleep+behavior+disorder.">Skin nerve phosphorylated &#945;-synuclein deposits in idiopathic REM sleep behavior disorder.</a> Neurology. 88 (22), 2128-2131 (2017).</li><li>Nolano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+fiber+pathology+parallels+disease+progression+in+Parkinson+disease:+a+longitudinal+study.">Small fiber pathology parallels disease progression in Parkinson disease: a longitudinal study.</a> Acta Neuropathologica. , (2018).</li><li>Melli, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cervical+skin+denervation+associates+with+alpha-synuclein+aggregates+in+Parkinson+disease.">Cervical skin denervation associates with alpha-synuclein aggregates in Parkinson disease.</a> Annals of Clinical and Translational Neurology. 5, 1394-1407 (2018).</li><li>Kovacs, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+processing+of+disease-associated+alpha-synuclein+in+the+human+brain+suggests+prion-like+cell-to-cell+spread.">Intracellular processing of disease-associated alpha-synuclein in the human brain suggests prion-like cell-to-cell spread.</a> Neurobiology Disease. 69, 76-92 (2014).</li><li>Kovacs, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+antibody+with+high+reactivity+for+disease-associated+alpha-synuclein+reveals+extensive+brain+pathology.">An antibody with high reactivity for disease-associated alpha-synuclein reveals extensive brain pathology.</a> Acta Neuropathologica. 124, 37-50 (2012).</li></ol>

Biz PD tanısı için cilt biyopsileri için serbest yüzen immünofluorescence tahlil tarif: Bu anti-PGP 9.5 antikor, bir panaxonal Marker ve anti-5G4, toplanan formu tanıyan bir konformasyon spesifik antikor ile çift immünostasyonu istismar , αSyn.
PH 'de tanı amacı ve muhtemelen diğer protein Konformasyonel bozukluklarda cilt biyopsisi için büyük avantajlar şunlardır: 1) hafif invazif bir teknik ile hastalığa eğilimli sinir dokusuna doğrudan erişim ve böylece beklenen daha...

Cilt biyopsisi nörolojik bozukluklar alanında teşhis ve araştırma aracı olarak büyük önem kazanmıştır1. Nitekim, epidermis ve dermis bol somatik duyusal sinir lifleri (myelinated ve myelinated), nociceptif serbest sinir sonlar, duyusal reseptörleri ve ter bezleri, damarların, yağ bezleri ve kas arrektor leiomiyomlardır otonoma innervasyonu içerir 2' ye kadar.
Orta-20inci yüzyılda, PGP 9.5 antikor immünhistokimya için kurulum insan epidermis memelinin deri3geniş bir innervasyon kanıtı izin verdi. PGP 9.5, hem merkezi hem de periferik sinir sisteminin (PNS) akons boyunca eşit olarak dağıtılan bir karboksil-Terminal hidrolaz 'dir. Bu antikor mevcudiyeti sadece cilt PNS Morfoloji ve anatomisini açıklığa kavuşturmak için izin değil, aynı zamanda bu ile ilişkili hastalıkların çalışma uygulanan3,4. Cilt biyopsisi yeni bir klinik obje tanımlamak için katkıda bulunmuştur: küçük lif nöropati. Çeşitli uluslararası gruplar intraepidermal sinir lifleri ve belirtiler/küçük lif nöropati belirtileri kaybı arasındaki ilişkiyi göstermiştir5 cilt biyopsisi analizi ile ve sinir morfometri için standart protokoller sağlanan yanı sıra klinik uygulamada kullanılmak üzere normatif referans değerleri6,7,8.
Son zamanlarda büyük miktarda kanıt, nörodejeneratif hastalıkların, merkezi sinir sistemindeki yanlış katlanan protein birikimleri ile karakterize olduğunu göstermiştir, Multi-sistem patolojileri9. Gerçekten de, PD, kanıtlanmışdopaminerjik nöron içinde αsyn birikimi ile karakterize, ancak αsyn ve patolojik formu, fosforile αsyn (P-αsyn), periferik dokularda da tespit edilebilir olduğunu göstermiştir. Gastro-intestinal mukoza10, tükürük bezleri11, ter bezleri ve pilomotor kasları çevreleyen cilt otonjik lifleri12,13,14, αsyn patojen formları için immünoreactivity göster, Braak hipotezi ile ilgili olarak, αSyn patolojisinin beyinde birikiminden önce, PNS 'de önceden de başlayabilir. Dahası, p-αsyn varlığı, prodromal PD olarak kabul edilen REM davranış bozuklukları olan hastaların cilt sinirinde gösterildi16,17 böylece deri patolojik αsyn umut verici bir erken periferik olarak kabul edilebilir synucleinopati histopatolojik Marker.
PD 'de küçük lif nöropati Birliği daha önce gösterildi ve intraepidermal sinir liflerinin yoğunluğu hastalığın ilerlemesini yansıtan bulunmuştur18,19. Bu nedenle, cilt biyopsisi PD 'de nörodejenerasyonun incelenmesi ve hastalığın ön mortem histopatolojik tanısı oluşturmak için yararlı bir araçtır. Nitekim, cilt biyopsisi, patolojiye eğilimli sinir dokusunun analizine izin vererek kolayca erişilebilen ve minimal invaziv bir prosedür olmaktan büyük bir avantaj sağlar. Son olarak, aynı hastaların takip esnasında deri biyopsisi tekrarlanması olasılığı, hastalığın ilerlemesi ile uzunlamasına korelasyon incelenmesi sağlar.
Laboratuvarımızda, PGP 9.5 ve konformasyon özel monoklonal 5g4 antikor ile çift immüno-boyama sömürüyor, bu αsyn küçük agrega dahil hastalık spesifik formları tanır20,21, biz göstermek başardık umut verici yüksek tanı verimliliği ile cilt sinirleri αSyn toplamları varlığı19. Konformasyonel hastalıklarda cilt biyopsisi immünofluorescence Analizi hem protein agregaları tespiti hem de nörodejenerasyonun ölçüleri arasında kombine edilerek, umut verici bir biyomarkerlerin kaynağı olarak öne çıkmaktadır. Bundan sonra, cilt biyopsisi ile ilgili kolay ve çok yönlü bir protokol gösteriyoruz ve αSyn toplamalarını tespit etmek için serbest yüzen immünofluoresesans lekesini gerçekleştirme. Dahası, bu protokol cilt PNS ifade ilgi diğer protein hedefleme için adapte edilebilir.
Aşağıdaki çalışma protokolü, pH 'nin PNS 'inde toplanan αSyn analizinin tanı yardımcı programını cilt biyopsisi19ile değerlendirmek için kullanılmıştır. PD için dahil etme kriterleri: INGILTERE beyin Bankası teşhis kriterlerine göre kesin bir klinik tanı, hastalık süresi en az 3 yıl, hiçbir aile öyküsü, ve önemli bir bilişsel bozukluk ya da tarihin önemli dysautonomic belirtileri. Dışlama kriterleri nöropati nedenleri bilinen (glycated hemoglobin, kreatinin, B12 vitamini, TSH, serum immünofixation, HıV, HCV, frengi, ve borreliosis). Her konu üç anatomik bölgelerde 3 mm çapında cilt biyopsileri (C8 dermatomal seviyede boyun, diz üstünde uyluk 10 cm, lateral Malleolus üzeri bacak 10 cm) ve klinik olarak daha etkilenmiştir. Genel olarak, aşağıdaki protokol cilt biyopsisi işleme ve serbest yüzen immünofluorescence boyama ve analiz gerçekleştirme hakkında. Bu nedenle adapte edilebilir ve cilt dokusu ilgi diğer proteinlerin tespiti için kullanılır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:964px;" width="964">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:264px;">5G4 (anti human &#945;Syneclein 5G4)</td>
			<td style="width:161px;">Analytik Jena Roboscreen</td>
			<td style="width:344px;">847-0102004001</td>
			<td style="width:195px;">Mouse monoclonal&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">AlexaFluor 488 Goat anti Rabbit IgG&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1971418</td>
			<td>2mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">AlexaFluor 594 Goat anti Mouse IgG&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>1922849</td>
			<td>2mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Disodium hydrogen phosphate solution</td>
			<td>Merk Millipore</td>
			<td>106586</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ethylene Glycol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>324558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">L-Lysine monohydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L5626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Aldrich Chemistry</td>
			<td>441244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:264px;">PGP9.5</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab15503</td>
			<td>Rabbit polyclonal</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodium Dihydrogen Phosphate Monohydrate</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>106346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodium (meta)periodate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S1878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trizma Base</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Tryton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Vectashield&#160;</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td>Mounting medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

targeting alpha synuclein aggregates in cutaneous peripheral nerve fibers by free-floating immunofluorescence assay

Bugüne kadar, çoğu nörodejeneratif hastalıklar için sadece bir post-mortem histopatolojik kesin tanı mevcuttur. Parkinson hastalığı (PD) için, tanı hala sadece hastalık kursunda daha sonra görünür motor tutulumu klinik belirtileri dayanır, dopaminerjik nöronların çoğu zaten kaybolduğunda. Bu nedenle, hastalığın başlangıcında veya onu geliştirme riskinde hastaları tanımlayabilir bir biyomarker için güçlü bir ihtiyaç vardır. Son birkaç yıl içinde, cilt biyopsisi, küçük lif nöropati gibi periferik sinir hastalıkları için mükemmel bir araştırma ve tanı aracı olduğunu kanıtladı. İlginç bir şekilde, PD hastalarında cilt biyopsisi ile küçük lif nöropati ve Alfa Raisin (αsyn) nöral tortuları gösterildi. Nitekim, cilt biyopsisi, patolojiye eğilimli periferik sinir dokusunun analizini sağlayan, kolayca erişilebilen, minimal invazif ve ağrısız bir prosedür olmanın büyük avantajına sahiptir. Dahası, aynı hastanın takip esnasında deri biyopsisi tekrarlanması olasılığı, hastalığın ilerlemesi ile uzunlamasına korelasyon incelenmesi sağlar. PD hastasının cilt sinir lifleri içinde αSyn toplamaların varlığını araştırmak için standardize edilmiş güvenilir bir protokol kuracağız. Bu protokol, birkaç kısa sabitleme adımlarını, bir cryotome bölümlendirmesini ve daha sonra iki spesifik antikorla serbest yüzen immünofluorescence çift lekeleme içerir: Anti protein gen ürün 9,5 (PGP 9.5) tespit için kutanöz sinir lifleri ve anti 5G4 işaretlemek için αSyn toplamları. Bu da cilt sinirleri ilgi diğer proteinlerin hedefleme için uygulanabilir bir çok yönlü, hassas ve kolay bir protokoldür. ΑSyn toplamalarını işaretleme yeteneği, PD 'nin önceden mortem histopatolojik tanısı oluşturmak için bir araç olarak cilt biyopsisi kullanımı için bir adım daha ileri bir adımdır.

Açıklanan prosedürün ardından (Şekil 1), PD hastalarının otonjik yapılarına sahip dermal sinir fasiklerde, 5G4 antikor Ile etiketlenmiş αsyn toplamları tespit ettik. Alfa-synuclein tortularının morfolojisi dermal sinirlerin akons boyunca noktalı sinyal olarak görünür (Şekil 2). Nitekim, 19 PD hastalarında bu protokol ve üç anatomik sitede (servikal, uyluk ve distal bacak) cilt biyopsilerinde 17 kontrol sömürüyor, 5G4 ' ün% 81 duyarlıl...

Watch this Scientific Journal Video about Targeting Alpha Synuclein Aggregates in Cutaneous Peripheral Nerve Fibers by Free-floating Immunofluorescence Assay at JoVE.com

Targeting Alpha Synuclein Aggregates in Cutaneous Peripheral Nerve Fibers by Free-floating Immunofluorescence Assay

Burada, biz Parkinson hastalığı ve multipl proteinleri dahil Alfa Raisin hastalığın spesifik konformasyon türevleri tanımlanması için izin cilt biyopsisi bölümlerde serbest yüzen dolaylı immünofluorescence tahlil için bir protokol sunuyoruz Periferik sinir sistemi.

Serbest yüzen Immünofluorescence tahlil ile kutanöz periferik sinir lifleri Alfa Synuclein toplamları hedefleme

To date, for most neurodegenerative diseases only a post-mortem histopathological definitive diagnosis is available. For Parkinson&#39;s disease (PD), the ...

Parkinson hastalığının tanısı hala daha sonra hastalığın seyrinde ortaya çıkan motor tutulum klinik belirtileri dayanır, substantia nigra nöronların çoğu zaten kaybolur. Bu protokol, hastalığın potansiyel yeni biyobelirtecisini temsil eden deri biyopsisi ile dermal sinirlerin analizinin klinik çalışmalarda kullanılmasını sağlar. Deri biyopsisi patolojiye yatkın periferik sinir dokusunun analizini sağlayan kolay değerlendirilebilir, invaziv olmayan bir işlemdir.Alfa sinüklein agregaları deri biyopsisi ile algılama tanı amaçlı kullanılabilir, muhtemelen erken aşamalarında, potansiyel tedavi en etkili olduğu zaman. Aynı hastada takip deri biyopsileri insan kutanöz sinir sisteminde yayılan alfa sinüklein agregabir zaman ve özel ders analizi sağlar. Bunlar hastalığın patogenezine ışık tutabilir.Bu yordamı başlatmak için, metin protokolütablo bir özetlenen yeni bir PLP fiksatif çözüm hazırlamak. Cilt biyopsisi toplandıktan hemen sonra, fiksatif çözelti10 mililitre içeren bir tüp batırın. Bir gecede dört santigrat derecede kuluçkaya yat.Ertesi gün, bir duman başlık içinde, yavaşça PLP fiksatif kaldırın. Aynı tüpte, her yıkama için 0,1 molar Sorensen çözeltisi beş mililitre kullanarak, beş dakika her biyopsi üç kez yıkayın. Sorensen çözeltisini atın ve beş mililitre kriyoprotektif solüsyon ekleyin.Bir gecede dört santigrat derecede kuluçkaya yat. Ertesi gün, bir kriyotom ile kesim bir hafta içinde yapılacakise biyopsiyi dört santigrat derecede saklayın. İlk olarak, kriyotomu eksi 20 santigrat dereceye ayarlayın.Bir kriyomold alın ve kriyo-gömme orta ile doldurun. Cımbız kullanarak, biyopsiyi kriyo-gömme ortamına daldırın, uzunlamasına eksen kriyomoldun altına paralel. Snap sıvı nitrojen ile örnek dondurma, doğru yönde biyopsi içeren kriyo gömme ortamın katı bir küp elde etmek için.Örneği kriyostat'a koyun ve biyopsinin alışması için 30 dakika bekleyin. Sonra, kriyostat üzerinde örnek düzeltmek ve 50 mikrometre bölümlerhalinde kesilmiş. Küçük bir fırça kullanarak, kriyo-kesitleri her kuyuda 200 mikrolitre antifriz çözeltisi içeren 96 kuyuluk bir plakaya aktarın.Bundan sonra, eksi 20 santigrat derece plaka saklayın. Başlamak için, 100 mikrolitre yıkama çözeltisi ile yeni 96 kuyulu bir plakanın kuyularından bazılarını doldurun. Analiz edilecek bölümleri depolama plakasından yıkama solüsyonunu içeren bölüme aktarın.Bulaşık çözeltisindeki bölümleri oda sıcaklığında 10 dakika bekletin. Daha sonra, her bölümü aynı yıkama çözeltisini içeren boş bir kuyuya aktarın ve yıkamayı tekrarlayın. Daha sonra, bölümlere yıkama çözeltisi ekleyin ve bunları 100 mikrolitre engelleme çözeltisi içeren yeni kuyulara aktarın.En az 90 dakika ve en fazla dört saat oda sıcaklığında kuluçka. Çalışma çözeltisinde birincil antikorlar, anti-PGP9.5 ve anti-5G4 seyreltin. Bölümleri, birincil antikorların çalışma çözeltisinin 100 mikrolitresini içeren yeni kuyulara aktarın ve oda sıcaklığında gece boyunca kuluçkaya yatırın.Ertesi gün, daha önce açıklandığı gibi yıkama solüsyonu içeren kuyularda bölümleri yıkayın. İkincil antikorları seyreltin, PGP9.5'i tespit etmek için Keçi anti-Tavşanı ve çalışma çözümünde 5G4'ü tespit etmek için Keçi anti-Faresi. Yıkanmış bölümleri ikincil antikorların çalışma çözeltisinin 100 mikrolitresini içeren yeni kuyulara aktarın.İkincil antikorlarla konjuge florofor ağartma önlemek için alüminyum folyo ile plaka kapağı ve 90 dakika oda sıcaklığında kuluçka. Bundan sonra, daha önce açıklandığı gibi yıkama çözeltisi iki kez bölümleri yıkayın. Yıkanmış bölümleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 100 mikrolitre DAPI içeren yeni kuyulara aktarın.Bölümleri daha önce açıklandığı gibi yıkama çözeltisinde iki kez yıkayın. Ardından, bölümleri yanlış kıvrılmaktan kaçınarak doğru konuma getirerek bir slayta monte edin. Slayta birkaç damla montaj ortamı ekleyin ve bölümü kapak fişi ile kaplayın.Slaytlar bir gecede kurumasını bekleyin. Ertesi gün, slaytları uygun bir kutuda dört santigrat derecede saklayın ve ışığa maruz kalmaktan kaçının. Ters floresan mikroskobu veya konfokal mikroskobu kullanarak bölümleri görüntüleyin.Görüntüleri mikroskoba bağlı bir kamera ile elde edin. Daha sonra, metin protokolünde belirtildiği gibi, uzamsal dağılım ve sinyal yoğunluğu açısından bölümlerdeki pozitif sinyalleri analiz etmek için bir floresan mikroskobu veya konfokal mikroskop kullanın. Açıklanan yöntemden sonra, PH hastalarının otonom yapılarını innerve eden dermal sinir fasiküllerinde 5G4 antikor etiketli alfa sinüklein agregaları saptanmıştır.Alfa sinüklein mevduat morfolojisi dermal sinirlerin aksonları boyunca noktalı bir sinyal olarak görünür. Bu protokolün 19 PD'li hastada ve üç anatomik bölgede cilt biyopsilerinde 17 kontrolde temsili kullanımı, sağlıklı kontrollere kıyasla 5G4'ün %81 hassasiyete ve özgüllükte %86 özgüllük gösterdiğini göstermektedir. Fosforiyal alfa sinüklein% 56 duyarlılık ve 100% 5G4 ve fosforiile alfa sinüklein pozitif mevduat bir özgüllük ter bezleri etrafında ağırlıklı olarak bulunur, ama aynı zamanda kas arrector pili bulunur, küçük damarlar, ve subepidermal ve dermal pleksus, ama asla intraepidermal sinir liflerinde.Genellikle, ter bezleri lümen içinde, 5G4 veya fosforilted alfa sinüklein pozitifliği olarak yanlış yorumlanabilecek spesifik olmayan bir sinyal gözlemlemek mümkündür. Bu tip sinyal noktalı, küresel, ve büyük olasılıkla intraluminal otofloresan malzeme nedeniyle birincil ve ikincil antikorlar olmadan teknik kontrollerde gösterildiği gibi. PGP9.5 ile morfolojik olarak ipliksi ve uzamış sinir liflerini işaretleyen kolokalizasyon, doğru sinyalin belirlenmesine yardımcı olur.Bu nedenle, 5G4 sinyalinin özgüllüğü aksonal belirteç ile yapılan çift immünboyama ile yüksek oranda artmaktadır. Biyopsi doğru bir fiksasyon iyi kaliteli bir immünfloresan boyama üretmek ve floresan sinyallerin güvenilir yorumu için gereklidir. Fiksatif doğru hazırlanmış değilse, ya da bir aşırı fiksasyon oluştuysa, sonuç dermal-epidermal kavşak geçen sinir liflerinin sinyalini maskeleyecek yüksek bir otofloresans olacak, ya da ana dermal yapıları innerve.Bu işlemin en kritik adımı doku fiksasyonudur. Otofloresan ve belirli bir sinyalden kaçınmak için PLP fiksatif çözeltisinin pH'ına ve kuluçka zamanlamasına dikkat edin.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Oral Administration of Rotenone using a Gavage and Image Analysis of Alpha-synuclein Inclusions in the Enteric Nervous System

Enterik Sinir Sistemi Alpha-sinüklein İçermelerin bir sonda ve Görüntü Analizi kullanarak Rotenone Oral İdaresi

In Parkinson's disease (PD) patients, the associated pathology follows a characteristic pattern involving inter alia the enteric nervous system (ENS) 1,2, ...

Nörobilim

Selective Tracing of Auditory Fibers in the Avian Embryonic Vestibulocochlear Nerve

Kuş Embriyonik vestibülokoklear sinir İşitsel Elyaf seçici Aydınger

The embryonic chick is a widely used model for the study of peripheral and central ganglion cell projections. In the auditory system, selective labeling ...

Transplantation of Olfactory Ensheathing Cells to Evaluate Functional Recovery after Peripheral Nerve Injury

Periferik Sinir Hasarı Sonrası Fonksiyonel Kurtarma Değerlendirmesinde Koku Ensheathing Hücre Nakli

Olfactory ensheathing cells (OECs) are neural crest cells which allow growth and regrowth of the primary olfactory neurons. Indeed, the primary olfactory ...

Sequential Extraction of Soluble and Insoluble Alpha-Synuclein from Parkinsonian Brains

Parkinson Brains gelen Çözünür ve çözünmez alfa-sinüklein Sıralı Ekstraksiyon

Alpha-synuclein (&#945;-syn) protein is abundantly expressed mainly within neurons, and exists in a number of different forms - monomers, tetramers, ...

Bioluminescence Imaging of Neuroinflammation in Transgenic Mice After Peripheral Inoculation of Alpha-Synuclein Fibrils

Alfa-sinüklein fibrillerinin Çevresel Aşılama sonrası Tranjenik Farelerde Nöroinflamasyondan Biyoparlaklık Görüntüleme

To study the prion-like behavior of misfolded alpha-synuclein, mouse models are needed that allow fast and simple transmission of alpha-synuclein ...

Identification of Dopamine D1-Alpha Receptor Within Rodent Nucleus Accumbens by an Innovative RNA In Situ Detection Technology

Identification of Dopamine D1-Alpha Receptor Within Rodent Nucleus Accumbens by an Innovative RNA In Situ Detection Technology

Dopamin D1-Alfa reseptör kemirgen Nucleus Accumbens bir yenilikçi RNA Situ içinde hafiye teknoloji tarafından içinde tanımlaması

In the central nervous system, the D1-alpha subtype receptor (Drd1&#945;) is the most abundant dopamine (DA) receptor, which plays a vital role in ...

Exogenous Administration of Microsomes-associated Alpha-synuclein Aggregates to Primary Neurons As a Powerful Cell Model of Fibrils Formation

Microsomes ilişkili Alpha-synuclein toplamları için birincil nöronlar eksojen yönetim olarak güçlü hücre modeli liflerinde oluşumu

For years, the inability of replicating formation of insoluble alpha-synuclein (&#945;S) inclusions in cell cultures has been a great limitation in the ...

Generation of Alpha-Synuclein Preformed Fibrils from Monomers and Use In Vivo

Monomers ve Use In vivo Alfa-Synuclein önceden biçimlendirilmiş fibrils üretimi

Use of the in vivo alpha-synuclein preformed fibril (&#945;-syn PFF) model of synucleinopathy is gaining popularity among researchers aiming to model ...

Short-Term Free-Floating Slice Cultures from the Adult Human Brain

Yetişkin İnsan Beyninden Kısa Süreli Serbest Kayan Dilim Kültürleri

Organotypic, or slice cultures, have been widely employed to model aspects of the central nervous system functioning in vitro. Despite the potential of ...

Assessing Early Stage Open-Angle Glaucoma in Patients by Isolated-Check Visual Evoked Potential

İzole-Check Görsel Uyarılmış Potansiyele Göre Hastalarda Erken Evre Açık Açılı Glokomun Değerlendirilmesi

Recently, the isolated-check visual evoked potential (icVEP) technique was designed and has been reported to detect glaucomatous damage earlier and ...