Røntgen diffraktion af intakt murin skeletmuskulatur som et redskab til at studere det strukturelle grundlag for muskelsygdom

Fysiologisk intakt mus skeletmuskulatur kan producere høj kvalitet X-ray diffraktion mønstre, der indeholder mange strukturelle oplysninger, der kan give indsigt i fysiologiske processer. X-ray diffraktion er den eneste teknik, der gør det muligt at erhverve høj opløsning strukturelle oplysninger fra levende muskelvæv under reelle fysiologiske forhold i reel fysiologisk tid. Mange muskelsygdomme er arvet.

Med øget tilgængelighed til genetisk modificere de fleste modeller af myopatier, kan X-ray diffraktion give strukturel indsigt i sygdomsmekanismer og angive terapeutiske strategier. De fleste extensor digitorum longus og soleus muskler er særligt bekvemt til dette formål. Men mange andre muskler i små dyr kan dissekeres intakt og håndteres på samme måde.

Før proceduren påbegyndes, skal du tænde for den kombinerede motorkrafttransducer, motorkrafttransducercontrolleren med en høj effekt af bifasisk strømstimulator og et kontrolsystem til dataopkøb af computerkontrol. Dernæst spray huden på bagbenet af musen med kolde Ringer opløsning og bruge fine dissektion saks til at skære huden omkring låret. Brug nummer fem kraftæceser, hurtigt trække huden ned for at udsætte musklerne og amputere baglemben.

Læg lemmerne i en elastomerbelagt dissekerende skål, der indeholder iltet Ringers opløsning, og skålen sættes under et kikkertdedemisk mikroskop. At høste soleus muskel, pin bagekstremiteten med gastrocnemius muskel vender opad. Brug fine saks til at skære den distale senen af gastrocnemius/ soleus muskelgruppe.

Skær væk fascia på hver side af gastrocnemius musklen at tillade musklerne, der skal løftes forsigtigt og langsomt væk fra knoglen. Derefter frigør den proksimale sene af soleus musklen. Pin ned muskel gruppe, der indeholder gastrocnemius muskel og den distale senen i skålen.

Løft soleus musklen forsigtigt via den proksimale senen at adskille det fra gastrocnemius muskel, forlader så meget af sålen distale senen intakt som muligt. At høste extensor digitorum longus eller EDL muskel, pin bagdelen i skålen med skinnebialis forreste muskel vender opad og skære fascia langs skinnebensmuskel. Brug antændre til at trække fascia klar og skære den distale senen af skinnebenet forreste muskel.

Løft skinnebensmuskel og skær det forsigtigt ud uden at trække på EDL-musklen, og skær den laterale side af knæet op for at afsløre de to sener. Skær den proksimale senen, forlader os meget af senen som muligt stadig er knyttet til musklen og forsigtigt trække på senen til at løfte EDL muskel. Derefter skæres den distale senen, når den er udsat.

At montere den høstede muskel, pin ned musklen via sener og trim så meget af det ekstra fedt, fascia og senen som muligt. Indsæt en sene i en pre-bundet knude og bruge sutur binde kraftbefædre til at binde sutur stramt. Bind den anden knude på omkring metalkrogen og gentag proceduren i den anden ende af senen.

Fastgør derefter den korte krog til bunden af forsøgskammeret og den lange krog til den dual-mode krafttransducermotor. Boble opløsningen i forsøgskammeret med 100% ilt. For at optimere stimuleringsprotokollen og muskellængden skal du justere de mikromanipulatorer, der er fastgjort til transducermotoren, for at generere en baseline spænding mellem 15 til 20 millinewtons for at finde de bedste stimulusparametre til at strække musklen.

Indstil stimuleringsspændingen til 40 volt. Stimuleringsstrømen vil blive systematisk forøget, indtil der ikke er nogen yderligere stigning i spjætkraft. For at finde den optimale længde, øge muskellængde og aktivere musklen med en enkelt spjæt, indtil den aktive kraft stopper med at stige.

Udfør en en anden tetan sammentrækning for at teste monteringen og strække musklen tilbage til den optimale baseline kraft efter behov. Derefter registrere muskel længde i millimeter med en digital caliper. For at bestemme strålepositionen skal du bruge et stykke røntgenfølsomt papir, der giver et mørkt punkt som svar på røntgenstråler og en videohårsgenerator, til at oprette et trådkors, der flugter med brændemærket på papiret.

Brug den BioCAT-leverede grafiske brugergrænseflade til prøvepositionerne centrere musklen på bjælkepositionen, og prøvestadiet flyttes for at svinge prøvekammeret ved 10 til 20 millimeter i sekundet for at sprede røntgendosis over hele musklen under eksponeringen. Overhold prøven, når den bevæger sig for at undgå store områder af fascia, der indeholder kollagen, og for at sikre, at den forbliver belyst under hele vejen for sin rejse. Arm detektoren og vent på udløseren fra dataerhvervelsessystemet.

Trigger derefter de mekaniske og røntgendata på samme tid for at synkronisere dem. Røntgenmønstrene vil blive indsamlet kontinuerligt i hele protokollen med en eksponeringstid på 10 millisekunder og en eksponeringsperiode på 50 millisekunder. I denne repræsentative isometriske taftisk sammentrækning edl musklen blev holdt i hvile i 0,5 sekunder, før det blev aktiveret i et sekund, efterfulgt af en 1,5-sekunders afslapning.

Den muskel X-ray diffraktion mønster kan give nanometer opløsning strukturelle oplysninger fra strukturer inde i sarcomere. Myosin-baserede laglinjer, der indeholder tykke filamenter er stærke og skarpe i mønstre fra hvilende muskler, mens actin-baserede lag linjer, der indeholder tynde filamenter er mere fremtrædende i mønstre fra ordregivende muskel. Forskel mønstre opnået ved at trække hvilemønster fra ordregivende mønster kan kaste lys over strukturelle ændringer under kraft udvikling i sunde og syge muskler.

Ved at følge disse strukturelle ændringer på millisekund tidsskala af de molekylære begivenheder under muskelsammentrækning og afslapning, kan X-ray diffraktion mønstre afsløre betydelige strukturelle oplysninger. I denne repræsentative ækvatoriale refleksioner analyse ved hjælp af Ækvator rutine i open source MuscleX pakke, ækvatoriale intensitet forholdet angiver nærhed af myosin til actin i hvilende muskel og er tæt korreleret med antallet af vedlagte cross-broer i ordregivende murine skeletmuskulatur. Afstanden mellem de to 1, 0 refleksion er omvendt relateret til interfilament afstand.

En ren dissektion er nøglen til en vellykket intakt muskel X-ray eksperiment, så prøv at undgå eventuelle mekaniske skader under muskel forberedelse. Enhver standard fysiologisk protokol med hele muskler kan gennemføres i disse eksperimenter og kan bruges til at studere muskel aktivering, afslapning og cross-bridge adfærd under hurtig mekanisk forgædning. Genetisk manipulation af mus bliver mere og mere sofistikeret.

Nye transgene musemodeller vil gøre det muligt at udforme mere specifikke og indsigtsfulde eksperimenter med henblik på at angive nye terapeutiske retninger for humane myopatier.