Name: x-ray diffraction of intact murine skeletal muscle as a tool for studying the structural basis of muscle disease
Uploaded: 2019-07-18T12:30:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about X-ray Diffraction of Intact Murine Skeletal Muscle as a Tool for Studying the Structural Basis of Muscle Disease at JoVE.com

Denne forskning brugt ressourcer af Advanced photon source, en U.S. Department of Energy (DOE) Office of Science bruger facilitet drives for DOE Office of Science af Argonne National Laboratory under kontrakt nr. DE-AC02-06CH11357. Dette projekt blev støttet af Grant P41 GM103622 fra National Institute of General Medical Sciences af National Institutes of Health. Brugen af Pilatus 3 1M detektor blev leveret af Grant 1S10OD018090-01 fra NIGMS. Indholdet er udelukkende ansvaret for forfatterne og ikke nødvendigvis afspejler de officielle synspunkter af National Institute of General Medical Sciences eller National Institutes of Health.

Alle dyreforsøg protokoller blev godkendt af Illinois Institute of Technology institutionel dyrepleje og brug udvalg (protokol 2015-001, Godkendelsesdato: 3. november 2015) og fulgte NIH "vejledning til pleje og brug af forsøgsdyr"9 .
1. forberedelse forud for eksperimentet
<ol><li>Forbered 500 mL Ringer's Solution (indeholder: 145 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,0 mM MgSO4, 1,0 mm CaCl2, 10,0 mm Hepes, 11 mm glucose, pH 7,4) frisk for hver dag i forsøget.</li>
	<li>Fyld 200 mL Ringer's opløsning i en sprayflaske og opbevar ved 4 °C køleskab. Fyld en Petri skål (10 cm i diameter) med Ringer's Solution og perfuse med 100% ilt ved at forbinde røret fra en oxygen cylinder til en akvarium luft sten. Petri skålene ("dissekting retter") blev tidligere belagt med en elastomer forbindelse for at tillade indsættelse af stifter under dissektion.</li>
	<li>Forbered metal monterings kroge. Skær to stykker rustfrit stål wire, 0,5 mm i diameter, til den passende længde og bøje tråden i begge ender til at danne kroge. Arranger alle dissekere værktøjer, saks, sutur binde tang, mikro-saks handy til brug. Bemærk: Krogen del skal være omkring 3 mm lang. Den længere ledning (slutter i en krog) skal være ca. 5 cm lang, og den kortere ledning (også slutter i en krog) skal være ca. 1 cm lang for at passe de brugerdefinerede kamre, der anvendes på BioCAT og giver mulighed for en tilstrækkelig vifte af bevægelse for transducer armen.</li>
	<li>
Tilslut og tænd alt udstyret. Dette omfatter en kombineret motor/krafttransducer, motor/krafttransducer controller en High-Power bi-phasic nuværende stimulator, og en computer kontrolleret data erhvervelse/kontrolsystem.
	<ol>
<li>Tænd for dataindsamlingen system og kalibrere det, før du begynder eksperimentet10. Kort, kalibrering af kraften ved at tilføje et sæt af kendte vægte, der dækker op til 50% af den maksimale styrke målt ved kraft transduceren i en lineær progression, på kraft transduceren og registrering af output spænding ændringer. Kalibrer længden ved at anvende et sæt af kendt udgangsspænding til armen arm og måle længden ændring af armen.</li>
		<li>slangerne fra den termiske blok på prøveholderen til et kølet cirkulerende bad, og Indstil temperaturen til at fastholde den ønskede temperatur i kammeret til mellem 10 °C og 40 °C. Bestem dette empirisk på forhånd ved at sætte det cirkulerende bad til en række temperaturer og måle temperaturen i kammeret med et termoelement.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. forberedelse af muskler
<ol><li>
Euthanizing musen
	<ol>
<li>Euthanize musen ved kuldioxid indånding efterfulgt af livmoderhals dislokation.</li>
		<li>Spray huden på bagben med kold Ringer's løsning for at forhindre hår i at blæse i præparatet. Fjern huden ved at skære den væk omkring låret ved hjælp af fine dissektion saks og hurtigt trække huden ned ved hjælp af #5 pincet til at udsætte musklerne.</li>
		<li>Amputate bagbenet og overføre det til en dissekere skål, der er blevet fyldt med oxygenized ringer's løsning, og derefter placere under en binokulær dissekere mikroskop.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Klargøring af en soleus-muskel
	<ol>
<li>Fastgør bagbenet ned i dissekere skålen med gastrocnemius musklen opad. Skær den distale sene af gastrocnemius/soleus muskel gruppe og løft musklerne forsigtigt og langsomt ved at skære væk fascia på hver side af gastrocnemius musklen ved hjælp af fine saks. Isoler gastrocnemius/soleus muskel gruppen fra ekstremiteten efter frigørelse af den proksimale sene af soleus musklen.</li>
		<li>Fastgør muskel gruppen indeholdende gastrocnemius musklen og den distale sene ned i dissekere skålen. Løft soleus musklen forsigtigt via den proksimale sene og adskille den fra gastrocnemius musklen forlader så meget af soleus distale senen intakt som muligt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Klargøring af en extensor digitorium longus (EDL) muskel
	<ol>
<li>Fastgør bagbenet ned i dissekere skålen med tibias forreste muskel vendt opad. Skær fascia langs tibias forreste (Ta) musklen og træk det klart ved hjælp af pincet. Identificer og skær den distale sene af TA-musklen. Løft TA-musklen og skær den forsigtigt ud uden at trække i EDL-musklen.</li>
		<li>Skær åbne den laterale side af knæet og eksponere de to sener. Skær den proximale sene, forlader så meget af senen som muligt stadig fastgjort til musklen, og løft EDL muskel (mediale muskler) ved forsigtigt at trække senen. Skær den distale sene, når den er eksponeret.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Montering af musklen
	<ol>
<li>PIN ned musklen via sener, og trim alle de ekstra fedt, fascia og sener væk så meget som muligt. Indsæt en sene i en præ-bundet knude og binde sutur stramt med sutur binde tang. Binde den anden knude på omkring metal krogen.</li>
		<li>Gentag samme procedure med den lange krog på den anden ende af senen. Sørg for, at ingen af kroppen af musklen er kontaktet af suturerne. Dette vil beskadige præparatet.</li>
		<li>Fastgør den korte krog til bunden af den eksperimentelle kammer og den lange krog til dual-mode krafttransducer/motor. Boble opløsningen i det eksperimentelle kammer med 100% ilt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Optimering af stimulations protokoller og muskel længde
	<ol>
<li>Stræk musklen ved at justere micromanipulatorer fastgjort til transduceren/motoren for at generere en baseline spænding mellem 15 til 20 mN, før du finder de bedste stimulus parametre. Indstil stimulerings spændingen til 40 V. Stimulerings strømmen øges systematisk, indtil der ikke er nogen yderligere stigning i twitch-kraften. Den højeste aktuelle fundet øges med ca. 50% for at sikre en over maksimal aktivering.</li>
		<li>Find den optimale længde, L0, defineret som den muskel længde, der giver maksimal twitch kraft, ved at øge muskel længden og aktivere musklen med en enkelt twitch indtil den aktive kraft (Peak Force minus baseline kraft) stopper med at stige.</li>
		<li>Udfør en kort tetaniske sammentrækning (1 s aktivering) for at teste monteringen og strække musklen tilbage til optimal baseline kraft, hvis det er nødvendigt. Optag muskel længden i mm med en digital kaliber.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. røntgen diffraktion
Bemærk: Følgende beskrivelse er for røntgen diffraktion eksperimenter udført ved hjælp af den lille vinkel røntgen diffraktion instrument på biocat strålinger 18id på den avancerede foton kilde, Argonne nationale laboratorium, men lignende metoder kunne anvendes på andre beamlines f. eks. ID 02 ved ESRF (Frankrig) og BL40XU på SPring8 (Japan). Beamline 18ID drives ved en fast røntgenstråle energi på 12 keV (0,1033 nm bølgelængde) med en hændelse flux på ~ 1013 fotoner per sekund i den fulde stråle.
<ol><li>Vælg en prøve til detektor afstand (kamera længde). Brug en 1,8 m kamera længde til eksperimenter, der undersøger 2,7 nm actin og High Order myosin refleksioner såsom 2,8 nm Meridional refleksioner. Brug et 4-6 m kamera til andre eksperimenter, hvor man primært er interesseret i fine detaljer på Meridian og lag linjer</li>
	<li>
Optimering af prøvens position i stråle
	<ol>
<li>Bestem stråle positionen ved hjælp af et X-ray følsomt papir, der frembringer et mørkt sted som reaktion på røntgenstråler ("en forbrænding"). Brug derefter en video Cross-Hair generator til at skabe et kryds hår justeret med brændemærket på papiret eller blot lave et mærke på video skærmen med en markør pen.</li>
		<li>Brug BioCAT medfølgende grafiske brugergrænseflade til prøve positionerings centeret til at flytte musklen til at være centreret på stråle positionen. Prøvekammeret svingeres ved ~ 10-20 mm/s ved at flytte prøvestadiet for at sprede røntgen dosen over musklen under eksponeringen. Overhold prøven, da den bevæger sig for at undgå store områder af fascia (indeholder kollagen, som vil forurene diffraktion mønstre) og for at sikre, at det forbliver belyst under hele vejen for sin rejse. Bemærk: De nøjagtige trin, der kræves i afsnit 3,3 og 3,4 for at gøre de nødvendige indstillinger og handlinger ved hjælp af strålinger-leverede grafiske brugergrænseflade vil være strålinger og detektor specifikke. Spørg strålinger staff om, hvordan disse operationer skal udføres.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Opsætning af CCD (Charge koblet enhed) detektor for høj opløsning mønstre fra muskler i definerede statiske tilstande (hvilende, eller under isometrisk sammentrækning)
	<ol>
<li>Indstil eksponeringstiden og eksponeringsperioden i den grafiske brugergrænseflade til kontrol softwaren. Tag et mørkt baggrundsbillede, før du tager eksponeringen, og Gentag denne procedure hver 2 timer eller efter ændring af eksponeringstid for at korrigere enhver afdrift i detektorens udlæsningelektronik.</li>
		<li>Røntgenstrålen til den ønskede værdi for eksponeringen. Så tag et billede. Det er ikke muligt at tage sekvenser af billeder med denne detektor. CCD-detektoren skal også bruge flere sekunder for at læse et individuelt billede ud.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Opsætning af pixel array detektor for et tidsløst eksperiment
	<ol>
<li>Indstil antallet af billeder, eksponeringstid, eksponeringsperiode i den grafiske brugergrænseflade. Den pixel array detektor, der bruges her, skal have mindst 1 MS for at blive udlæseligt. Den maksimale frame frekvens for foton tælle detektor er 500 Hz. Brug foton-optællings detektorens udgangssignal til at styre X-ray-udløseren.</li>
		<li>Dæmpe strålen til den ønskede intensitet. Arm detektoren og vente på udløseren fra dataindsamlingen system. Synkroniser de mekaniske og X-ray data ved at udløse dem på samme tid. Røntgen mønstrene indsamles kontinuerligt i hele protokol a med en 1 MS eksponeringstid og en 2 MS eksponeringsperiode. Bemærk: Den nøjagtige eksponeringstid og eksponeringsperiode bør afgøres fra sag til sag for de ønskede oplysninger og den observerede levetid for prøven i strålen. Fjern strålen for ikke at bruge mere røntgenstråle end nødvendigt for at tilvejebringe analyserbare data i den valgte eksponeringsperiode.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. muskel behandling efter eksperiment
<ol><li>Restituere og veje musklen efter hver mekanisk og røntgen eksperiment. Beregn tværsnitsarealet af musklen ved hjælp af den målte muskel længde og muskelmassen11 under antagelse af en muskel tæthed på 1,06 g/ml12.</li>
	<li>Stræk musklen til den eksperimentelle længde og Fastgør Musklen i 10% formalin i 10 min. adskille den faste muskel i en serie af fiber bundter udvalgt fra steder i hele musklen tværsnit3.</li>
	<li>Mål sarcomere længde ved hjælp af en video sarcomere længde målesystem.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ma, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thick-Filament+Extensibility+in+Intact+Skeletal+Muscle.">Thick-Filament Extensibility in Intact Skeletal Muscle.</a> Biophysical Journal. 115 (8), 1580-1588 (2018).</li><li>Ma, W., Gong, H., Irving, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+Head+Configurations+in+Resting+and+Contracting+Murine+Skeletal+Muscle.">Myosin Head Configurations in Resting and Contracting Murine Skeletal Muscle.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (9), (2018).</li><li>Kiss, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nebulin+stiffens+the+thin+filament+and+augments+cross-bridge+interaction+in+skeletal+muscle.">Nebulin stiffens the thin filament and augments cross-bridge interaction in skeletal muscle.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (41), 10369-10374 (2018).</li><li>Ochala, J., Gokhin, D. S., Iwamoto, H., Fowler, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pointed-end+capping+by+tropomodulin+modulates+actomyosin+crossbridge+formation+in+skeletal+muscle+fibers.">Pointed-end capping by tropomodulin modulates actomyosin crossbridge formation in skeletal muscle fibers.</a> Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 28 (1), 408-415 (2014).</li><li>Lindqvist, J., Iwamoto, H., Blanco, G., Ochala, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fraction+of+strongly+bound+cross-bridges+is+increased+in+mice+that+carry+the+myopathy-linked+myosin+heavy+chain+mutation+MYH4(L342Q).">The fraction of strongly bound cross-bridges is increased in mice that carry the myopathy-linked myosin heavy chain mutation MYH4(L342Q).</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 6 (3), 834-840 (2013).</li><li>Huxley, H. E., Stewart, A., Sosa, H., Irving, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+diffraction+measurements+of+the+extensibility+of+actin+and+myosin+filaments+in+contracting+muscle.">X-ray diffraction measurements of the extensibility of actin and myosin filaments in contracting muscle.</a> Biophysical Journal. 67 (6), 2411-2421 (1994).</li><li>Wakabayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+diffraction+evidence+for+the+extensibility+of+actin+and+myosin+filaments+during+muscle+contraction.">X-ray diffraction evidence for the extensibility of actin and myosin filaments during muscle contraction.</a> Biophysical Journal. 67 (6), 2422-2435 (1994).</li><li>Anderson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mavacamten+stabilizes+a+folded-back+sequestered+super-relaxed+state+of+&#946;-cardiac+myosin.">Mavacamten stabilizes a folded-back sequestered super-relaxed state of &#946;-cardiac myosin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2018).</li><li>National Research Council. Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guide+for+the+care+and+use+of+laboratory+animals.">Guide for the care and use of laboratory animals.</a> Institute for Laboratory Animal Research (U.S.) &amp; National Academies Press (U.S.). , (2011).</li><li>. How to Calibrate Your Dual-Mode Lever System Using DMC Available from: <a target="_blank" href="https://aurorascientific.com/how-to-calibrate-your-dual-mode-lever-system-using-dmc/">https://aurorascientific.com/how-to-calibrate-your-dual-mode-lever-system-using-dmc/</a> (2017)</li><li>Alexander, R. M. V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dimensions+of+knee+and+ankle+muscles+and+the+forces+they+exert.">The dimensions of knee and ankle muscles and the forces they exert.</a> Journal of Human Movement Studies. 1, 115-123 (1975).</li><li>Burkholder, T. J., Fingado, B., Baron, S., Lieber, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+Muscle-Fiber+Types+and+Sizes+and+Muscle+Architectural+Properties+in+the+Mouse+Hindlimb.">Relationship between Muscle-Fiber Types and Sizes and Muscle Architectural Properties in the Mouse Hindlimb.</a> Journal of Morphology. 221 (2), 177-190 (1994).</li><li>Jiratrakanvong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> MuscleX: software suite for diffraction X-ray imaging V1.13.1. , (2018).</li><li>Reconditi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+filament+activation+in+the+heart+is+tuned+to+the+mechanical+task.">Myosin filament activation in the heart is tuned to the mechanical task.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), 3240-3245 (2017).</li></ol>

Forfatterne erklærer, at de ikke har konkurrerende finansielle interesser.

Nylige publikationer fra vores gruppe viste, at røntgen mønstre fra mus skeletmuskulatur kan bruges til at kaste lys over sarcomeric strukturelle oplysninger fra muskel i sundhed og sygdom1,2,3 især med den øgede tilgængelighed af genetisk modificerede musemodeller for forskellige myopatier. Høj opløsning mekaniske undersøgelser på enkelte fibre eller små bundter kombineret med X-ray diffraktion er bedst udført af eksperter. Men hvis, mere beskedne mekaniske oplysninger vil være tilstrækkeligt til dine formål, hele musklen forberedelse tillader indsamling af detaljerede røntgen mønstre fra en simpel forberedelse.
En ren dissektion er nøglen til et vellykket kombineret mekanisk og røntgen eksperiment. Det er meget vigtigt ikke at trække på målet musklen samt andre muskler forbundet med soleus eller EDL muskler under dissektion, da dette kunne rive dele af musklen og føre til reduceret kraft. Det kan også føre til beskadigede indre struktur, der vil forringe røntgen mønstre. Da alt vil sprede sig i Røntgenstrålen, er det vigtigt at rense væk ekstra fedt, kollagen i fascia samt eventuelle hår eller løse stumper af væv, mens du gør følgende protokol. For at reducere yderligere overholdelse i musklen forberedelse, det er også vigtigt at sikkert binde sener til kroge, så tæt som muligt på muskel legemet uden at beskadige den.
Forskellige X-ray eksponeringstider kan give forskellige former for information fra den samme muskel. Ved hjælp af den fulde stråle på 18ID, kan et analyserbart ækvatoriale mønster opnås i en 1 MS eksponering (Se figur 2D). For en analyserbar første myosin Layer line refleksion, en 10 MS total eksponeringstid er typisk påkrævet. At indsamle højere orden Meridional refleksioner såsom M15 (2,8 nm myosin Meridional refleksion) og 2,7 nm actin Meridional refleksion, typisk mindst 1 s samlede eksponering er påkrævet, men mere end 2 s samlede eksponering anbefales til høj nøjagtighed Målinger.
Valget af den optimale røntgen detektor til eksperimentet er vigtigt. For de mest detaljerede røntgen mønstre en tilpasset CCD-detektor, såsom den på BioCAT med ca. 40 μm pixels og ~ 65 μm punkt Spread funktioner i phosphor, kan give mønstre med høj dynamikområde og god rumlig opløsning, men kan kun tage en ramme ad gangen. For tids løste eksperimenter kan photon Counting pixel array-detektoren ved BioCAT indsamle røntgen mønstre ved 500 Hz. Størrelsen på 172 μm pixel med denne detektor giver dog ikke tilstrækkelig rumlig opløsning til detaljerede undersøgelser af den inderste del af meridianen, men er tilstrækkelig til de fleste andre formål. BioCAT erhvervede en foton-tælle detektor med høj opløsning, der giver 75 μm reel opløsning ved maksimal billedhastighed på 9.000 Hz. lignende detektorer af denne type forventes at erstatte de nuværende detektorer til muskel studier i løbet af de næste par år.
Med de meget høje strømme af røntgenstråler på tredje generation synchrotrons, stråling skader er en alvorlig bekymring. Det er altid et godt valg at dæmpe strålen for at levere ikke mere stråle end nødvendigt for at observere de ønskede diffraktions funktioner. Den samme totale røntgen eksponering kan opnås ved at forlænge eksponeringstid fra en svækket stråle. En fordel ved foton optælling pixel array detektorer er, at individuelle rammer kan opsummeres sammen uden støj straf. Selv da, stråling skader er muligt. Tegn på stråling skader omfatter dråbe af maksimal kraft af sammentrækning, udtværing af lag linje refleksioner, selv ændring af muskel farve.
En af begrænsningerne ved den intakte mus skeletmuskulatur forberedelse er vanskeligheden med at opnå sarcomere længde fra den intakte muskel under forsøgene. Musklerne er for tykke til video mikroskopi og laser diffraktion. Mens det med den fremtidige udvikling kan være muligt at anslå sarcomere længde direkte fra diffraktions mønstrene14, er den eneste mulighed på nær sigt at måle den efter eksperimentet som beskrevet her.

Synchrotron lille vinkel røntgen diffraktion er den foretrukne metode til at studere nm-skala struktur aktivt kontraherende muskel præparater under fysiologiske forhold. Det er vigtigt, at strukturelle oplysninger fra levende eller flået muskel præparater kan opnås i synkry med fysiologiske data, såsom muskelkraft og længde ændringer. Der har været stigende interesse i at anvende denne teknik til at studere det strukturelle grundlag af nedarvede muskelsygdomme, der har deres grundlag i punktmutationer i sarcomeric proteiner. Den muskel Biofysik samfund har været meget aktiv i at generere transgene musemodeller for disse sygdomme hos mennesker, der kunne give ideelle test senge til strukturelle undersøgelser. Nylige publikationer fra vores gruppe1,2,3 og andre4,5 har indikeret, at røntgen mønstrene fra muse extensor digitorum longus (EDL) og soleus musklerne kan give alle de diffraktion information tilgængelig fra mere traditionelle model organismer såsom frø og kanin psoas skeletmuskulatur. En fordel ved mus skeletmuskulatur forberedelse er den lethed af dissektion og udfører grundlæggende membran-intakt, hele muskler fysiologiske eksperimenter. Dimensionerne af dissekeret muskel har tilstrækkelig masse til at give meget detaljerede muskel mønstre i meget korte røntgen eksponering gange (~ millisekund pr ramme) på tredje generation X-ray beamlines.
Muskel X-ray diffraktion mønstre består af de ækvatoriale refleksioner, Meridional refleksioner samt lag linje refleksioner. Den ækvatoriale intensitet ratio (forholdet mellem intensiteten af 1, 1 og 1,0 ækvatoriale refleksioner, I11/i10), er tæt korreleret til antallet af vedlagte Cross-broer, som er proportional med kraften genereret i mus skeletmuskulatur 2. de meridionale refleksioner, der rapporterer periodiciteter inden for de tykke og tynde filamenter, kan anvendes til at anslå glødetrådens udvidelsesmuligheder1,3,6,7. Diffraktion-funktioner, der ikke er på meridianen og ækvator kaldes laglinjer, som opstår fra de omtrent spiralformede myosin hoveder på overfladen af tyk filament rygraden samt de omtrent spiralformede tynde filamenter. Intensiteten af myosin lag linjer er nært beslægtet med graden af bestilling af myosin hoveder under forskellige betingelser2,8. Alle disse oplysninger kan bruges studere adfærd sarcomeric proteiner in situ i sundhed og sygdom.
Synchrotron røntgen diffraktion af muskler er historisk set udført af hold af højt specialiserede eksperter, men fremskridt inden for teknologi og tilgængeligheden af nye data reduktions værktøjer indikerer, at dette ikke altid behøver at være tilfældet. BioCAT Beamline 18ID på den avancerede photon source, Argonne National Laboratory har dedikeret personale og støttefaciliteter til at udføre muskel X-ray diffraktion eksperimenter, der kan hjælpe nybegyndere til feltet komme i gang med at bruge disse teknikker. Mange brugere vælger formelt at samarbejde med biocat-medarbejdere, men et stigende antal brugere finder, at de kan udføre eksperimenterne og analyserne selv, hvilket reducerer byrden på strålinger-medarbejderne. Det primære mål med dette papir er at give uddannelse, der giver potentielle eksperimenterer med de oplysninger, de har brug for at planlægge og udføre eksperimenter på mus skeletmuskulatur system enten på biocat strålinger eller på andre høje flux beamlines omkring verden, hvor disse eksperimenter ville være mulige.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:793px;" width="793">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:240px;">#5 forceps</td>
			<td style="width:131px;">WPI</td>
			<td style="width:87px;">500342</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:240px;">4/0 surgical suture</td>
			<td style="width:131px;">Braintree Sci</td>
			<td>SUT-S 108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">aquarium air stone</td>
			<td>uxcell</td>
			<td></td>
			<td>a regular air stone from a pet store would be fine</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CCD detector</td>
			<td>Rayonix Inc</td>
			<td>MAR 165 CCD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">data accquisition system</td>
			<td>Aurora Scientific Inc</td>
			<td>610A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:240px;">elastomer compound</td>
			<td style="width:131px;">Dow Corning</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:240px;">High resolution photon counting detector</td>
			<td>Dectris Inc</td>
			<td>EIGER X 500K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">high-power bi-phasic current stimulator</td>
			<td>Aurora Scientific Inc</td>
			<td>701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Iris Scissors</td>
			<td style="width:131px;">WPI</td>
			<td>501263-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MgSO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:240px;">micro scissor</td>
			<td style="width:131px;">WPI</td>
			<td>503365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">motor/force transducer</td>
			<td>Aurora Scientific Inc</td>
			<td>300C-LR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:240px;">petri-dish</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">photon counting detector</td>
			<td>Dectris Inc</td>
			<td>Pilatus 3 1M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stainless Steel wire</td>
			<td style="width:131px;">McMaster-carr</td>
			<td>8908K21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Suture Tying Forceps</td>
			<td style="width:131px;">WPI</td>
			<td>504498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Video sarcomere length measuring system</td>
			<td>Aurora Scientific Inc</td>
			<td>900B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

x-ray diffraction of intact murine skeletal muscle as a tool for studying the structural basis of muscle disease

Transgene musemodeller har været vigtige værktøjer til at studere forholdet mellem genotype til fænotype for menneskelige sygdomme, herunder dem af skeletmuskulatur. Mus skeletmuskulatur har vist sig at producere høj kvalitet røntgen diffraktion mønstre på tredje generation Synchrotron beamlines giver mulighed for at knytte ændringer på niveauet af genotype til funktionelle fænotyper i sundhed og sygdom ved at bestemme de strukturelle konsekvenser af genetiske ændringer. Vi præsenterer detaljerede protokoller for forberedelse af prøver, indsamling af røntgen mønstre og udvinding relevante strukturelle parametre fra røntgen mønstre, der kan hjælpe guide eksperimenterer ønsker at udføre sådanne eksperimenter for sig selv.

Isometrisk tetaniske sammentrækning. Enhver form for klassisk muskel mekaniske eksperiment, såsom isometriske eller isotoniske sammentrækninger, kan udføres med samtidig erhvervelse af røntgen mønstre. Figur 1 A viser eksperimentel opsætning til mekaniske og røntgen eksperimenter. Et eksempel på Force Trace for en isometrisk tetaniske sammentrækning er vist i figur 1B. Musklen blev holdt i hvile for 0,5 s før aktiveret for 1 s. Den mekaniske optagelse stopper 1 s efter stimulus. Røntgen mønstrene blev indsamlet kontinuerligt i hele protokollen på 1 MS eksponeringstid ved 500 Hz.
Røntgen diffraktion mønstre. Musklen X-ray diffraktion mønster kan give nanometer opløsning strukturel information fra strukturer inde i sarcomere. Muskel X-ray diffraktion mønstre er sammensat af fire tilsvarende kvadranter divideret med ækvator og meridianen. Den ækvatoriale mønster opstår fra myofilament pakning inden for sarcomere vinkelret på fiber aksen, mens Meridional mønstre rapporterer strukturelle oplysninger fra myofilaments langs musklen akse. De resterende refleksioner, der ikke er på ækvator eller meridianen, kaldes laglinjer. Laglinjer (f. eks. funktioner med etiketten MLL4 og ALL6 i figur 2A) opstår som følge af det omtrent spiralformede arrangement af molekylære under enheder i myosin, der indeholder tykke filamenter, og actin, der indeholder tynde filamenter. De myosin-baserede lag linjer er stærke og skarpe i mønstre fra hvile muskler (figur 2A), mens actin-baserede lag linjer er mere fremtrædende i mønstre fra kontraherende muskler (figur 2B). Forskelle mønstre opnået ved at trække hvile mønsteret fra det kontraherende mønster (figur 2C) kan kaste lys over strukturelle ændringer under kraftudvikling i raske og syge muskler. Ved at følge disse strukturelle ændringer i millisekund tids skalaen af de molekylære hændelser under muskelsammentrækning kan røntgen diffraktions mønstrene afsløre betydelige strukturelle oplysninger (figur 2D).
Data analyse ved hjælp af MuscleX. Her er et eksempel på Ækvatorial refleksions analyse ved hjælp af "ækvator"-rutinen i MuscleX-pakken (figur 3). MuscleX er en open source-analyse softwarepakke udviklet på BioCAT13. Den ækvatoriale intensitets ratio (I1, 1/i1,0) er en indikator for nærheden af myosin til actin i hvile musklen (figur 3A), mens den er tæt knyttet til antallet af vedlagte Cross-broer i kontraherende ( Figur 3B) murine skeletmuskulatur2. Intensiteten ratio, jeg1, 1/I1,0, er omkring 0,47 i hvile musklen og omkring 1,2 i kontraherende muskel. Afstanden mellem de to 1,0 refleksioner (2 * S1,0) er omvendt relateret til afstanden mellem glødetråden. Detaljerede dokumentationer og manualer til MuscleX er tilgængelige online13.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59559/59559fig1.jpg"> Figur 1 : Mekanisk og X-ray eksperiment setup og protokol. (A) musklen er monteret i den ene ende til en krog inde i det eksperimentelle kammer og den anden ende til en dual mode motor/krafttransducer. Det holdes mellem to Kapton film vinduer for at tillade røntgenstråler at passere igennem. Kammeret fyldes med Ringer's Solution perfbrugt med 100% ilt gennem hele eksperimentet. B) den mekaniske protokol for røntgen forsøg på en muskel under tetaniske sammentrækning. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59559/59559fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59559/59559fig2.jpg"> Figur 2 : EDL X-ray diffraktion mønstre. EDL muskel X-ray diffraktion mønster fra hvile (A) og kontraherende (B) muskel. C) forskellen mellem hvile og kontrakt mønster. Den blå region indikerer høj intensitet i hvile mønstret, mens den gule region repræsenterer høj intensitet i kontrakt mønstret. (D) X-ray diffraktion mønster fra en 1 MS eksponering med EDL muskel. MLL1 = første orden myosin laglinje; MLL4 = fjerde orden myosin laglinje; ALL1 = første ordre actin Layer line ALL6 = sjette ordre actin Layer line; ALL7 = syvende orden actin Layer line; TM = tropomyosin refleksion (indikeret med en hvid boks); M3 = tredje orden Meridional refleksion; M6 = sjette orden Meridional refleksion. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59559/59559fig2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59559/59559fig3.jpg"> Figur 3 : Data analyse af ækvatoriale mønstre ved hjælp af MuscleX. Baggrunden trukket Ækvatorial intensitets ratio profil (mens område) og første fem ordrer (grønne linjer) var egnet til at beregne intensiteten af hver Peak. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59559/59559fig3large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about X-ray Diffraction of Intact Murine Skeletal Muscle as a Tool for Studying the Structural Basis of Muscle Disease at JoVE.com

X-ray Diffraction of Intact Murine Skeletal Muscle as a Tool for Studying the Structural Basis of Muscle Disease

Røntgen diffraktion af intakt murin skeletmuskulatur som et redskab til at studere det strukturelle grundlag for muskelsygdom

Vi præsenterer detaljerede protokoller for udførelse af små-vinkel røntgen diffraktion eksperimenter ved hjælp af intakt mus skeletmuskulatur. Med den brede tilgængelighed af transgene musemodeller for menneskelige sygdomme, kan denne eksperimentelle platform danne en nyttig test seng til belysning af det strukturelle grundlag for genetiske muskelsygdomme

Transgenic mouse models have been important tools for studying the relationship of genotype to phenotype for human diseases including those of skeletal ...

Fysiologisk intakt mus skeletmuskulatur kan producere høj kvalitet X-ray diffraktion mønstre, der indeholder mange strukturelle oplysninger, der kan give indsigt i fysiologiske processer. X-ray diffraktion er den eneste teknik, der gør det muligt at erhverve høj opløsning strukturelle oplysninger fra levende muskelvæv under reelle fysiologiske forhold i reel fysiologisk tid. Mange muskelsygdomme er arvet.Med øget tilgængelighed til genetisk modificere de fleste modeller af myopatier, kan X-ray diffraktion give strukturel indsigt i sygdomsmekanismer og angive terapeutiske strategier. De fleste extensor digitorum longus og soleus muskler er særligt bekvemt til dette formål. Men mange andre muskler i små dyr kan dissekeres intakt og håndteres på samme måde.Før proceduren påbegyndes, skal du tænde for den kombinerede motorkrafttransducer, motorkrafttransducercontrolleren med en høj effekt af bifasisk strømstimulator og et kontrolsystem til dataopkøb af computerkontrol. Dernæst spray huden på bagbenet af musen med kolde Ringer opløsning og bruge fine dissektion saks til at skære huden omkring låret. Brug nummer fem kraftæceser, hurtigt trække huden ned for at udsætte musklerne og amputere baglemben.Læg lemmerne i en elastomerbelagt dissekerende skål, der indeholder iltet Ringers opløsning, og skålen sættes under et kikkertdedemisk mikroskop. At høste soleus muskel, pin bagekstremiteten med gastrocnemius muskel vender opad. Brug fine saks til at skære den distale senen af gastrocnemius/ soleus muskelgruppe.Skær væk fascia på hver side af gastrocnemius musklen at tillade musklerne, der skal løftes forsigtigt og langsomt væk fra knoglen. Derefter frigør den proksimale sene af soleus musklen. Pin ned muskel gruppe, der indeholder gastrocnemius muskel og den distale senen i skålen.Løft soleus musklen forsigtigt via den proksimale senen at adskille det fra gastrocnemius muskel, forlader så meget af sålen distale senen intakt som muligt. At høste extensor digitorum longus eller EDL muskel, pin bagdelen i skålen med skinnebialis forreste muskel vender opad og skære fascia langs skinnebensmuskel. Brug antændre til at trække fascia klar og skære den distale senen af skinnebenet forreste muskel.Løft skinnebensmuskel og skær det forsigtigt ud uden at trække på EDL-musklen, og skær den laterale side af knæet op for at afsløre de to sener. Skær den proksimale senen, forlader os meget af senen som muligt stadig er knyttet til musklen og forsigtigt trække på senen til at løfte EDL muskel. Derefter skæres den distale senen, når den er udsat.At montere den høstede muskel, pin ned musklen via sener og trim så meget af det ekstra fedt, fascia og senen som muligt. Indsæt en sene i en pre-bundet knude og bruge sutur binde kraftbefædre til at binde sutur stramt. Bind den anden knude på omkring metalkrogen og gentag proceduren i den anden ende af senen.Fastgør derefter den korte krog til bunden af forsøgskammeret og den lange krog til den dual-mode krafttransducermotor. Boble opløsningen i forsøgskammeret med 100% ilt. For at optimere stimuleringsprotokollen og muskellængden skal du justere de mikromanipulatorer, der er fastgjort til transducermotoren, for at generere en baseline spænding mellem 15 til 20 millinewtons for at finde de bedste stimulusparametre til at strække musklen.Indstil stimuleringsspændingen til 40 volt. Stimuleringsstrømen vil blive systematisk forøget, indtil der ikke er nogen yderligere stigning i spjætkraft. For at finde den optimale længde, øge muskellængde og aktivere musklen med en enkelt spjæt, indtil den aktive kraft stopper med at stige.Udfør en en anden tetan sammentrækning for at teste monteringen og strække musklen tilbage til den optimale baseline kraft efter behov. Derefter registrere muskel længde i millimeter med en digital caliper. For at bestemme strålepositionen skal du bruge et stykke røntgenfølsomt papir, der giver et mørkt punkt som svar på røntgenstråler og en videohårsgenerator, til at oprette et trådkors, der flugter med brændemærket på papiret.Brug den BioCAT-leverede grafiske brugergrænseflade til prøvepositionerne centrere musklen på bjælkepositionen, og prøvestadiet flyttes for at svinge prøvekammeret ved 10 til 20 millimeter i sekundet for at sprede røntgendosis over hele musklen under eksponeringen. Overhold prøven, når den bevæger sig for at undgå store områder af fascia, der indeholder kollagen, og for at sikre, at den forbliver belyst under hele vejen for sin rejse. Arm detektoren og vent på udløseren fra dataerhvervelsessystemet.Trigger derefter de mekaniske og røntgendata på samme tid for at synkronisere dem. Røntgenmønstrene vil blive indsamlet kontinuerligt i hele protokollen med en eksponeringstid på 10 millisekunder og en eksponeringsperiode på 50 millisekunder. I denne repræsentative isometriske taftisk sammentrækning edl musklen blev holdt i hvile i 0,5 sekunder, før det blev aktiveret i et sekund, efterfulgt af en 1,5-sekunders afslapning.Den muskel X-ray diffraktion mønster kan give nanometer opløsning strukturelle oplysninger fra strukturer inde i sarcomere. Myosin-baserede laglinjer, der indeholder tykke filamenter er stærke og skarpe i mønstre fra hvilende muskler, mens actin-baserede lag linjer, der indeholder tynde filamenter er mere fremtrædende i mønstre fra ordregivende muskel. Forskel mønstre opnået ved at trække hvilemønster fra ordregivende mønster kan kaste lys over strukturelle ændringer under kraft udvikling i sunde og syge muskler.Ved at følge disse strukturelle ændringer på millisekund tidsskala af de molekylære begivenheder under muskelsammentrækning og afslapning, kan X-ray diffraktion mønstre afsløre betydelige strukturelle oplysninger. I denne repræsentative ækvatoriale refleksioner analyse ved hjælp af Ækvator rutine i open source MuscleX pakke, ækvatoriale intensitet forholdet angiver nærhed af myosin til actin i hvilende muskel og er tæt korreleret med antallet af vedlagte cross-broer i ordregivende murine skeletmuskulatur. Afstanden mellem de to 1, 0 refleksion er omvendt relateret til interfilament afstand.En ren dissektion er nøglen til en vellykket intakt muskel X-ray eksperiment, så prøv at undgå eventuelle mekaniske skader under muskel forberedelse. Enhver standard fysiologisk protokol med hele muskler kan gennemføres i disse eksperimenter og kan bruges til at studere muskel aktivering, afslapning og cross-bridge adfærd under hurtig mekanisk forgædning. Genetisk manipulation af mus bliver mere og mere sofistikeret.Nye transgene musemodeller vil gøre det muligt at udforme mere specifikke og indsigtsfulde eksperimenter med henblik på at angive nye terapeutiske retninger for humane myopatier.

Education

Research

JoVE Core

JoVE Journal

Cell Biology

Developmental Biology

Unit 1

The Cytoskeleton I: Actin and Microfilaments

Analyzing Cells and Proteins

SCIENTISTS IN ACTION

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analyse af zebrafisk Larver Skeletmuskel Integritet med Evans blå farvestof

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Using Isolated Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High throughput Microplate Respiratory Measurements

Brug af Isoleret Mitokondrier fra minimale mængder af Mouse Skeletmuskel for High throughput Mikropladekrav Respiratory Målinger

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of ...

Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection

Induktion af akut Skeletal Muscle Regeneration af cardiotoxin Injection

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced ...

Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans

Forberedelse og Kultur Myogenic precursorceller / Primær Myoblaster af skeletmuskulatur af Voksen og Aged Mennesker

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting ...

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Evaluering af skade-induceret gulne og In Vivo omprogrammering i den skeletmuskulatur

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and ...

Application of Chronic Stimulation to Study Contractile Activity-induced Rat Skeletal Muscle Phenotypic Adaptations

Anvendelse af kronisk stimulering til at studere kontraktile aktivitet-induceret rotte skeletmuskulatur fænotypiske tilpasninger

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Identifikation af skeletmuskulatur satellit celler ved immunfluorescens med Pax7 og Laminin antistoffer

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Billeddannelse af muskel-sene morfogenese i Drosophila pupper

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Isolation, Culture, Characterization, and Differentiation of Human Muscle Progenitor Cells from the Skeletal Muscle Biopsy Procedure

Isolation, kultur, karakterisering og differentiering af humane muskel stamceller fra skeletmuskulaturen biopsi procedure

The use of primary human tissue and cells is ideal for the investigation of biological and physiological processes such as the skeletal muscle ...

Performing Human Skeletal Muscle Xenografts in Immunodeficient Mice

Udførelse af humane skeletmuskulatur Xenografts i immundefekt mus

Treatment effects observed in animal studies often fail to be recapitulated in clinical trials. While this problem is multifaceted, one reason for this ...