Röntgendiffractie van intact Murine skeletspieren als een instrument voor het bestuderen van de structurele basis van spierziekte

Fysiologisch intacte muis skeletspier kan produceren hoge kwaliteit X-ray diffractie patronen met veel structurele informatie die inzicht kan geven in fysiologische processen. Röntgendiffractie is de enige techniek die het mogelijk maakt structurele informatie met hoge resolutie uit levend spierweefsel onder echte fysiologische omstandigheden in echte fysiologische tijd te verkrijgen. Veel spierziekten worden geërfd.

Met een verhoogde beschikbaarheid om de meeste modellen van myopathieën genetisch te wijzigen, kan de röntgendiffractie structurele inzichten bieden in ziektemechanismen en therapeutische strategieën aangeven. De meeste extensor digitorum longus en soleus spieren zijn bijzonder handig voor dit doel. Maar veel andere spieren bij kleine dieren kunnen intact worden ontleed en op een vergelijkbare manier worden behandeld.

Schakel voor het begin van de procedure de gecombineerde motorkrachttransducer, de motorkrachttransducercontroller met een hoog vermogen bifasische stroomstimulator en een controlesysteem voor computercontrolegegevenscontrole in. Vervolgens, spray de huid op de achterste ledemaat van de muis met koude Ringer's oplossing en gebruik fijne dissectie schaar om de huid te snijden rond de dij. Met behulp van nummer vijf tangen, snel trek de huid naar beneden om de spieren bloot te stellen en amputeren de achterste ledemaat.

Plaats de ledemaat in een met elastomeer bedekte ontleedschotel met zuurstofhoudende Ringer's oplossing en plaats de schotel onder een verrekijker ontleden microscoop. Om de soleusspier te oogsten, speld de achterste ledemaat met de gastrocnemiusspier naar boven gericht. Gebruik fijne schaar om de distale pees van de gastrocnemius/soleus spiergroep te snijden.

Snijd de fascia aan weerszijden van de gastrocnemiusspier weg om de spieren zachtjes en langzaam van het bot te laten wegtillen. Bevrijd vervolgens de proximale pees van de soleusspier. Pin de spiergroep met de gastrocnemius spier en de distale pees in de schotel.

Til de soleusspier voorzichtig op via de proximale pees om deze te scheiden van de gastrocnemiusspier, waardoor zoveel mogelijk van de zool distale pees intact blijft. Om de extensor digitorum longus of EDL spier te oogsten, speld de achterste ledemaat in de schotel met de tibialis voorste spier naar boven gericht en snijd de fascia langs de tibialis voorste spier. Gebruik tangen om de fascia duidelijk te trekken en snijd de distale pees van de tibialis voorste spier.

Til de tibialis voorste spier en snijd het zorgvuldig uit zonder te trekken op de EDL spier, en snijd de zijkant van de knie open om de twee pezen bloot te leggen. Snijd de proximale pees, waardoor we een groot deel van de pees mogelijk nog steeds bevestigd aan de spier en voorzichtig trek op de pees om de EDL spier op te heffen. Snijd vervolgens de distale pees zodra deze wordt blootgesteld.

Om de geoogste spier te monteren, pin de spier via de pezen en trim zo veel van het extra vet, fascia en pees mogelijk. Steek een pees in een vooraf gebonden knoop en gebruik hechting bindkrachten om de hechting stevig vast te binden. Bind de tweede knoop rond de metalen haak en herhaal de procedure aan de andere kant van de pees.

Bevestig vervolgens de korte haak aan de onderkant van de experimentele kamer, en de lange haak op de dual-mode kracht transducer motor. Bel de oplossing in de experimentele kamer met 100% zuurstof. Om het stimulatieprotocol en de spierlengte te optimaliseren, passen de micromanipulators die aan de transducermotor zijn bevestigd aan om een basislijnspanning te genereren tussen 15 tot 20 millinewtons om de beste stimulusparameters te vinden om de spier te strekken.

Stel de stimulatiespanning in op 40 volt. De stimulatie stroom zal systematisch worden verhoogd totdat er geen extra toename van twitch kracht. Om de optimale lengte te vinden, verhoog de spierlengte en activeer de spier met een enkele twitch totdat de actieve kracht stopt met toenemen.

Voer een tetanische contractie van een seconde uit om de montage te testen en de spier zo nodig terug te rekken naar de optimale basiskracht. Neem vervolgens de spierlengte in millimeters op met een digitale remklauw. Om de positie van de bundel te bepalen, gebruikt u een stuk röntgengevoelig papier dat een donkere vlek produceert in reactie op röntgenfoto's en een videokruishargenerator om een crosshair te maken dat is uitgelijnd met het brandmerk op het papier.

Met behulp van de door BioCAT geleverde grafische gebruikersinterface naar de monsterpositioner, centreert u de spier op de bundelpositie en verplaatst u de monsterfase om de monsterkamer te oscilleren met 10 tot 20 millimeter per seconde om de röntgendosis tijdens de blootstelling over de hele spier te verspreiden. Let op het monster als het beweegt om grote gebieden van fascia die collageen bevatten te voorkomen en om ervoor te zorgen dat het blijft verlicht tijdens het hele pad van zijn reis. Bewapen de detector en wacht op de trigger van het data-acquisitiesysteem.

Activeer vervolgens tegelijkertijd de mechanische en röntgengegevens om ze te synchroniseren. De röntgenpatronen worden continu verzameld in het hele protocol met een belichtingstijd van 10 milliseconden en een belichtingsperiode van 50 milliseconden. In deze representatieve isometrische tetanische contractie werd de EDL spier 0,5 seconden in rust gehouden voordat deze een seconde werd geactiveerd, gevolgd door een ontspanning van 1,5 seconden.

De spier X-ray diffractie patroon kan geven nanometer resolutie structurele informatie uit structuren in de sarcomere. Myosine-gebaseerde laaglijnen met dikke filamenten zijn sterk en scherp in patronen van rustspieren, terwijl op actin gebaseerde laaglijnen met dunne filamenten prominenter zijn in patronen van aanbestedende spieren. Verschil patronen verkregen door het aftrekken van het rustpatroon van de aanbestedende patroon kan licht werpen op structurele veranderingen tijdens de ontwikkeling van kracht in gezonde en zieke spier.

Door het volgen van deze structurele veranderingen op de milliseconde tijdschaal van de moleculaire gebeurtenissen tijdens spiercontractie en ontspanning, de X-ray diffractie patronen kunnen onthullen aanzienlijke structurele informatie. In deze representatieve equatoriale reflecties analyse met behulp van de Equator routine in de open source MuscleX pakket, de equatoriale intensiteit verhouding geeft de nabijheid van myosine te actin in rustspier en is nauw gecorreleerd aan het aantal aangesloten bruggen in het contracteren murine skeletspier. De afstand tussen de twee 1, 0 reflectie is omgekeerd gerelateerd aan de interfilament afstand.

Een schone dissectie is de sleutel voor een succesvolle intacte spier X-ray experiment, dus probeer mechanische schade te voorkomen tijdens de spiervoorbereiding. Elk standaard fysiologisch protocol met hele spieren kan worden geïmplementeerd in deze experimenten en kan worden gebruikt om spieractivering, ontspanning en cross-bridge gedrag te bestuderen tijdens snelle mechanische vergankelijkheid. Genetische manipulatie van muizen wordt steeds geavanceerder.

Nieuwe transgene muismodellen zullen het mogelijk maken meer specifieke en inzichtelijke experimenten te ontwerpen om nieuwe therapeutische richtingen voor menselijke myopathieën aan te geven.