Name: x-ray diffraction of intact murine skeletal muscle as a tool for studying the structural basis of muscle disease
Uploaded: 2019-07-18T12:30:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about X-ray Diffraction of Intact Murine Skeletal Muscle as a Tool for Studying the Structural Basis of Muscle Disease at JoVE.com

Denne forskningen anvendt ressursene av det avansert Foton kilde, en U.S. avdeling av energi (DOE) kontor av vitenskap bruker Letter operert for DOE kontor av vitenskap av Argonne nasjonal laboratorium under kontrakt nei. DE-AC02-06CH11357. Dette prosjektet ble støttet av stipend P41 GM103622 fra National Institute of General Medical Sciences i National Institutes of Health. Bruk av Pilatus 3 1M detektor ble levert av Grant 1S10OD018090-01 fra NIGMS. Innholdet er utelukkende ansvaret til forfatterne og reflekterer ikke nødvendigvis den offisielle synspunktene til National Institute of General Medical Sciences eller National Institutes of Health.

Alle dyr eksperimenter protokoller ble godkjent av Illinois Institute of Technology institusjonelle Animal Care og use Committee (protokoll 2015-001, godkjenningsdato: 3. november 2015) og fulgte NIH "guide for omsorg og bruk av Laboratoriedyr"9 .
1. pre-eksperiment forberedelse
<ol><li>Klargjør 500 mL ringe oppløsning (inneholder: 145 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,0 mM MgSO4, 1,0 mm CaCl2, 10,0 mM HEPES, 11 mM glukose, pH 7,4) fersk for hver dag i eksperimentet.</li>
	<li>Fyll 200 mL ringe løsning i en sprøyte flaske og oppbevar den ved 4 ° c kjøleskap. Fyll en Petri parabolen (10 cm i diameter) med ringer ' s løsning og perfuse med 100% oksygen ved å koble røret fra en oksygen sylinder til et akvarium luft stein. Den Petri retter ("dissekere retter") var tidligere belagt med en elastomer sammensatte å tillate innsetting pins under disseksjon.</li>
	<li>Forbered metall monterings kroker. Skjær to stykker av rustfritt stål wire, 0,5 mm i diameter, til riktig lengde og bøy ledningen i begge ender for å danne kroker. Ordne alle dissekere verktøy, saks, Sutur binde tang, mikro-saks hendig for bruk. Merk: Kroken delen bør være ca 3 mm lang. Jo lengre ledning (som ender i en krok) bør være ca 5 cm lang, og den kortere wire (også ender i en krok) bør være ca 1 cm lang for å passe de tilpassede kamre som brukes på BioCAT og gir mulighet for et tilstrekkelig utvalg av bevegelse for svinger armen.</li>
	<li>
Koble til og slå på alt utstyret. Dette inkluderer en kombinert motor/kraft svinger, motor/styrke svinger kontrolleren en høyeffekts bi-phasic gjeldende stimulator, og en datamaskinstyrt datainnsamling/kontrollsystem.
	<ol>
<li>Slå på datainnsamlings systemet, og Kalibrer det før du begynner eksperimentet10. Kort kalibrering av kraften ved å legge til et sett av kjente vekter, som dekker opptil 50% av den maksimale kraften målt ved kraft svingeren i en lineær progresjon, på kraft svingeren og registrere utgangs spennings endringene. Kalibrere lengden ved å bruke et sett av kjente utgangsspenning til spaken armen og måle lengden endring av armen.</li>
		<li>Koble slangene fra den termiske blokken på prøve holderen til et kjøleskap som sirkulerer bad, og Still inn temperaturen for å opprettholde ønsket temperatur i kammeret til mellom 10 ° c og 40 ° c. Bestem dette empirisk forut for tiden ved å sette sirkulerende bad til en rekke temperaturer og måle temperaturen i kammeret med en Termo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. muskel forberedelse
<ol><li>
Euthanizing musa
	<ol>
<li>Euthanize musen av karbondioksid inhalasjon etterfulgt av cervical forvridning.</li>
		<li>Spray huden på bakdelen med kald ringer løsning for å hindre at håret blåser inn i preparatet. Fjern huden ved å klippe den bort rundt låret ved hjelp av fine disseksjon saks og raskt trekke huden ned med #5 tang for å avdekke musklene.</li>
		<li>Amputere bak benet og Overfør det til en dissekere rett som har blitt fylt med oxygenized ringer, og plasser deretter under et kikkert dissekere mikroskop.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Klargjøre en soleus muskel
	<ol>
<li>Fest bak benet ned i dissekere parabolen med gastrocnemius muskelen vendt oppover. Skjær den fjerne sene av gastrocnemius/soleus muskel gruppe og løft musklene forsiktig og langsomt ved å skjære bort konseptet på hver side av gastrocnemius muskelen ved hjelp av fin saks. Isolere gastrocnemius/soleus muskel gruppe fra lem etter frigjøre proksimale sene av soleus muskelen.</li>
		<li>PIN muskelgruppen som inneholder gastrocnemius muskelen og den som er i ro ned i dissekere parabolen. Løft soleus muskelen forsiktig via proksimale sene og skille den fra gastrocnemius muskelen forlater så mye av soleus fjerne senen intakt som mulig.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Klargjøre en extensor digitorium Longus (EDL) muskel
	<ol>
<li>Fest bak benet ned i dissekere parabolen med tibialispuls fremre muskelen vendt oppover. Skjær konseptet langs tibialispuls fremre (TA) muskelen og trekk det klart ved hjelp av tang. Identifiser og skjær den som ikke er i TA-muskelen. Løft TA muskelen og skjær den forsiktig ut uten å trekke på EDL muskelen.</li>
		<li>Skjær åpne den laterale siden av kneet og utsett de to sener. Skjær proksimale sene, etterlot så mye av senen som mulig fortsatt festet til muskelen, og løft EDL muskelen (midtre muskel) ved å forsiktig trekke senen. Skjær den sene senen når den utsettes.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Montering av muskelen
	<ol>
<li>PIN ned muskelen via sener, og trim alle ekstra fett, konseptkjedene og sene bort så mye som mulig. Sett en sene inn i en pre-bundet knute og knytte Sutur tett med Sutur binde tang. Bind den andre knuten på rundt metall kroken.</li>
		<li>Gjenta samme prosedyre med den lange kroken på den andre enden av senen. Pass på at ingen av kroppen av muskelen er kontaktet av sting. Dette vil skade preparatet.</li>
		<li>Fest den korte kroken til bunnen av den eksperimentelle kammeret og den lange kroken til Dual Mode Force svinger/motor. Bubble løsningen i det eksperimentelle kammeret med 100% oksygen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Optimalisering av stimulering protokoller og muskel lengde
	<ol>
<li>Strekk muskelen ved å justere micromanipulators festet til transduseren/motoren for å generere en Baseline spenning mellom 15 til 20 mN før du finner den beste stimulans parametere. Sett stimulering spenning til 40 V. Stimulering strømmen økes systematisk til det ikke er ytterligere økning i twitch-kraft. Den høyeste strømmen som blir funnet, økes med ca. 50% for å sikre at aktiveringen blir maksimal.</li>
		<li>Finn den optimale lengden, L0, definert som muskel lengde som gir maksimal twitch-kraft, ved å øke muskel lengden og aktivere muskelen med en enkelt trekning til den aktive kraften (peak Force minus Baseline Force) stopper økende.</li>
		<li>Utfør en kort tetanic sammentrekning (1 s aktivering) for å teste montering og strekke muskelen tilbake til optimal Baseline kraft om nødvendig. Ta opp muskel lengde i mm med en digital tykkelse.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. røntgen Diffraksjon
Merk: Følgende beskrivelse er for X-ray Diffraksjon eksperimenter gjort ved hjelp av liten vinkel X-ray Diffraksjon instrument på BioCAT beamline 18ID på Advanced Foton kilde, Argonne National Laboratory men lignende metoder kan være ansatt på andre beamlines som ID 02 på ESRF (Frankrike) og BL40XU på SPring8 (Japan). Beamline 18ID drives på en fast X-ray stråle energi av 12 keV (0,1033 NM bølgelengde) med en hendelse Flux på ~ 1013 fotoner per sekund i full stråle.
<ol><li>Velg en prøve til detektor avstand (kamera lengde). Bruk en 1,8 meter lang kamera lengde for eksperimenter som undersøker 2,7 NM utgangen og høy orden myosin refleksjoner som 2,8 NM Meridional refleksjoner. Bruk en 4-6 m kamera for andre eksperimenter, hvor man er primært interessert i fine detaljer på Meridian og lag linjer</li>
	<li>
Optimalisere plasseringen av prøven i strålen
	<ol>
<li>Bestem strålen posisjon ved hjelp av en bit av X-ray sensitiv papir som gir en mørk flekk som svar på røntgenstråler ("a Burn"). Deretter bruker en video Cross-Hair generator for å lage et kryss-hår på linje med brenne merke på papiret eller bare lage et merke på video skjermen med en markør penn.</li>
		<li>Bruk BioCAT leveres grafisk brukergrensesnitt til prøven positioner å flytte muskelen å være sentrert på strålen posisjon. Svinge prøven kammer på ~ 10-20 mm/s ved å flytte prøven scenen for å spre X-ray dose over muskelen under eksponering. Observer prøven som den beveger seg for å unngå store områder av konseptet (inneholder kollagen som vil forurense Diffraksjon mønstre) og for å sikre at den forblir opplyst under hele veien for sin reise. Merk: Det pressepenger av skritt krevde inne avsnitt 3,3 og 3,4 å vil få krevde innfatningene og aksjonene benytter det beamline-forsynte grafisk bruker grenseflate ville være beamline og merker spesifikk. Spør beamline personalet om hvordan du skal utføre disse operasjonene.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sette opp CCD (charge kombinert enhet) detektor for høy oppløsning mønstre fra muskel i definerte statiske tilstander (hvile, eller under Isometrisk sammentrekning)
	<ol>
<li>Sett opp eksponeringstid og eksponerings periode i det grafiske brukergrensesnittet til Kontrollprogramvaren. Ta et mørkt bakgrunnsbilde før du tar eksponering og gjenta denne prosedyren hver 2 timer eller etter endring av eksponeringstid å korrigere noen drift i detektoren avlesning elektronikk.</li>
		<li>Dempe røntgen strålen til ønsket verdi for eksponeringen. Så ta et bilde. Det er ikke mulig å ta sekvenser av bilder med denne detektoren. Det CCD merker likeledes nødvendig adskillige sekunder å lese ut en individ image.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sette opp pixel array Detector for et tids løst eksperiment
	<ol>
<li>Sett opp antall bilder, eksponeringstid, eksponerings periode i det grafiske brukergrensesnittet. Pixel array Detector brukes her trenger minst 1 MS til avlesning. Det maksimum rammen hyppigheten for Foton opptellingen merker er 500 Hz. Bruk signal signalet for Foton telling til å kontrollere røntgen lukkeren.</li>
		<li>Dempe strålen til ønsket intensitet. Bevæpne detektoren og vent på utløseren fra datainnsamlings systemet. Synkroniser mekaniske og røntgen data ved å utløse dem på samme tid. The X-ray mønstre er samlet kontinuerlig gjennom protokollen a med en 1 MS eksponeringstid og en 2 MS eksponerings periode. Merk: Den nøyaktige eksponeringstiden og eksponerings perioden bør fastsettes på et enkelt tilfelle for den ønskede informasjonen og den observerte levetiden til prøven i strålen. Dempe strålen for å bruke mer Røntgenstråle enn det som er nødvendig for å gi analyzable data i den valgte eksponerings perioden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. post-eksperiment muskel behandling
<ol><li>Komme seg og veie muskelen etter hvert mekanisk og røntgen eksperiment. Beregn tverrsnitt av muskelen ved hjelp av målt muskel lengde og muskel massen11 forutsatt en muskel tetthet på 1,06 g/ml12.</li>
	<li>Strekk muskelen til den eksperimentelle lengden og fikse muskelen i 10% formalin i 10 min. Skill den faste muskelen i en rekke fiber bunter valgt fra steder i hele muskelen tverrsnitt3.</li>
	<li>Mål sarkomerlengde lengde ved hjelp av et video sarkomerlengde lengde målesystem.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ma, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thick-Filament+Extensibility+in+Intact+Skeletal+Muscle.">Thick-Filament Extensibility in Intact Skeletal Muscle.</a> Biophysical Journal. 115 (8), 1580-1588 (2018).</li><li>Ma, W., Gong, H., Irving, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+Head+Configurations+in+Resting+and+Contracting+Murine+Skeletal+Muscle.">Myosin Head Configurations in Resting and Contracting Murine Skeletal Muscle.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (9), (2018).</li><li>Kiss, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nebulin+stiffens+the+thin+filament+and+augments+cross-bridge+interaction+in+skeletal+muscle.">Nebulin stiffens the thin filament and augments cross-bridge interaction in skeletal muscle.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (41), 10369-10374 (2018).</li><li>Ochala, J., Gokhin, D. S., Iwamoto, H., Fowler, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pointed-end+capping+by+tropomodulin+modulates+actomyosin+crossbridge+formation+in+skeletal+muscle+fibers.">Pointed-end capping by tropomodulin modulates actomyosin crossbridge formation in skeletal muscle fibers.</a> Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 28 (1), 408-415 (2014).</li><li>Lindqvist, J., Iwamoto, H., Blanco, G., Ochala, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fraction+of+strongly+bound+cross-bridges+is+increased+in+mice+that+carry+the+myopathy-linked+myosin+heavy+chain+mutation+MYH4(L342Q).">The fraction of strongly bound cross-bridges is increased in mice that carry the myopathy-linked myosin heavy chain mutation MYH4(L342Q).</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 6 (3), 834-840 (2013).</li><li>Huxley, H. E., Stewart, A., Sosa, H., Irving, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+diffraction+measurements+of+the+extensibility+of+actin+and+myosin+filaments+in+contracting+muscle.">X-ray diffraction measurements of the extensibility of actin and myosin filaments in contracting muscle.</a> Biophysical Journal. 67 (6), 2411-2421 (1994).</li><li>Wakabayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+diffraction+evidence+for+the+extensibility+of+actin+and+myosin+filaments+during+muscle+contraction.">X-ray diffraction evidence for the extensibility of actin and myosin filaments during muscle contraction.</a> Biophysical Journal. 67 (6), 2422-2435 (1994).</li><li>Anderson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mavacamten+stabilizes+a+folded-back+sequestered+super-relaxed+state+of+&#946;-cardiac+myosin.">Mavacamten stabilizes a folded-back sequestered super-relaxed state of &#946;-cardiac myosin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2018).</li><li>National Research Council. Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guide+for+the+care+and+use+of+laboratory+animals.">Guide for the care and use of laboratory animals.</a> Institute for Laboratory Animal Research (U.S.) &amp; National Academies Press (U.S.). , (2011).</li><li>. How to Calibrate Your Dual-Mode Lever System Using DMC Available from: <a target="_blank" href="https://aurorascientific.com/how-to-calibrate-your-dual-mode-lever-system-using-dmc/">https://aurorascientific.com/how-to-calibrate-your-dual-mode-lever-system-using-dmc/</a> (2017)</li><li>Alexander, R. M. V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dimensions+of+knee+and+ankle+muscles+and+the+forces+they+exert.">The dimensions of knee and ankle muscles and the forces they exert.</a> Journal of Human Movement Studies. 1, 115-123 (1975).</li><li>Burkholder, T. J., Fingado, B., Baron, S., Lieber, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+Muscle-Fiber+Types+and+Sizes+and+Muscle+Architectural+Properties+in+the+Mouse+Hindlimb.">Relationship between Muscle-Fiber Types and Sizes and Muscle Architectural Properties in the Mouse Hindlimb.</a> Journal of Morphology. 221 (2), 177-190 (1994).</li><li>Jiratrakanvong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> MuscleX: software suite for diffraction X-ray imaging V1.13.1. , (2018).</li><li>Reconditi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+filament+activation+in+the+heart+is+tuned+to+the+mechanical+task.">Myosin filament activation in the heart is tuned to the mechanical task.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), 3240-3245 (2017).</li></ol>

Forfatterne erklærer at de ikke har noen konkurrerende finansielle interesser.

Nyere publikasjoner fra vår gruppe viste at røntgen mønstre fra musen skjelettmuskelen kan brukes til å belyse sarcomeric strukturelle informasjon fra muskel i helse og sykdom1,2,3 spesielt med den økte tilgjengeligheten av genetiske modifiserte musemodeller for ulike myopatier. Høyoppløselig mekaniske studier på enkelt fibre eller små bunter kombinert med røntgen Diffraksjon gjøres best av eksperter. Hvis imidlertid mer beskjeden mekanisk informasjon vil være tilstrekkelig for dine formål, gjør hele muskel forberedelser samling av detaljerte røntgen mønstre fra en enkel forberedelse.
En ren disseksjon er nøkkelen til en vellykket kombinert mekanisk og X-ray eksperiment. Det er svært viktig å ikke dra på målet muskelen samt andre muskler knyttet til soleus eller EDL musklene under disseksjon siden dette kan rive deler av muskelen og føre til redusert kraft. Det kan også føre til skadet indre struktur som vil forringe X-ray mønstre. Siden alt vil spre seg i X-ray strålen, er det viktig å rense bort noe ekstra fett, kollagen i konseptet, samt eventuelle hår eller løse biter av vev mens du gjør følgende protokoll. For å redusere ytterligere samsvar i muskel forberedelser, det er også viktig å sikkert knytte sener til krokene, så nær som mulig til muskel kroppen uten å skade den.
Ulike X-ray eksponeringstider kan gi ulike typer informasjon fra samme muskelen. Ved hjelp av full stråle på 18ID kan en analyzable ekvator fås i en 1 MS eksponering (se figur 2D). For en analyzable første myosin lag linje refleksjon, er en 10 MS totale eksponeringstid vanligvis nødvendig. For å samle høyere orden Meridional refleksjoner som M15 (2,8 NM myosin Meridional refleksjon) og 2,7 NM utgangen Meridional refleksjon, vanligvis minst 1 s total eksponering er nødvendig, men mer enn 2 s total eksponering anbefales for høy nøyaktighet Målinger.
Valget av den optimale røntgen detektoren for eksperimentet er viktig. For de mest detaljerte røntgen mønstre en tilpasset CCD-detektor, slik som den på BioCAT med ca. 40 μm piksler og ~ 65 μm punkt spredt funksjoner i fosfor, kan gi mønstre med høy dynamisk rekkevidde og god romlig oppløsning, men kan bare ta ett bilde av gangen. For tid løst eksperimenter, det Foton telling pixel array detektor på BioCAT kan samle røntgen mønstre på 500 Hz. The 172 μm pixel størrelse med denne detektoren, men gir ikke tilstrekkelig romlig oppløsning for detaljerte studier av indre del av Meridian, men er tilstrekkelig for de fleste andre formål. BioCAT ervervet en høy-resolution Foton opptellingen merker skaffer 75 μm virkelig resolution for maksimum rammen rate av 9 000 Hz. lignende detektorer av denne typen ventes å erstatte aktuelle detektorer for muskel studier i løpet av de neste årene.
Med den svært høye flukser av røntgenstråler på tredje generasjons synchrotrons, er strålings skade en alvorlig bekymring. Det er alltid et godt valg å dempe strålen til å levere noe mer stråle enn det som er nødvendig for å observere de ønskede Diffraksjon funksjoner. Den samme totale røntgen eksponeringen kan oppnås ved å forlenge eksponeringstiden fra en svekket stråle. En fordel av Foton telling pixel array detektorer er at enkelte rammer kan oppsummeres sammen med ingen støy straff. Selv da er strålings skade mulig. Tegn på stråling skader inkluderer dråpe maksimal kraft av sammentrekning, smøre av lag linje refleksjoner, selv endring av muskel farge.
En av begrensningene i intakt mus Skjelettmuskel forberedelser er vanskeligheten med å skaffe sarkomerlengde lengde fra intakt muskelen under eksperimentene. Musklene er for tykke for video mikroskopi og laser Diffraksjon. Mens med fremtidig utvikling kan det være mulig å anslå sarkomerlengde lengde direkte fra Diffraksjon mønstre14, i nær sikt det eneste alternativet er å måle den etter eksperimentet som beskrevet her.

Synchrotron liten vinkel X-ray Diffraksjon er metoden for valg for å studere NM-skala struktur av aktivt kontraktørselskaper muskel preparater under fysiologiske forhold. Viktigere, strukturelle informasjon fra levende eller flådd muskel preparater kan fås i Synchrony med fysiologiske data, for eksempel muskelkraft og lengde endringer. Det har vært økende interesse for å anvende denne teknikken til å studere den strukturelle grunnlaget for arvet muskel sykdommer som har sitt grunnlag i punkt mutasjoner i sarcomeric proteiner. Den muskel biofysikk samfunnet har vært veldig aktiv i å generere transgene Mouse modeller for disse menneskelige sykdommer som kan gi ideelle test senger for strukturelle studier. Nyere publikasjoner fra vår gruppe1,2,3 og andre4,5 har indikert at X-ray mønstre fra musen extensor senen Longus (EDL) og soleus musklene kan gi alle Diffraksjon informasjon tilgjengelig fra mer tradisjonell modell organismer som frosk og kanin psoas skjelettmuskulatur. En fordel med musen skjelettlidelser muskel forberedelser er den enkle disseksjon og utføre grunnleggende membran-intakt, hele muskel fysiologiske eksperimenter. Dimensjonene av dissekert muskelen har tilstrekkelig masse til å gi svært detaljerte muskel mønstre i svært korte X-ray eksponeringstider (~ millisekunder per ramme) på tredje generasjons røntgen beamlines.
Muscle X-ray Diffraksjon mønstre består av ekvator refleksjoner, den Meridional refleksjoner samt laget linje refleksjoner. Den ekvator intensitet ratio (forholdet mellom intensiteten av 1, 1 og 1, 0 ekvator refleksjoner, jeg11/i10), er nært korrelert til antall festet Cross-broer, som er proporsjonal med kraften som genereres i musen skjelettlidelser muskel 2. Meridional refleksjoner som rapporterer periodicities innenfor de tykke og tynne filamenter kan brukes til å anslå filament utvidbarhet1,3,6,7. Diffraksjon funksjoner ikke på Meridian og ekvator kalles lag linjer, som oppstår fra de ca skruelinjeformet bestilte myosin hoder på overflaten av tykt filament ryggrad samt ca skruelinjeformet bestilte tynne filamenter. Intensiteten av myosin lag linjer er nært beslektet med graden av bestilling av myosin hoder under ulike forhold2,8. All denne informasjonen kan brukes studere oppførselen til sarcomeric proteiner in situ i helse og sykdom.
Synchrotron X-ray Diffraksjon av muskelen har vært historisk gjort av team av høyt spesialiserte eksperter, men fremskritt innen teknologi og tilgjengeligheten av nye data reduksjon verktøy tyder på at dette ikke alltid er tilfelle. Det BioCAT Beamline 18ID for det avansert Foton kilde, Argonne nasjonal laboratorium har plikttro stab og oppbacking fasiliteter for utføre muskelen X-rokke Diffraksjon eksperimenter det kanne hjelpe nykommere å feltet komme i gang inne benytter disse teknikker. Mange brukere velger å formelt samarbeide med BioCAT stab, men et økende antall brukere finner de kan gjøre eksperimenter og analyse selv redusere byrden på beamline staff. Hovedmålet med denne utredningen er å gi opplæring som gir potensielle forskere med den informasjonen de trenger for å planlegge og utføre eksperimenter på musen skjelettlidelser muskel system enten på BioCAT beamline eller ved andre høy Flux beamlines rundt verden hvor disse eksperimentene ville være mulig.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:793px;" width="793">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:240px;">#5 forceps</td>
			<td style="width:131px;">WPI</td>
			<td style="width:87px;">500342</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:240px;">4/0 surgical suture</td>
			<td style="width:131px;">Braintree Sci</td>
			<td>SUT-S 108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">aquarium air stone</td>
			<td>uxcell</td>
			<td></td>
			<td>a regular air stone from a pet store would be fine</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CCD detector</td>
			<td>Rayonix Inc</td>
			<td>MAR 165 CCD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">data accquisition system</td>
			<td>Aurora Scientific Inc</td>
			<td>610A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:240px;">elastomer compound</td>
			<td style="width:131px;">Dow Corning</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:240px;">High resolution photon counting detector</td>
			<td>Dectris Inc</td>
			<td>EIGER X 500K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">high-power bi-phasic current stimulator</td>
			<td>Aurora Scientific Inc</td>
			<td>701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Iris Scissors</td>
			<td style="width:131px;">WPI</td>
			<td>501263-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MgSO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:240px;">micro scissor</td>
			<td style="width:131px;">WPI</td>
			<td>503365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">motor/force transducer</td>
			<td>Aurora Scientific Inc</td>
			<td>300C-LR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:240px;">petri-dish</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">photon counting detector</td>
			<td>Dectris Inc</td>
			<td>Pilatus 3 1M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stainless Steel wire</td>
			<td style="width:131px;">McMaster-carr</td>
			<td>8908K21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Suture Tying Forceps</td>
			<td style="width:131px;">WPI</td>
			<td>504498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Video sarcomere length measuring system</td>
			<td>Aurora Scientific Inc</td>
			<td>900B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

x-ray diffraction of intact murine skeletal muscle as a tool for studying the structural basis of muscle disease

Transgene Mouse-modeller har vært viktige verktøy for å studere forholdet mellom genotype og fenotype for menneskelige sykdommer, inkludert de av skjelettmuskulatur. Mus skjelettmuskulatur har vist å produsere høy kvalitet X-ray Diffraksjon mønstre på tredje generasjons Synchrotron beamlines gir en mulighet til å knytte endringer på nivået av genotype til funksjonell fenotyper i helse og sykdom ved å bestemme strukturelle konsekvenser av genetiske forandringer. Vi presenterer detaljerte protokoller for utarbeidelse av eksemplarer, samle X-ray mønstre og utvinne relevante strukturelle parametre fra røntgen mønstre som kan hjelpe guide forskere som ønsker å utføre slike eksperimenter for seg selv.

Isometrisk tetanic sammentrekning. Enhver form for klassisk muskel mekanisk eksperiment, slik som isometrisk eller isoton sammentrekninger, kan utføres med samtidig oppkjøp av røntgen mønstre. Figur 1 A viser det eksperimentelle oppsettet for mekaniske og røntgen eksperimenter. Et eksempel Force Trace for en isometrisk tetanic sammentrekning er vist i figur 1B. Muskelen ble holdt på hvile for 0,5 s før aktivert for 1 s. Den mekaniske innspillingen stopper 1 s etter stimulans. X-ray mønstrene ble samlet kontinuerlig gjennom protokollen ved 1 MS eksponeringstid på 500 Hz.
X-ray Diffraksjon mønstre. Muskelen X-ray Diffraksjon mønster kan gi nanometer oppløsning strukturell informasjon fra strukturer inne i sarkomerlengde. Muscle X-ray Diffraksjon mønstre består av fire tilsvarende kvadranter delt på ekvator og Meridian. Ekvator mønsteret oppstår fra myofilamentdiameter pakking innenfor sarkomerlengde vinkelrett på fiber aksen, mens Meridional mønstrene rapporten strukturelle informasjon fra myofilaments langs muskelen aksen. De resterende refleksjoner ikke på ekvator eller Meridian kalles lag linjer. Lag linjer (f.eks. funksjoner merket MLL4 og ALL6 i figur 2A) stå opp fra den ca.-spiral arrangement av molekylær under enheter innenfor myosin inneholder tykke filamenter og utgangen inneholder tynne filamenter. De myosin lag linjene er sterke og skarpe i mønstre av hvile muskler (figur 2A), mens utgangen lag linjer er mer fremtredende i mønstre fra kontraktørselskaper muskel (figur 2B). Forskjellen mønstre oppnås ved å trekke hvile mønsteret fra kontrakts mønsteret (figur 2C) kan belyse strukturelle endringer under styrke utviklingen i sunn og syk muskel. Ved å følge disse strukturelle endringene på tidsskala for millisekunder for de molekylære hendelsene under muskel sammentrekning, kan X-ray-Diffraksjon mønstre avdekke betydelig strukturell informasjon (figur 2D).
Data analyse ved hjelp av MuscleX. Her er et eksempel på Ekvatorial Refleksjoner analyse ved hjelp av "ekvator" rutine i MuscleX pakken (Figur 3). MuscleX er en åpen kildekodeanalyse programvarepakke utviklet på BioCAT13. Den ekvator intensitet ratio (jeg1, 1/i1, 0) er en indikator på nærhet av myosin til utgangen i hvile muskelen (Figur 3A), mens det er nært korrelert til antall festet Cross-broer i kontraktørselskaper ( Figur 3B) murine Skjelettmuskel2. Intensiteten ratio, jeg1, 1/i1, 0, er ca 0,47 i hvile muskler og ca 1,2 i kontraktørselskaper muskel. Avstanden mellom de to 1, 0 refleksjon (2 * S1, 0) er omvendt knyttet til Inter-filament avstand. Detaljerte dokumentasjon og håndbøker for MuscleX er tilgjengelig på nettet13.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59559/59559fig1.jpg"> Figur 1 : Mekanisk og røntgen eksperiment oppsett og protokoll. (A) muskelen er montert på den ene enden til en krok inne i eksperimentell kammer og den andre enden til en dual-modus motor/kraft svinger. Den holdes mellom to Kapton film Vinduer for å la røntgenstråler passere gjennom. Kammeret er fylt med ringer ' s løsning perfusert med 100% oksygen gjennom hele eksperimentet. (B) den mekaniske protokollen for X-ray eksperimenter på en muskel under tetanic sammentrekning. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59559/59559fig1large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59559/59559fig2.jpg"> Figur 2 : EDL X-ray Diffraksjon mønstre. EDL muskel X-ray Diffraksjon mønster fra hvile (A) og kontraktørselskaper (B) muskel. (C) forskjellen mønster mellom hvile og kontraktørselskaper mønster. Den blå regionen indikerer høy intensitet i hvile mønster, mens den gule regionen representerer høy intensitet i kontraktørselskaper mønster. (D) X-ray Diffraksjon mønster fra en 1 MS eksponering med EDL muskel. MLL1 = første bestilling myosin lag linje; MLL4 = fjerde ordre myosin lag linje; ALL1 = første bestilling utgangen lag linje ALL6 = sjette ordre utgangen lag linje; ALL7 = syvende ordre utgangen lag linje; TM = Tropomyosin refleksjon (indikert med en hvit boks); M3 = tredje bestilling Meridional refleksjon; M6 = sjette ordens Meridional refleksjon. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59559/59559fig2large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59559/59559fig3.jpg"> Figur 3 : Data analyse av ekvator mønstre ved hjelp MuscleX. Bakgrunnen trekkes ekvator intensitet ratio profil (mens området) og første fem ordre (grønne linjer) var skikket til å beregne intensiteten av hver topp. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59559/59559fig3large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about X-ray Diffraction of Intact Murine Skeletal Muscle as a Tool for Studying the Structural Basis of Muscle Disease at JoVE.com

X-ray Diffraction of Intact Murine Skeletal Muscle as a Tool for Studying the Structural Basis of Muscle Disease

X-ray Diffraksjon av intakt murine skjelettmuskulatur som et verktøy for å studere den strukturelle grunnlaget for muskel sykdom

Vi presenterer detaljerte protokoller for å utføre små-vinkel X-ray Diffraksjon eksperimenter med intakt mus skjelettmuskulatur. Med den brede tilgjengeligheten av transgene Mouse-modeller for menneskelige sykdommer, kan denne eksperimentelle plattformen danne en nyttig test seng for å Elucidating det strukturelle grunnlaget for genetiske muskel sykdommer

Transgenic mouse models have been important tools for studying the relationship of genotype to phenotype for human diseases including those of skeletal ...

Fysiologisk intakt mus skjelettmuskulatur kan produsere høy kvalitet x-ray diffraksjon mønstre som inneholder mye strukturell informasjon som kan gi innsikt i fysiologiske prosesser. Røntgendiffraksjon er den eneste teknikken som gjør det mulig å anskaffe høyoppløsnings strukturell informasjon fra levende muskelvev under virkelige fysiologiske forhold i ekte fysiologisk tid. Mange muskelsykdommer er arvet.Med økt tilgjengelighet for å genetisk endre de fleste modeller av myopatier, kan røntgendiffraksjonen gi strukturell innsikt i sykdomsmekanismer og indikere terapeutiske strategier. De fleste extensor digitorum longus og soleus muskler er spesielt praktisk for dette formålet. Men mange andre muskler hos små dyr kan dissekeres intakt og håndteres på en lignende måte.Før du begynner prosedyren, slå på den kombinerte motorkrafttransduseren, motorkrafttransduserkontrolleren med en høyeffekts bifasisk strømstimulator og et datakontrolldatainnsamlingskontrollsystem. Spray deretter huden på musens bakben med kald Ringers løsning og bruk fin disseksjonsaks for å kutte huden rundt låret. Ved hjelp av nummer fem tang, trekk raskt huden ned for å eksponere musklene og amputere bakbenet.Legg lemmen i en elastomerbelagt disseksjonsfat som inneholder oksygenisert Ringers løsning og legg parabolen under et kikkert dissekeringsmikroskop. For å høste soleusmuskelen, pin bakbenet med gastrocnemius muskelen vendt oppover. Bruk fin saks for å kutte den distale senen til gastrocnemius / soleus muskelgruppen.Skjær bort fascia på hver side av gastrocnemius muskelen slik at musklene skal løftes forsiktig og sakte bort fra beinet. Deretter frigjør proksimal sene av soleus muskelen. Pin ned muskelgruppen som inneholder gastrocnemius muskelen og distal sene i parabolen.Løft soleus muskelen forsiktig via proksimal sene for å skille den fra gastrocnemius muskelen, slik at så mye av soleus distal sene intakt som mulig. For å høste extensor digitorum longus eller EDL muskel, pin baklemmen i parabolen med tibialis fremre muskel vendt oppover og kutte fascia langs tibialis fremre muskel. Bruk tang til å trekke fascia klar og kutte den distale senen av tibialis fremre muskel.Løft tibialis fremre muskel og kutte den ut nøye uten å trekke på EDL muskelen, og kutte åpne den laterale siden av kneet for å utsette de to sener. Klipp den proksimale senen, og la oss mye av senen som mulig fortsatt festet til muskelen og trekk forsiktig på senen for å løfte EDL-muskelen. Kutt deretter den distale senen når den er utsatt.For å montere den høstede muskelen, pin ned muskelen via sener og trim så mye av ekstra fett, fascia og sene som mulig. Sett en sene inn i en forhåndsbundet knute og bruk suturbindingst tang for å knytte suturen tett. Bind den andre knuten på rundt metallkroken og gjenta prosedyren på den andre enden av senen.Fest deretter den korte kroken til bunnen av det eksperimentelle kammeret, og den lange kroken til dual-mode kraft transdusermotoren. Boble løsningen i det eksperimentelle kammeret med 100% oksygen. For å optimalisere stimuleringsprotokollen og muskellengden justere mikromanipulatorer festet til transdusermotoren for å generere en baseline spenning mellom 15 til 20 millinewtons for å finne de beste stimulansparametrene for å strekke muskelen.Sett stimuleringsspenningen på 40 volt. Stimuleringsstrømmen vil bli systematisk økt til det ikke er noen ytterligere økning i rykninger kraft. For å finne den optimale lengden, øk muskellengden og aktiver muskelen med en enkelt rykning til den aktive kraften slutter å øke.Utfør en ett sekund tetanisk sammentrekning for å teste monteringen og strekke muskelen tilbake til optimal baseline kraft etter behov. Deretter registrerer du muskellengden i millimeter med en digital kaliper. For å bestemme stråleposisjonen, bruk et stykke røntgensensitivt papir som gir et mørkt sted som svar på røntgenstråler og en video trådkorsgenerator for å lage et trådkors på linje med brennmerket på papiret.Bruk det BioCAT-leverte grafiske brukergrensesnittet til prøveposisjoneren, sentrer muskelen på stråleposisjonen og flytt prøvestadiet for å svinge prøvekammeret på 10 til 20 millimeter per sekund for å spre røntgendose over hele muskelen under eksponeringen. Vær oppmerksom på prøven når den beveger seg for å unngå store områder av fascia som inneholder kollagen og for å sikre at den forblir opplyst under hele veien til reisen. Arm detektoren og vent på avtrekkeren fra datainnsamlingssystemet.Deretter utløse mekaniske og røntgendata samtidig for å synkronisere dem. Røntgenmønstrene vil bli samlet kontinuerlig gjennom hele protokollen med en eksponeringstid på 10 millisekund og en eksponeringsperiode på 50 millisekund. I denne representative isometriske tetanale sammentrekningen ble EDL-muskelen holdt i ro i 0,5 sekunder før den ble aktivert i ett sekund, etterfulgt av en 1,5-sekunders avslapning.Muskelrøntgendraksjonsmønsteret kan gi nanometeroppløsning strukturell informasjon fra strukturer inne i sarkomene. Myosin-baserte laglinjer som inneholder tykke filamenter er sterke og skarpe i mønstre fra hvilemuskler, mens aktinbaserte laglinjer som inneholder tynne filamenter er mer fremtredende i mønstre fra å trekke muskler. Forskjellen mønstre oppnådd ved å trekke hvilemønsteret fra kontraherende mønster kan kaste lys over strukturelle endringer under kraftutvikling i sunn og syk muskel.Ved å følge disse strukturelle endringene på millisekundtidsskalaen av molekylære hendelser under muskelsammentrekning og avslapning, kan røntgendiffraksjonsmønstrene avsløre betydelig strukturell informasjon. I denne representative ekvatoriale refleksjonsanalysen ved hjelp av ekvatorrutinen i open source MuscleX-pakken, indikerer ekvatorial intensitetsforholdet nærheten til myosin til actin i hvilemuskelen og er nært korrelert med antall vedlagte kryssbroer i kontrahering av murin skjelettmuskulatur. Avstanden mellom de to 1, 0 refleksjon er omvendt knyttet til interfilament avstand.En ren disseksjon er nøkkelen for en vellykket intakt muskel X-ray eksperiment, så prøv å unngå mekanisk skade under muskel forberedelse. Enhver standard fysiologisk protokoll med hele muskler kan implementeres i disse eksperimentene og kan brukes til å studere muskelaktivering, avslapning og cross-bridge atferd under rask mekanisk transience. Genetisk manipulering av mus blir stadig mer sofistikert.Nye transgene musemodeller vil tillate mer spesifikke og innsiktsfulle eksperimenter som skal utformes for å indikere nye terapeutiske retninger for menneskelige myopatier.

Education

Research

JoVE Core

JoVE Journal

Cell Biology

Developmental Biology

Unit 1

The Cytoskeleton I: Actin and Microfilaments

Analyzing Cells and Proteins

SCIENTISTS IN ACTION

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analyse av Sebrafisk Larver Skeletal Muscle Integrity med Evans blå Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Using Isolated Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High throughput Microplate Respiratory Measurements

Bruke Isolert Mitokondrier fra minimale mengder av Mouse Skeletal Muscle for høy gjennomstrømming Mikro respirasjonsmålinger

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of ...

Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection

Induksjon av akutt Skeletal Muscle Regenerering av Cardiotoxin Injection

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced ...

Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans

Utarbeidelse og kultur myogenisk forloperceller / Primær myoblasts fra Skeletal Muscle of Adult og Gamle mennesker

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting ...

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Vurdering av skaden-indusert Senescence og i Vivo omprogrammering i skjelettmuskelen

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and ...

Application of Chronic Stimulation to Study Contractile Activity-induced Rat Skeletal Muscle Phenotypic Adaptations

Anvendelse av kronisk stimulering å studere kontraktile aktivitet-indusert rotte Skjelettmuskel fenotypiske tilpasninger

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Identifikasjon av Skjelettmuskel satellitt celler av Immunofluorescence med Pax7 og Laminin antistoffer

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

I Vivo Avbildning av muskel-sene Morphogenesis i Drosophila Pupae

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Isolation, Culture, Characterization, and Differentiation of Human Muscle Progenitor Cells from the Skeletal Muscle Biopsy Procedure

Isolasjon, kultur, karakterisering, og differensiering av Human Muscle stamceller fra skjelettmuskelen biopsi prosedyre

The use of primary human tissue and cells is ideal for the investigation of biological and physiological processes such as the skeletal muscle ...

Performing Human Skeletal Muscle Xenografts in Immunodeficient Mice

Utføre menneskelige Skjelettmuskel Xenotransplantater i Immunodeficient mus

Treatment effects observed in animal studies often fail to be recapitulated in clinical trials. While this problem is multifaceted, one reason for this ...