X-ray Diffraksjon av intakt murine skjelettmuskulatur som et verktøy for å studere den strukturelle grunnlaget for muskel sykdom

Fysiologisk intakt mus skjelettmuskulatur kan produsere høy kvalitet x-ray diffraksjon mønstre som inneholder mye strukturell informasjon som kan gi innsikt i fysiologiske prosesser. Røntgendiffraksjon er den eneste teknikken som gjør det mulig å anskaffe høyoppløsnings strukturell informasjon fra levende muskelvev under virkelige fysiologiske forhold i ekte fysiologisk tid. Mange muskelsykdommer er arvet.

Med økt tilgjengelighet for å genetisk endre de fleste modeller av myopatier, kan røntgendiffraksjonen gi strukturell innsikt i sykdomsmekanismer og indikere terapeutiske strategier. De fleste extensor digitorum longus og soleus muskler er spesielt praktisk for dette formålet. Men mange andre muskler hos små dyr kan dissekeres intakt og håndteres på en lignende måte.

Før du begynner prosedyren, slå på den kombinerte motorkrafttransduseren, motorkrafttransduserkontrolleren med en høyeffekts bifasisk strømstimulator og et datakontrolldatainnsamlingskontrollsystem. Spray deretter huden på musens bakben med kald Ringers løsning og bruk fin disseksjonsaks for å kutte huden rundt låret. Ved hjelp av nummer fem tang, trekk raskt huden ned for å eksponere musklene og amputere bakbenet.

Legg lemmen i en elastomerbelagt disseksjonsfat som inneholder oksygenisert Ringers løsning og legg parabolen under et kikkert dissekeringsmikroskop. For å høste soleusmuskelen, pin bakbenet med gastrocnemius muskelen vendt oppover. Bruk fin saks for å kutte den distale senen til gastrocnemius / soleus muskelgruppen.

Skjær bort fascia på hver side av gastrocnemius muskelen slik at musklene skal løftes forsiktig og sakte bort fra beinet. Deretter frigjør proksimal sene av soleus muskelen. Pin ned muskelgruppen som inneholder gastrocnemius muskelen og distal sene i parabolen.

Løft soleus muskelen forsiktig via proksimal sene for å skille den fra gastrocnemius muskelen, slik at så mye av soleus distal sene intakt som mulig. For å høste extensor digitorum longus eller EDL muskel, pin baklemmen i parabolen med tibialis fremre muskel vendt oppover og kutte fascia langs tibialis fremre muskel. Bruk tang til å trekke fascia klar og kutte den distale senen av tibialis fremre muskel.

Løft tibialis fremre muskel og kutte den ut nøye uten å trekke på EDL muskelen, og kutte åpne den laterale siden av kneet for å utsette de to sener. Klipp den proksimale senen, og la oss mye av senen som mulig fortsatt festet til muskelen og trekk forsiktig på senen for å løfte EDL-muskelen. Kutt deretter den distale senen når den er utsatt.

For å montere den høstede muskelen, pin ned muskelen via sener og trim så mye av ekstra fett, fascia og sene som mulig. Sett en sene inn i en forhåndsbundet knute og bruk suturbindingst tang for å knytte suturen tett. Bind den andre knuten på rundt metallkroken og gjenta prosedyren på den andre enden av senen.

Fest deretter den korte kroken til bunnen av det eksperimentelle kammeret, og den lange kroken til dual-mode kraft transdusermotoren. Boble løsningen i det eksperimentelle kammeret med 100% oksygen. For å optimalisere stimuleringsprotokollen og muskellengden justere mikromanipulatorer festet til transdusermotoren for å generere en baseline spenning mellom 15 til 20 millinewtons for å finne de beste stimulansparametrene for å strekke muskelen.

Sett stimuleringsspenningen på 40 volt. Stimuleringsstrømmen vil bli systematisk økt til det ikke er noen ytterligere økning i rykninger kraft. For å finne den optimale lengden, øk muskellengden og aktiver muskelen med en enkelt rykning til den aktive kraften slutter å øke.

Utfør en ett sekund tetanisk sammentrekning for å teste monteringen og strekke muskelen tilbake til optimal baseline kraft etter behov. Deretter registrerer du muskellengden i millimeter med en digital kaliper. For å bestemme stråleposisjonen, bruk et stykke røntgensensitivt papir som gir et mørkt sted som svar på røntgenstråler og en video trådkorsgenerator for å lage et trådkors på linje med brennmerket på papiret.

Bruk det BioCAT-leverte grafiske brukergrensesnittet til prøveposisjoneren, sentrer muskelen på stråleposisjonen og flytt prøvestadiet for å svinge prøvekammeret på 10 til 20 millimeter per sekund for å spre røntgendose over hele muskelen under eksponeringen. Vær oppmerksom på prøven når den beveger seg for å unngå store områder av fascia som inneholder kollagen og for å sikre at den forblir opplyst under hele veien til reisen. Arm detektoren og vent på avtrekkeren fra datainnsamlingssystemet.

Deretter utløse mekaniske og røntgendata samtidig for å synkronisere dem. Røntgenmønstrene vil bli samlet kontinuerlig gjennom hele protokollen med en eksponeringstid på 10 millisekund og en eksponeringsperiode på 50 millisekund. I denne representative isometriske tetanale sammentrekningen ble EDL-muskelen holdt i ro i 0,5 sekunder før den ble aktivert i ett sekund, etterfulgt av en 1,5-sekunders avslapning.

Muskelrøntgendraksjonsmønsteret kan gi nanometeroppløsning strukturell informasjon fra strukturer inne i sarkomene. Myosin-baserte laglinjer som inneholder tykke filamenter er sterke og skarpe i mønstre fra hvilemuskler, mens aktinbaserte laglinjer som inneholder tynne filamenter er mer fremtredende i mønstre fra å trekke muskler. Forskjellen mønstre oppnådd ved å trekke hvilemønsteret fra kontraherende mønster kan kaste lys over strukturelle endringer under kraftutvikling i sunn og syk muskel.

Ved å følge disse strukturelle endringene på millisekundtidsskalaen av molekylære hendelser under muskelsammentrekning og avslapning, kan røntgendiffraksjonsmønstrene avsløre betydelig strukturell informasjon. I denne representative ekvatoriale refleksjonsanalysen ved hjelp av ekvatorrutinen i open source MuscleX-pakken, indikerer ekvatorial intensitetsforholdet nærheten til myosin til actin i hvilemuskelen og er nært korrelert med antall vedlagte kryssbroer i kontrahering av murin skjelettmuskulatur. Avstanden mellom de to 1, 0 refleksjon er omvendt knyttet til interfilament avstand.

En ren disseksjon er nøkkelen for en vellykket intakt muskel X-ray eksperiment, så prøv å unngå mekanisk skade under muskel forberedelse. Enhver standard fysiologisk protokoll med hele muskler kan implementeres i disse eksperimentene og kan brukes til å studere muskelaktivering, avslapning og cross-bridge atferd under rask mekanisk transience. Genetisk manipulering av mus blir stadig mer sofistikert.

Nye transgene musemodeller vil tillate mer spesifikke og innsiktsfulle eksperimenter som skal utformes for å indikere nye terapeutiske retninger for menneskelige myopatier.