Name: x-ray diffraction of intact murine skeletal muscle as a tool for studying the structural basis of muscle disease
Uploaded: 2019-07-18T12:30:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about X-ray Diffraction of Intact Murine Skeletal Muscle as a Tool for Studying the Structural Basis of Muscle Disease at JoVE.com

В этом исследовании использовались ресурсы Advanced Photon Source, Управления министерства энергетики США (DOE) Для Научного Фонда Пользователей, управляемого Для Управления науки Министерства энергетики По аргоннской национальной лаборатории по контракту No. ДЕ-AC02-06CH11357. Этот проект был поддержан грантом P41 GM103622 от Национального института общих медицинских наук Национальных институтов здравоохранения. Использование детектора Pilatus 3 1M было предоставлено грантом 1S10OD018090-01 от NIGMS. Содержание является исключительно ответственностью авторов и не обязательно отражает официальные взгляды Национального института общих медицинских наук или Национальных институтов здравоохранения.

<ol>
	<li>Ma, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thick-Filament+Extensibility+in+Intact+Skeletal+Muscle.">Thick-Filament Extensibility in Intact Skeletal Muscle.</a> Biophysical Journal. 115 (8), 1580-1588 (2018).</li><li>Ma, W., Gong, H., Irving, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+Head+Configurations+in+Resting+and+Contracting+Murine+Skeletal+Muscle.">Myosin Head Configurations in Resting and Contracting Murine Skeletal Muscle.</a> International Journal of Molecular Sciences. 19 (9), (2018).</li><li>Kiss, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nebulin+stiffens+the+thin+filament+and+augments+cross-bridge+interaction+in+skeletal+muscle.">Nebulin stiffens the thin filament and augments cross-bridge interaction in skeletal muscle.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (41), 10369-10374 (2018).</li><li>Ochala, J., Gokhin, D. S., Iwamoto, H., Fowler, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pointed-end+capping+by+tropomodulin+modulates+actomyosin+crossbridge+formation+in+skeletal+muscle+fibers.">Pointed-end capping by tropomodulin modulates actomyosin crossbridge formation in skeletal muscle fibers.</a> Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 28 (1), 408-415 (2014).</li><li>Lindqvist, J., Iwamoto, H., Blanco, G., Ochala, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fraction+of+strongly+bound+cross-bridges+is+increased+in+mice+that+carry+the+myopathy-linked+myosin+heavy+chain+mutation+MYH4(L342Q).">The fraction of strongly bound cross-bridges is increased in mice that carry the myopathy-linked myosin heavy chain mutation MYH4(L342Q).</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 6 (3), 834-840 (2013).</li><li>Huxley, H. E., Stewart, A., Sosa, H., Irving, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+diffraction+measurements+of+the+extensibility+of+actin+and+myosin+filaments+in+contracting+muscle.">X-ray diffraction measurements of the extensibility of actin and myosin filaments in contracting muscle.</a> Biophysical Journal. 67 (6), 2411-2421 (1994).</li><li>Wakabayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+diffraction+evidence+for+the+extensibility+of+actin+and+myosin+filaments+during+muscle+contraction.">X-ray diffraction evidence for the extensibility of actin and myosin filaments during muscle contraction.</a> Biophysical Journal. 67 (6), 2422-2435 (1994).</li><li>Anderson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mavacamten+stabilizes+a+folded-back+sequestered+super-relaxed+state+of+&#946;-cardiac+myosin.">Mavacamten stabilizes a folded-back sequestered super-relaxed state of &#946;-cardiac myosin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2018).</li><li>National Research Council. Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guide+for+the+care+and+use+of+laboratory+animals.">Guide for the care and use of laboratory animals.</a> Institute for Laboratory Animal Research (U.S.) &amp; National Academies Press (U.S.). , (2011).</li><li>. How to Calibrate Your Dual-Mode Lever System Using DMC Available from: <a target="_blank" href="https://aurorascientific.com/how-to-calibrate-your-dual-mode-lever-system-using-dmc/">https://aurorascientific.com/how-to-calibrate-your-dual-mode-lever-system-using-dmc/</a> (2017)</li><li>Alexander, R. M. V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dimensions+of+knee+and+ankle+muscles+and+the+forces+they+exert.">The dimensions of knee and ankle muscles and the forces they exert.</a> Journal of Human Movement Studies. 1, 115-123 (1975).</li><li>Burkholder, T. J., Fingado, B., Baron, S., Lieber, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+Muscle-Fiber+Types+and+Sizes+and+Muscle+Architectural+Properties+in+the+Mouse+Hindlimb.">Relationship between Muscle-Fiber Types and Sizes and Muscle Architectural Properties in the Mouse Hindlimb.</a> Journal of Morphology. 221 (2), 177-190 (1994).</li><li>Jiratrakanvong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> MuscleX: software suite for diffraction X-ray imaging V1.13.1. , (2018).</li><li>Reconditi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+filament+activation+in+the+heart+is+tuned+to+the+mechanical+task.">Myosin filament activation in the heart is tuned to the mechanical task.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), 3240-3245 (2017).</li></ol>

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Последние публикации из нашей группы показали, что рентгеновские модели из мыши скелетной мышцы могут быть использованы, чтобы пролить свет на саркомерик структурной информации от мышц в области здравоохранения и болезни1,2,3 особенно с увеличение доступности генетически модифицированных моделей мыши для различных миопатий. Механические исследования высокого разрешения на отдельных волокнах или небольших пучках в сочетании с рентгеновской дифракцией лучше всего делать экспертами. Если, однако, более скромной механической информации будет достаточно для ваших целей, вся подготовка мышц позволяет сбор подробных рентгеновских моделей из простой подготовки.
Чистое вскрытие является ключом к успешному комбинированному механическому и рентгеновскому эксперименту. Очень важно не тянуть на целевой мышцы, а также другие мышцы, связанные с подошвами или EDL мышц во время вскрытия, поскольку это может разорвать части мышц и привести к снижению силы. Это также может привести к повреждению внутренней структуры, которая будет ухудшать рентгеновские узоры. Так как все будет рассеиваться в рентгеновском луче, важно, чтобы очистить от любого дополнительного жира, коллагена в фасции, а также любые волосы или свободные кусочки ткани при выполнении следующего протокола. Чтобы уменьшить дополнительное соответствие в подготовке мышц, также важно надежно привязать сухожилия к крючкам, как можно ближе к мышечному телу, не повреждая его.
Различные рентгеновские время экспозиции может обеспечить различные виды информации из той же мышцы. Используя полный луч на 18ID, анализируемый экваториальный шаблон может быть получен в 1 мс экспозиции (см. Рисунок 2D). Для анализа первого миозина слой линии отражения, 10 мс общее время экспозиции, как правило, требуется. Для сбора более высокого порядка меридиональных отражений, таких как M15 (2,8 нм миозина меридионального отражения) и 2,7 нм актина меридионального отражения, как правило, по крайней мере 1 с общей экспозиции не требуется, но более 2 с общей экспозиции рекомендуется для высокой точности Измерения.
Важен выбор оптимального рентгеновского детектора для эксперимента. Для наиболее подробных рентгеновских моделей индивидуальный детектор CCD, такой как детектор BioCAT с пикселями около 40 мкм и функциями распространения точек в фосфоре, может обеспечить шаблоны с высоким динамическим диапазоном и хорошим пространственным разрешением, но может принимать только один кадр за один раз. Для времени решенных экспериментов, фотон подсчета пиксель массива детектор на BioCAT может собирать рентгеновские узоры на 500 Гц. Размер пикселей 172 мкм с помощью этого детектора, однако, не обеспечивает достаточное пространственное разрешение для детального изучения внутренней части меридиана, но является адекватным для большинства других целей. BioCAT приобрела фотоновый детектор высокого разрешения, обеспечивающий реальное разрешение 75 мкм при максимальной частоте кадров 9000 Гц. Подобные детекторы этого типа, как ожидается, вытеснят текущие детекторы для исследования мышц в течение следующих нескольких лет.
При очень высоких потоках рентгеновских лучей на синхротронах третьего поколения, радиационное повреждение является серьезной проблемой. Это всегда хороший выбор, чтобы смятение пучка, чтобы доставить не больше пучка, чем это необходимо для наблюдения желаемых функций дифракции. Такое же общее рентгеновское облучение может быть достигнуто путем продления времени воздействия с ослабленного луча. Преимущество фотон подсчета детекторов массива пикселей заключается в том, что отдельные кадры могут быть суммированы вместе без штрафа за шум. Даже в этом году возможны радиационные повреждения. Признаки радиационного повреждения включают падение максимальной силы сжатия, размазывание отражений линии слоя, даже изменение цвета мышц.
Одним из ограничений нетронутой подготовки мыши скелетных мышц является трудность в получении саркомера длина от нетронутой мышцы во время экспериментов. Мышцы слишком толстые для видеомикроскопии и лазерной дифракции. В то время как с будущими разработками можно оценить длину саркомера непосредственно от дифракционных моделей14, в ближайшем будущем единственным вариантом является измерение его после эксперимента, как описано здесь.

Синхротрон малоугольная рентгеновская дифракция является методом выбора для изучения nm-масштабной структуры активно говорении мышечных препаратов в физиологических условиях. Важно отметить, что структурная информация от живых или кожурой мышечной подготовки могут быть получены синхронно с физиологическими данными, такими как мышечная сила и изменения длины. Там был растущий интерес к применению этого метода для изучения структурной основы наследственных заболеваний мышц, которые имеют свою основу в точке мутации в саркомерикных белков. Сообщество мышечной биофизики было очень активным в генерации трансгенных моделей мыши для этих человеческих заболеваний условиях, которые могли бы обеспечить идеальные испытательные кровати для структурных исследований. Последние публикации из нашей группы1,2,3и другие4,5 указали, что рентгеновские узоры от мыши разгибателя digitorum longus (EDL) и подошвы мышцы могут обеспечить все дифракционная информация, доступная из более традиционных модельных организмов, таких как лягушка и кролик psoas скелетной мышцы. Преимуществом подготовки мышечной массы мыши является легкость вскрытия и выполнения основных мембранно-нетронутых, целые мышечные физиологические эксперименты. Размеры расчлененной мышцы имеют достаточную массу, чтобы дать высоко детализированные мышечные модели в очень короткие рентгеновские сроки экспозиции (миллисекунда в кадре) на рентгеновских лучах третьего поколения.
Модели дифракции мышечной рентгеновской дифракции состоят из экваториальных отражений, меридиональных отражений, а также отражений линии слоя. Соотношение экваториальной интенсивности (отношение интенсивности 1,1 и 1,0 экваториальных отражений, I11/I10),тесно коррелирует с числом прикрепленных кросс-мостов, что пропорционально силе, генерируемой в мышечной скелетной мышце 2. Меридиональные отражения, которые сообщают периодии в толстой и тонкой нити могут быть использованы для оценки расширяемость нити1,3,6,7. Особенности дифракции не на меридиане и экваторе называются слоеобразными линиями, которые возникают из примерно хелически упорядоченных головмиозина на поверхности толстой нити позвоночника, а также приблизительно хлоэнчевидно упорядоченных тонких нитей. Интенсивность линий слоя миосина тесно связана со степенью заказа миозина в различных условиях2,8. Вся эта информация может быть использована исследование поведения саркомерикных белков на месте в области здоровья и болезней.
Синхротронная рентгеновская дифракция мышц исторически была сделана командами узкоспециализированных экспертов, но достижения в области технологий и наличие новых инструментов сокращения данных указывают на то, что это не всегда так. BioCAT Beamline 18ID на Расширенный источник фотона, Аргоннской национальной лаборатории выделен персонал и вспомогательные средства для выполнения мышечной рентгеновской дифракции экспериментов, которые могут помочь новичкам на местах начать использовать эти методы. Многие пользователи предпочитают официально сотрудничать с сотрудниками BioCAT, но все большее число пользователей считают, что они могут делать эксперименты и анализ себя снижение нагрузки на лучевой персонал. Основная цель данной работы заключается в обеспечении обучения, которое обеспечивает потенциальных экспериментаторов с информацией, необходимой для планирования и выполнения экспериментов на мышечной системы мыши либо на bioCAT луч или на других высоких лучей потока вокруг мире, где эти эксперименты были бы возможны.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:793px;" width="793">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:240px;">#5 forceps</td>
			<td style="width:131px;">WPI</td>
			<td style="width:87px;">500342</td>
			<td style="width:336px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:240px;">4/0 surgical suture</td>
			<td style="width:131px;">Braintree Sci</td>
			<td>SUT-S 108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">aquarium air stone</td>
			<td>uxcell</td>
			<td></td>
			<td>a regular air stone from a pet store would be fine</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CCD detector</td>
			<td>Rayonix Inc</td>
			<td>MAR 165 CCD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">data accquisition system</td>
			<td>Aurora Scientific Inc</td>
			<td>610A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:240px;">elastomer compound</td>
			<td style="width:131px;">Dow Corning</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:240px;">High resolution photon counting detector</td>
			<td>Dectris Inc</td>
			<td>EIGER X 500K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">high-power bi-phasic current stimulator</td>
			<td>Aurora Scientific Inc</td>
			<td>701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Iris Scissors</td>
			<td style="width:131px;">WPI</td>
			<td>501263-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MgSO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:240px;">micro scissor</td>
			<td style="width:131px;">WPI</td>
			<td>503365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">motor/force transducer</td>
			<td>Aurora Scientific Inc</td>
			<td>300C-LR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:240px;">petri-dish</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">photon counting detector</td>
			<td>Dectris Inc</td>
			<td>Pilatus 3 1M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stainless Steel wire</td>
			<td style="width:131px;">McMaster-carr</td>
			<td>8908K21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Suture Tying Forceps</td>
			<td style="width:131px;">WPI</td>
			<td>504498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Video sarcomere length measuring system</td>
			<td>Aurora Scientific Inc</td>
			<td>900B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

x-ray diffraction of intact murine skeletal muscle as a tool for studying the structural basis of muscle disease

Трансгенные модели мыши были важными инструментами для изучения взаимосвязи генотипа с фенотипом для заболеваний человека, включая скелетные мышцы. Мышь скелетной мышцы было показано, производить высокое качество рентгеновского дифракции моделей на третьем поколении синхротронных лучей, обеспечивая возможность связать изменения на уровне генотипа с функциональными фенотипами в здоровье и болезни, определив структурные последствия генетических изменений. Мы представляем подробные протоколы для подготовки образцов, сбора рентгеновских узоров и извлечения соответствующих структурных параметров из рентгеновских моделей, которые могут помочь экспериментаторам, желающим провести такие эксперименты для себя.

Изометрическое столбняка. Любой классический мышечный механический эксперимент, такой как изометрические или изотонические сокращения, может быть выполнен с одновременным приобретением рентгеновских моделей. Рисунок 1 A показывает экспериментальную установку для механических и рентгеновских экспериментов. Пример следа силы для изометрического столбняка сжимающе показан в рисунке 1B. Мышца держалась на покоя в течение 0,5 с, прежде чем активировать сяртрию в течение 1 с. Механическая запись останавливается 1 с после стимула. Рентгеновские модели были собраны непрерывно по всему протоколу при 1 мс времени воздействия на 500 Гц.
Рентгеновские дифракционные модели. Мышечный рентгеновский дифракционный узор может дать нанометровое разрешение структурной информации от структур внутри саркомера. Модели дифракции мышечной рентгеновской дифракции состоят из четырех эквивалентных квадрантов, разделенных экватором и меридианом. Экваториальный узор возникает из упаковки миофилатата в саркомере перпендикулярно оси волокна, в то время как меридиональные модели сообщают структурную информацию из миофиламентов вдоль мышечной оси. Остальные отражения не на экваторе или меридиане называются слоеными линиями. Линии слоя (например, функции, помеченные MLL4 и ALL6 на рисунке 2A) возникают из примерно свекольного расположения молекулярных субъединиц внутри миозина, содержащего толстые нити и актин, содержащий тонкие нити. Линии слоя на основе миозина сильны и остры в узорах от отдыха мышцы(рисунок 2A), в то время как актин основе слоя линии являются более заметными в шаблонах от сокращения мышц (Рисунок 2B). Различия моделей, полученных путем вычитания отдыха картины из шаблона сокращения(Рисунок 2C) может пролить свет на структурные изменения во время развития силы в здоровой и больной мышцы. Следуя этим структурным изменениям в миллисекундной временной шкале молекулярных событий во время сокращения мышц, модели рентгеновской дифракции могут выявить существенную структурную информацию(рисунок 2D).
Анализ данных с использованием MuscleX. Вот пример экваториального анализа отражений с использованием "экватора" рутины в пакете MuscleX (Рисунок 3). MuscleX — это пакет программного обеспечения для анализа с открытым исходным кодом, разработанный в BioCAT13. Соотношение экваториальной интенсивности (I1,1/ I1,0) является показателем близости миозина к актину в мышце отдыха (рисунок3А), в то время как это тесно коррелирует с числом прикрепленных кросс-мостов в договоре ( Рисунок 3B) мурин скелетной мышцы2. Коэффициент интенсивности, я1,1/ I1,0, составляет около 0,47 в мышцах отдыха и около 1,2 в контракте мышцы. Расстояние между двумя отражениями 1,0 (2'S1,0)обратно связано с межнити интервал. Подробная документация и руководства для MuscleX доступны онлайн13.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59559/59559fig1.jpg"> Рисунок 1 : Установка и протокол механического и рентгеновского эксперимента. (A) Мышца установлена на одном конце крючка внутри экспериментальной камеры, а другой конец двойного режима двигателя / силы преобразователя. Он проводится между двумя окнами пленки Kapton, чтобы рентгеновские лучи, чтобы пройти. Камера наполнена раствором Ringer, наполненным 100% кислородом на протяжении всего эксперимента. (B) Механический протокол для рентгеновских экспериментов на мышцах во время столбняка сокращения. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59559/59559fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59559/59559fig2.jpg"> Рисунок 2 : модели дифракции рентгеновского рентгеновского снимка EDL. EDL мышцы рентгеновского дифракции картины от отдыха (A) и сокращения (B) мышцы. (C) Разница шаблон между отдыха и договоров шаблона. Синий регион указывает на высокую интенсивность в шаблоне отдыха, в то время как желтая область представляет высокую интенсивность в шаблоне сжимания. (D) Рентгеновский дифракционный шаблон от 1 мс воздействия с мышцей EDL. MLL1 - линия слоя миозина первого порядка; MLL4 - Линия четвертого порядка миозина; ALL1 - Линия первого уровня actin ACTin ALL6 - линия шестого порядка actin слоя; ALL7 - линия седьмого порядка actin слоя; ТМ и отражение тропомиозина (указанное белым ящиком); M3 - меридиональное отражение третьего порядка; M6 - шестой порядок меридионального отражения. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59559/59559fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59559/59559fig3.jpg"> Рисунок 3 : Анализ данных экваториальных моделей с использованием MuscleX. Фон вычитается экваториальной интенсивности коэффициента профиля (в то время как область) и первые пять ордеров (зеленые линии) были пригодны для расчета интенсивности каждого пика. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59559/59559fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about X-ray Diffraction of Intact Murine Skeletal Muscle as a Tool for Studying the Structural Basis of Muscle Disease at JoVE.com

X-ray Diffraction of Intact Murine Skeletal Muscle as a Tool for Studying the Structural Basis of Muscle Disease

Рентгеновская дифракция институющих Морин скелетной мышцы в качестве инструмента для изучения структурной основы мышечной болезни

Мы представляем подробные протоколы для выполнения малоугольных рентгеновских экспериментов дифракции с использованием нетронутых мышечных скелетных мышц. С широкой доступностью трансгенных моделей мыши для болезней человека, эта экспериментальная платформа может сформировать полезный испытательный койк для выяснения структурной основы генетических заболеваний мышц

Transgenic mouse models have been important tools for studying the relationship of genotype to phenotype for human diseases including those of skeletal ...

Физиологически нетронутыми мыши скелетной мышцы может производить высокое качество рентгеновской дифракции моделей, содержащих много структурной информации, которая может обеспечить понимание физиологических процессов. Рентгеновская дифракция является единственным методом, который позволяет получать структурную информацию высокого разрешения из живой мышечной ткани в реальных физиологических условиях в режиме реального физиологического времени. Многие мышечные заболевания наследуются.С увеличением доступности для генетически модифицировать большинство моделей миопатии, рентгеновская дифракция может обеспечить структурное понимание механизмов заболевания и указать терапевтические стратегии. Большинство extensor digitorum longus и soleus мышц особенно удобны для этой цели. Но многие другие мышцы у мелких животных могут быть вскрыты нетронутыми и обрабатываются аналогичным образом.Перед началом процедуры включите комбинированный двигательный предуктор, контроллер превратно-двигательной силы с стимулятором бифазного тока высокой мощности и системой управления данными управления компьютером. Затем распылите кожу на заднюю конечность мыши с помощью холодного раствора Ringer и используйте тонкие ножницы для рассечения кожи вокруг бедра. Используя пять типсов, быстро потяните кожу вниз, чтобы разоблачить мышцы и ампутировать заднюю конечность.Поместите конечность в еластомер покрытием рассечения блюдо, содержащее кислородом раствор Ringer и поместите блюдо под бинокль рассечения микроскопа. Чтобы собрать мышцу подошвы, прикрепите заднюю конечность с мышцей гастрочнемиуса лицом вверх. Используйте тонкие ножницы, чтобы сократить дистальное сухожилие группы мышц gastrocnemius/soleus.Отрежьте фасции по обе стороны от мышцы гастрокнейма, чтобы мышцы были подняты мягко и медленно от кости. Затем освободите проксимальное сухожилие подошвы мышцы. Прикрепите группу мышц, содержащую мышцы гастрокнейма и дистальное сухожилие в блюде.Поднимите мышцу подошвы осторожно через проксимальное сухожилие, чтобы отделить его от мышцы гастрокнеймия, оставляя как можно больше подошвы дистального сухожилия нетронутыми, как это возможно. Для сбора extensor digitorum longus или EDL мышцы, контактный заднюю конечность в блюдо с голени передней мышцы лицом вверх и сократить фасции вдоль передней мышцы голени. Используйте типсы, чтобы вытащить фасции ясно и сократить дистальное сухожилие голени передней мышцы.Поднимите переднюю мышцу голени и вырезать его тщательно, не потянув на мышцу ЭДЛ, и разрезать боковую сторону колена, чтобы разоблачить два сухожилия. Вырезать проксимальное сухожилие, оставив нам большую часть сухожилия, как это возможно еще прилагается к мышце и осторожно тянуть на сухожилие, чтобы поднять мышцы ЭДЛ. Затем вырезать дистальное сухожилие, как только он подвергается.Чтобы смонтировать собранные мышцы, приколоть мышцы через сухожилия и обрезать как можно больше лишнего жира, фасции и сухожилий, как это возможно. Вставьте одно сухожилие в предварительно завязанный узел и используйте шов, связывающий типсы, чтобы плотно завязать шов. Свяжите второй узел вокруг металлического крючка и повторите процедуру на другом конце сухожилия.Затем прикрепите короткий крюк к нижней части экспериментальной камеры, а длинный крюк к двухмоторной силе предуцатора двигателя. Пузырь раствора в экспериментальной камере со 100%-ным кислородом. Для оптимизации протокола стимуляции и длины мышц настроить микро-манипуляторов, прикрепленных к двигательу преобразователя для создания базового напряжения между 15 до 20 millinewtons, чтобы найти лучшие параметры стимула для растяжения мышц.Установите напряжение стимуляции до 40 вольт. Ток стимуляции будет систематически увеличиваться до тех пор, пока не будет дополнительного увеличения силы подергивания. Чтобы найти оптимальную длину, увеличить длину мышц и активировать мышцы с одного дергаться, пока активная сила перестает увеличиваться.Выполните одну секунду тетаничное сокращение, чтобы проверить монтаж и растянуть мышцы обратно к оптимальной базовой силы по мере необходимости. Затем записывают длину мышц в миллиметрах с помощью цифрового калипера. Чтобы определить положение луча, используйте кусок рентгеновской чувствительной бумаги, которая производит темное пятно в ответ на рентгеновские лучи и видео перекрестие генератора для создания перекрестия выровнены с ожогом знак на бумаге.Используя графический пользовательский интерфейс BioCAT к позиционеру образца, центр мышцы на позиции луча и переместить этап образца, чтобы колебаться образец камеры на 10 до 20 миллиметров в секунду, чтобы распространить дозу рентгеновского излучения по всей мышце во время воздействия. Наблюдайте образец по мере того как он двигает для того чтобы во избежание большие зоны фасции которые содержат коллаген и обеспечить что он остается освещенным во время всего следа своего перемещения. Вооружим детектор и ждите триггера от системы сбора данных.Затем запустите механические и рентгеновские данные одновременно для их синхронизации. Рентгеновские модели будут собираться непрерывно на протяжении всего протокола с 10-миллисекундной экспозицией и 50-миллисекундный период экспозиции. В этом репрезентативном изометрическом тетаном сокращении мышца ЭДЛ удерживалась в состоянии покоя в течение 0,5 секунд, прежде чем она была активирована в течение одной секунды, а затем 1,5-секундная релаксация.Структура рентгеновской дифракции мышц может дать нанометровому разрешению структурную информацию из структур внутри саркомера. Миозин основе слоя линий, содержащих толстые нити являются сильными и острыми в узорах от отдыха мышц, в то время как актин основе слоя линий, содержащих тонкие нити являются более заметными в шаблонах от сокращение мышц. Различия, полученные путем вычитания отдыха картины из модели заражения может пролить свет на структурные изменения во время развития силы в здоровой и больной мышцы.Следуя этим структурным изменениям на миллисекундной шкале молекулярных событий во время сокращения мышц и релаксации, рентгеновские дифракционные модели могут выявить существенную структурную информацию. В этом репрезентативном экваториальном анализе отражений с использованием экватора рутины в пакете MuscleX с открытым исходным кодом, экваториальное соотношение интенсивности указывает на близость миозина к действию в мышцах покоя и тесно коррелирует с количеством прикрепленных поперечных мостов в контрактной мышце murine skeletal. Расстояние между двумя отражениями 1,0 обратно связано с расстоянием между ними.Чистое вскрытие является ключом для успешного неповрежденного эксперимента по рентгеновскому снимку мышц, поэтому старайтесь избегать механических повреждений во время подготовки мышц. Любой стандартный физиологический протокол с целыми мышцами может быть реализован в этих экспериментах и может быть использован для изучения мышечной активации, релаксации и кросс-бридж поведение во время быстрой механической быстротекости. Генетические манипуляции с мышами становятся все более изощренными.Новые трансгенные модели мыши позволят более конкретные и глубокие эксперименты, которые будут разработаны, чтобы указать новые терапевтические направления для человека миопатии.

Education

Research

JoVE Core

JoVE Journal

Cell Biology

Developmental Biology

Unit 1

The Cytoskeleton I: Actin and Microfilaments

Analyzing Cells and Proteins

SCIENTISTS IN ACTION

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Анализ данио рерио Личинки скелетных мышц целостности с синий краситель Эванса

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Using Isolated Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High throughput Microplate Respiratory Measurements

Использование изолированными митохондриями из минимальных количествах мыши скелетных мышц для Высокая пропускная MICROPLATE респираторных измерений

Skeletal muscle mitochondria play a specific role in many disease pathologies. As such, the measurement of oxygen consumption as an indicator of ...

Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection

Индукция Острый скелетных мышц регенерации путем инъекций Cardiotoxin

Skeletal muscle regeneration is a physiological process that occurs in adult skeletal muscles in response to injury or disease. Acute injury-induced ...

Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans

Подготовка и культура Миогенный прогениторных клеток / Первичные миобластов из скелетной мышце взрослых и выдержана Людей

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting ...

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Evaluation of Injury-induced Senescence and In Vivo Reprogramming in the Skeletal Muscle

Оценка травмы индуцированного старения и в естественных условиях перепрограммирования в скелетных мышцах

Cellular senescence is a stress response that is characterized by a stable cellular growth arrest, which is important for many physiological and ...

Application of Chronic Stimulation to Study Contractile Activity-induced Rat Skeletal Muscle Phenotypic Adaptations

Применение хронической стимуляции для изучения сократительной активности индуцированной крыса скелетных мышц Фенотипическая адаптация

Skeletal muscle is a highly adaptable tissue, as its biochemical and physiological properties are greatly altered in response to chronic exercise. To ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Идентификации Спутниковое клеток скелетных мышц, иммунофлюоресценции с Pax7 и Ламинин антител

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

В естественных условиях Imaging мышц сухожилие морфогенеза в куколки дрозофилы

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Isolation, Culture, Characterization, and Differentiation of Human Muscle Progenitor Cells from the Skeletal Muscle Biopsy Procedure

Изоляция, Культура, Характеристика и Дифференциация клеток-прародителей мышц человека от процедуры биопсии скелетных мышц

The use of primary human tissue and cells is ideal for the investigation of biological and physiological processes such as the skeletal muscle ...

Performing Human Skeletal Muscle Xenografts in Immunodeficient Mice

Выполнение человеческих скелетных мышц ксенотрансплантатов в иммунодефицитных мышей

Treatment effects observed in animal studies often fail to be recapitulated in clinical trials. While this problem is multifaceted, one reason for this ...