Röntgendiffraktion av intakt murin skelettmuskulaturen som ett verktyg för att studera den strukturella grunden för muskelsjukdom

Fysiologiskt intakt mus skelettmuskulaturen kan producera högkvalitativa röntgendiffraktion mönster som innehåller mycket strukturell information som kan ge insikt i fysiologiska processer. Röntgendiffraktion är den enda teknik som möjliggör förvärv av högupplöst strukturell information från levande muskelvävnad under verkliga fysiologiska förhållanden i verklig fysiologisk tid. Många muskelsjukdomar ärvs.

Med ökad tillgänglighet till genetiskt modifiera de flesta modeller av myopathies, röntgendiffraktion kan ge strukturella insikter i sjukdomsmekanismer och indikera terapeutiska strategier. De flesta extensor digitorum longus och soleus muskler är särskilt bekvämt för detta ändamål. Men många andra muskler i små djur kan dissekeras intakt och hanteras på ett liknande sätt.

Innan du börjar förfarandet, slå på den kombinerade motor kraft givaren, motor kraft givaren styrenhet med en hög effekt biphasic ström stimulator, och en datorkontroll datainsamling styrsystem. Därefter spraya huden på bakdelen av musen med kalla Ringer lösning och använda fina dissection saxar för att skära huden runt låret. Använda nummer fem tåtamplar, dra snabbt huden ner för att exponera musklerna och amputera bakbenen.

Placera lemmen i en elastomerbelagd dissekeringsskål som innehåller syresatt Ringers lösning och placera skålen under ett kikärt dissekerande mikroskop. För att skörda soleus muskeln, stift bakbenen med gastrocnemius muskeln vänd uppåt. Använd fin sax för att skära den distala senan av gastrocnemius/soleus muskelgruppen.

Skär bort fascia på vardera sidan av gastrocnemius muskeln så att musklerna att lyftas försiktigt och långsamt bort från benet. Sedan befria proximala senan av soleus muskeln. Pin ner muskelgruppen som innehåller gastrocnemius muskeln och den distala sena i skålen.

Lyft soleus muskeln försiktigt via den proximala senan för att skilja den från gastrocnemius muskeln, lämnar så mycket av soleus distal sena intakt som möjligt. För att skörda extensor digitorum longus eller EDL muskel, stift bakbenen i skålen med tibialis främre muskeln uppåt och skär fascia längs tibialis främre muskeln. Använd forceps för att dra fascian klar och skär den distala senan i tibialis främre muskeln.

Lyft tibialis främre muskeln och skär ut det försiktigt utan att dra i EDL muskeln, och skär upp den laterala sidan av knäet för att exponera de två senor. Skär den proximala senan, lämnar oss mycket av senan som möjligt fortfarande fäst vid muskeln och försiktigt dra på senan för att lyfta EDL muskeln. Skär sedan den distala senan när den väl är utsatt.

För att montera den skördade muskeln, stift ner muskeln via senor och trimma så mycket av extra fett, fascia och senan som möjligt. Sätt in en sena i en förknuten knut och använd sutur binda forceps att binda suturen tätt. Bind den andra knuten på runt metallkroken och upprepa proceduren på den andra änden av senan.

Fäst sedan den korta kroken på den experimentella kammarens botten, och den långa kroken på kraftgivarens motor med dubbla lägen. Bubbla lösningen i experimentkammaren med 100%syre. För att optimera stimuleringsprotokollet och muskellängd justera mikro manipulatorer knutna till givaren motorn för att generera en baslinje spänning mellan 15 till 20 millinewtons att hitta de bästa stimulansparametrar att sträcka muskeln.

Ställ in stimuleringsspänningen på 40 volt. Stimuleringsströmmen kommer att ökas systematiskt tills det inte finns någon ytterligare ökning av twitch force. För att hitta den optimala längden, öka muskellängden och aktivera muskeln med en enda rycka tills den aktiva kraften slutar öka.

Utför en en sekund tetanisk kontraktion för att testa monteringen och sträcka muskeln tillbaka till den optimala baslinjen kraft som behövs. Spela sedan in muskellängden i millimeter med ett digitalt bromsok. För att bestämma strålläget, använd en bit röntgenkänsligt papper som producerar en mörk fläck som svar på röntgen och en video hårkors generator för att skapa ett hårkors i linje med brännmärket på papperet.

Med hjälp av det BioCAT-medföljande grafiska användargränssnittet till provställaren, centrera muskeln på strålpositionen och flytta provstadiet för att svänga provkammaren med 10 till 20 millimeter per sekund för att sprida röntgendos över hela muskeln under exponeringen. Observera provet när det rör sig för att undvika stora regioner i fascia som innehåller kollagen och för att säkerställa att det förblir upplyst under hela vägen för sin resa. Beväpna detektorn och vänta på utlösaren från datainsamlingssystemet.

Sedan utlöser de mekaniska och röntgendata samtidigt för att synkronisera dem. Röntgenmönstren kommer att samlas in kontinuerligt under hela protokollet med en 10-millisekkunders exponeringstid och en 50-millisekkunders exponeringsperiod. I denna representativa isometrisk tetanic kontraktion EDL muskeln hölls i vila i 0,5 sekunder innan det aktiverades för en sekund, följt av en 1,5-sekunders avkoppling.

Muskelröntgen diffraktion mönster kan ge nanometerupplösning strukturell information från strukturer inuti sarkom. Myosin-baserade lagerlinjer som innehåller tjocka glödtrådar är starka och skarpa i mönster från vilande muskler, medan aktinbaserade lagerlinjer som innehåller tunna glödtrådar är mer framträdande i mönster från upphandlande muskler. Skillnad mönster som erhållits genom att subtrahera vilomönstret från kontrakteringsmönstret kan belysa strukturella förändringar under kraftutveckling i friska och sjuka muskler.

Genom att följa dessa strukturella förändringar vid millisekkundernas tidsskala för de molekylära händelserna under muskelkontraktion och avkoppling kan röntgendiffraktionsmönstren avslöja väsentlig strukturell information. I denna representativa ekvatoriella reflektioner analys med hjälp av ekvatorn rutin i open source MuscleX paketet, ekvatorial intensitet förhållandet indikerar närheten till myosin till aktin i vila muskler och är nära korrelerad till antalet bifogade tvärbroar i upphandlande murine skelettmuskulatur. Avståndet mellan de två 1, 0 reflektion är omvänt relaterade till interfilamentavståndet.

En ren dissekering är nyckeln för en framgångsrik intakt muskelröntgen experiment, så försök att undvika eventuella mekaniska skador under muskel beredning. Varje standard fysiologiska protokoll med hela muskler kan genomföras i dessa experiment och kan användas för att studera muskelaktivering, avkoppling och cross-bridge beteende under snabb mekanisk förspänning. Genetisk manipulation av möss blir alltmer sofistikerad.

Nya transgena musmodeller gör det möjligt att utforma mer specifika och insiktsfulla experiment för att indikera nya terapeutiska riktningar för mänskliga myopatier.