בשיטה זו, אנו יכולים ללמוד את ההשפעות של פעילות פנימית על התבגרות של מבשרי interneuron קליפת המוח. טכניקה זו מספקת דרך יעילה לפילוח ומניפולציה של המאפיינים התאיים של אבי ההתמחות בקליפת המוח הנגישה לרוב הקהילה המדעית. פרוטוקול זה כרוך בטיפול קפדני של דגימות וציוד, וזה יכול להיות מוערך בצורה הטובה ביותר על ידי הדגמה חזותית.
באמצעות עט עמיד למים, לצייר קו ישר על פני החלק התחתון של פני השטח התחתון של שש מנות פטרי 35 מילימטר. הוסיפו 10 מיליליטר של נוזלים 4%low gelling agarose ב-PBS לשתיים מתוך 35 המילימטרים של מנות פטרי והטמיע שלושה עד ארבעה מוחות מנותקים ב-agarose עם נורות הריח הפונות כלפי מטה לכל מנה מעבר לקו הישר, ומשאירות שלושה עד חמישה מילימטרים של רווח בין כל דגימה. כאשר כל המוחות הוטבעו, מניחים את הכלים בארבע מעלות צלזיוס כדי לאפשר לאגרוז לחזק ולגילף את שלושת המוחות לגוש אחד של אגרוז, ומשאירים כשלושה מילימטרים של ג'ל סביב קצות הדגימות.
הדבק את הבלוק על פני השטח של בסיס microtome ולהשתמש להב כירורגי לחתוך את כל הדרך דרך החלק התחתון של הבלוק בין כל דגימת רקמה כדי להשיג שלושה בלוקים עצמאיים. לאחר מכן, השתמש במיקרוטום להב רוטט כדי לחתוך את הבלוקים בתסרון קרבס קר כקרח לפרוסות בעובי 250 מיקרומטר, באמצעות מיקרוספטולה שטוחה מכופפת כדי לאסוף רק את הפרוסות המכילות את הגנגליוניים המדיאליים או הכרוביים. לאחר מכן, מניחים כל קטע על קוטר בודד של 13 מיקרומטר, קרום מסנן בגודל שמונה מיקרומטר נקבוביות צף על מדיום חיוני מינימלי במרכז פוליסטירן בודדים גם מנות תרבות איברים.
כאשר כל החלקים הושגו, מניחים את הכלים באינקובטור תרבות רקמת פחמן דו חמצני ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. לפני הזרקת הדנ"א המוקדית, מניחים קוטר של מילימטר אחד, עמודי אגרוז באורך 10 מ"מ עם זכוכית באורך 225 מ"מ, פיפטה זכוכית בקיבולת של שני מיליליטר לתסכולת קרבס קרה כקרח. באמצעות להב כירורגי, לחתוך חתיכה אחת קטנה יותר של אגרוז כדי להתאים על פני השטח של האלקטרודה electroporation וחתיכה אחת גדולה יותר לשמש כבסיס להזרקות DNA המוקד.
לאחר מכן, מניחים את גושי ההתעוררות לתוך פתרון קרבס קר כקרח. להזרקה, מערבבים את הביטוי ושולטים בדנ"א וקטורי בריכוז של מיקרוגרם אחד לכל מיקרוליטר עבור כל וקטור ומוסיפים תב"א מלאי ירוק מהיר בדילול של 1 עד 10. מלאו קוטר פנימי של 0.5 מילימטר, מיקרופיגט זכוכית בקוטר חיצוני של מיליליטר עם 10 מיקרוליטרים של תערובת הדנ"א וטען את המיקרופיט למזרק פיקו-פמפ פנאומטי.
מניחים את הבלוק הגדול יותר של אגרוז תחת מיקרוסקופ סטריאו ומ מניחים את הפרוסה להיות מוזרק על פיסת אגרוז. לאחר מכן, להזריק 25 כדי 50 ננוליטר כרכים לתוך נבחר גנגליוני המדיאלי או אזור גנגליוני כרובית של הפרוסה. מיד לאחר ההזרקה, מניחים את בלוק אגרוז קטן על אלקטרודה צלחת פטרי ולהשתמש microspatula שהסתיים שטוחים כדי לחבר את עמוד אגרוז אלקטרודה כיסוי נייד.
מעבירים את הפרוסה המוזרקת עם הממברנה התומכת שלה אל גוש ההתעוררות ומציבים את האלקטרודה העליונה עם עמוד ההתעוררות על גבי האזור הנבחר של הפרוסה. לאחר מכן, אלקטרופוליזציה האזור עם שני פולסים של חמש אלפיות השניה של 125 וולט, 500 אלפיות השניה זה מזה. לאחר האלקטרופוריה, מניחים את הפרוסה עם הממברנה התומכת שלה בחזרה לתוך צלחת החזקה שלה ולהחזיר את המנה לאנקובטור תרבות הרקמה.
לאחר שעה אחת, החלף את המדיום החיוני המינימלי במדיום בסיסי המתאים לתרבויות עצביות ראשוניות והחזר את הפרוסות לחממה בן לילה. בניסויי אלקטרופורציה אלה, כ -50% מהנוירונים החיוביים של GFP הביעו במשותף את החלבון שהוזרק חיובי ל- RFP ולכן, האוכלוסייה השלילית החיובית של GFP RFP שימשה כבקרה פנימית להשפעת ליגנדים DNA מוזרק. ניהול Clozapine ותחמוצת מגביר באופן סלקטיבי את הפעילות של תאים חיוביים RFP מנודים, כפי שהוכח על ידי הביטוי של חלבון תלוי פעילות, c-Fos, אלה רקמת קורונול שזה עתה נולדו.
טיפול Clozapine ותחמוצת גם תוצאות עלייה בשיעור של תאים חיוביים GFP RFP חיובי RFP ביחס למספר תאים חיוביים GFP RFP שלילי בהשוואה לפסולת מנוהל רכב. הליך זה יכול לשמש כדי ללמוד את ההשפעות של פעילות-לווסת interneurons מושתל על פלסטיות במחזור הדם ותפקוד המוח של המארח.
