Med denna metod kan vi studera effekterna av inneboende aktivitet på mognaden av kortikala interneuronprekursorer. Denna teknik ger ett effektivt sätt att rikta och manipulera cellulära egenskaper när interneuron progenitors som är tillgänglig för majoriteten av det vetenskapliga samfundet. Detta protokoll innebär noggrann hantering av prover och utrustning, och det kan bäst uppskattas av visuell demonstration.
Dra en rak linje över mitten av den nedre delen av den nedre ytan av sex 35-millimeters petriskålar med hjälp av en vattentät penna. Tillsätt 10 milliliter vätska 4%låg gelering agaros i PBS i två av de 35-millimeters Petri-rätter och bädda in tre till fyra dissekerade hjärnor i agaros med luktlökar nedåt per skålen över den raka linjen, vilket ger tre till fem millimeter utrymme mellan varje prov. När alla hjärnor har bäddats in, placera disken på fyra grader Celsius så att agaros att stelna och skära de tre hjärnorna i ett enda block av agaros, lämnar cirka tre millimeter gel runt kanterna på proverna.
Lim blocket på ytan av en mikrotom bas och använda ett kirurgiskt blad för att skära hela vägen genom botten av blocket mellan varje vävnadsprov för att få tre oberoende block. Använd därefter en vibrerande blad mikrotom för att dela upp blocken i iskall Krebs lösning i 250-mikrometer tjocka skivor, med hjälp av en böjd platt mikrospatula för att samla endast skivor som innehåller den mediala eller caudal ganglionic eminences. Placera sedan varje sektion på individuell 13-mikrometerdiameterdiameter, åtta-mikrometer porstorlek filtermembran flytande på minimalt essentiellt medium i enskilda polystyren centrum väl orgel kultur rätter.
När alla sektioner har erhållits, placera disken i en koldioxidvävnad kultur inkubator på 37 grader Celsius i en timme. Före fokal DNA-injektionen, placera en millimeter diameter, 10-millimeters långa agaros kolumner stansas med ett glas 225-millimeters lång, två-milliliter kapacitet glaspipett i iskall Krebs lösning. Med hjälp av ett kirurgiskt blad, skär en mindre bit av agaros för att passa på ytan av elektroporationelektroden och en större bit som ska användas som bas för fokala DNA-injektioner.
Placera sedan agarosblocken i iskall Krebs-lösning. För injektionen, blanda uttrycket och kontrollera vektor DNA vid en en-mikrogram per mikroliter koncentration för varje vektor och tillsätt snabb grön stamlösning vid en en till 10: e utspädning. Fyll en dragen 0,5-millimeters innerdiameter, en milliliter ytterdiameter glasmikropipette med 10 mikroliter av DNA-blandningen och ladda mikropipettet i en pneumatisk PicPumpo-injektor.
Placera det större blocket av agaros under ett stereomikroskop och placera den skiva som ska injiceras på den bit av agaros. Injicera sedan 25 till 50-nanoliter volymer i den valda mediala ganglionic eller caudal ganglionic eminens regionen av skivan. Omedelbart efter injektionen, placera den lilla agaros blocket på Petri-skålen elektrod och använda en platt slutade microspatula att fästa agaros kolonnen till den mobila täcka elektroden.
Överför den injicerade skivan med dess stödjande membran på agarosblocket och placera den översta elektroden med agaroskolonnen ovanpå den valda regionen av skivan. Sedan elektroporat regionen med två fem-millisekkunder pulser på 125 volt, 500 millisekunder isär. Efter elektroporationen, placera skiva med sitt hållande membran tillbaka till sin anläggning skålen och returnera skålen till vävnadskulturen inkubatorn.
Efter en timme, ersätta det minimala väsentliga mediet med ett grundläggande medium som är lämpligt för primära neuronala kulturer och returnera skivorna till inkubatorn över natten. I dessa elektroporationsexperiment var ungefär 50% av de GFP positiva nervcellerna co-uttryckt det RFP positiva injicerade proteinet och därför fungerade GFP-positiv RFP-negativ population som en intern kontroll för effekten av de injicerade DNA-liganderna. Klozapin och oxid administration ökar selektivt aktiviteten hos transfected RFP positiva celler, vilket framgår av uttrycket av den aktivitetsberoende protein, c-Fos, i dessa nyfödda koronal vävnad sektioner.
Klozapin och oxidbehandling resulterar också i en ökning av andelen GFP-positiva RFP-positiva celler i förhållande till antalet GFP-positiva RFP-negativa celler jämfört med fordon som administreras littermates. Detta förfarande kan användas för att studera effekterna av aktivitetsmodulerade ympade interneuroner på cirkulatorisk plasticitet och hjärnans funktion av värden.
