Name: localization of sumo-modified proteins using fluorescent sumo-trapping proteins
Uploaded: 2019-04-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins at JoVE.com

ونود ان نشكر جميع أعضاء مختبر كيرشر علي دعمهم ، ناتالي نغوين للقراءة النقدية للمخطوطة ، وليديا سيب للتسلسل. وقد دعم هذا العمل صندوق الكومنولث لتسويق البحوث MF16-034-LS إلى OK. وقدم الدعم البحثي لطلاب W & M من قبل صندوق بحوث بيلي-هوستون ، ومركز تشارلز يكرم زمالات لري و CH.

1. الكشف عن السومو في خلايا الانسجه الثابتة الثقافة باستخدام المؤتلف KmUTAG-FL السومو البروتين الملائمة
<ol><li>تنمو الخلايا ثقافة الانسجه المفضلة علي 22 مم الغطاء المستدير ينزلق في لوحات TC 6-حسنا حتى 70 ٪-80 ٪ متموج. قم بتنفيذ الخطوات 1.2 – 1.8 في اللوحة 6 جيدا.</li>
	<li>تغسل الخلايا لفتره وجيزة مع 1 مل من DPBS...

<ol>
	<li>Kerscher, O., Felberbaum, R., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+proteins+by+ubiquitin+and+ubiquitin-like+proteins.">Modification of proteins by ubiquitin and ubiquitin-like proteins.</a> Cell and Developmental Biology. 22, 159-180 (2006).</li><li>Kerscher, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> SUMOylation. , 1-11 (2016).</li><li>Hay, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO:+a+history+of+modification.">SUMO: a history of modification.</a> Molecular Cell. 18 (1), 1-12 (2005).</li><li>Fu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+SUMO-specific+protease+2+induces+mitochondria+mediated+neurodegeneration.">Disruption of SUMO-specific protease 2 induces mitochondria mediated neurodegeneration.</a> PLoS Genetics. 10 (10), e1004579-e1004579 (2014).</li><li>Zhang, H., Kuai, X., Ji, Z., Li, Z., Shi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Over-expression+of+small+ubiquitin-related+modifier-1+and+sumoylated+p53+in+colon+cancer.">Over-expression of small ubiquitin-related modifier-1 and sumoylated p53 in colon cancer.</a> Cell biochemistry and biophysics. 67 (3), 1081-1087 (2013).</li><li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO-specific+protease+1+promotes+prostate+cancer+progression+and+metastasis.">SUMO-specific protease 1 promotes prostate cancer progression and metastasis.</a> Oncogene. 32 (19), 2493-2498 (2013).</li><li>Karami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+SUMO-Protease+SENP7S+Regulates+&#946;-catenin+Signaling+and+Mammary+Epithelial+Cell+Transformation.">Novel SUMO-Protease SENP7S Regulates &#946;-catenin Signaling and Mammary Epithelial Cell Transformation.</a> Scientific Reports. 7 (1), 46477 (2017).</li><li>Pelisch, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+SUMO-Dependent+Protein+Network+Regulates+Chromosome+Congression+during+Oocyte+Meiosis.">A SUMO-Dependent Protein Network Regulates Chromosome Congression during Oocyte Meiosis.</a> Molecular Cell. 65 (1), 66-77 (2017).</li><li>Zhang, X. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO-2/3+modification+and+binding+regulate+the+association+of+CENP-E+with+kinetochores+and+progression+through+mitosis.">SUMO-2/3 modification and binding regulate the association of CENP-E with kinetochores and progression through mitosis.</a> Molecular Cell. 29 (6), 729-741 (2008).</li><li>Baker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducibility+crisis:+Blame+it+on+the+antibodies.">Reproducibility crisis: Blame it on the antibodies.</a> Nature News. 521 (7552), 274-276 (2015).</li><li>Wang, Z., Prelich, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quality+control+of+a+transcriptional+regulator+by+SUMO-targeted+degradation.">Quality control of a transcriptional regulator by SUMO-targeted degradation.</a> Molecular and Cellular Biology. 29 (7), 1694-1706 (2009).</li><li>Li, S. J., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+protease+required+for+cell-cycle+progression+in+yeast.">A new protease required for cell-cycle progression in yeast.</a> Nature. 398 (6724), 246-251 (1999).</li><li>Peek, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO+targeting+of+a+stress-tolerant+Ulp1+SUMO+protease.">SUMO targeting of a stress-tolerant Ulp1 SUMO protease.</a> PLoS ONE. 13 (1), e0191391 (2018).</li><li>Edgar, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+13+Blastomere+Culture+and+Analysis.">Chapter 13 Blastomere Culture and Analysis.</a> Methods in Cell Biology. 48, 303-321 (1995).</li><li>Pelisch, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+SUMO+modification+regulates+mitotic+chromosome+assembly+and+cell+cycle+progression+in+Caenorhabditis+elegans.">Dynamic SUMO modification regulates mitotic chromosome assembly and cell cycle progression in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Communications. 5 (1), 769 (2014).</li><li>Dillingham, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+single-stranded+DNA+binding+protein+as+a+probe+for+sensitive,+real-time+assays+of+helicase+activity.">Fluorescent single-stranded DNA binding protein as a probe for sensitive, real-time assays of helicase activity.</a> Biophysical Journal. 95 (7), 3330-3339 (2008).</li><li>Ruckman, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2'-Fluoropyrimidine+RNA-based+aptamers+to+the+165-amino+acid+form+of+vascular+endothelial+growth+factor+(VEGF165).+Inhibition+of+receptor+binding+and+VEGF-induced+vascular+permeability+through+interactions+requiring+the+exon+7-encoded+domain.">2'-Fluoropyrimidine RNA-based aptamers to the 165-amino acid form of vascular endothelial growth factor (VEGF165). Inhibition of receptor binding and VEGF-induced vascular permeability through interactions requiring the exon 7-encoded domain.</a> The Journal of Biological Chemistry. 273 (32), 20556-20567 (1998).</li><li>Hughes, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+specific+inhibitors+of+SUMO-1-+and+SUMO-2/3-mediated+protein-protein+interactions+using+Affimer+(Adhiron)+technology.">Generation of specific inhibitors of SUMO-1- and SUMO-2/3-mediated protein-protein interactions using Affimer (Adhiron) technology.</a> Science Signaling. 10 (505), eaaj2005 (2017).</li><li>Lopata, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affimer+proteins+for+F-actin:+novel+affinity+reagents+that+label+F-actin+in+live+and+fixed+cells.">Affimer proteins for F-actin: novel affinity reagents that label F-actin in live and fixed cells.</a> Scientific Reports. 8 (1), 6572 (2018).</li><li>Gilbreth, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoform-specific+monobody+inhibitors+of+small+ubiquitin-related+modifiers+engineered+using+structure-guided+library+design.">Isoform-specific monobody inhibitors of small ubiquitin-related modifiers engineered using structure-guided library design.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (19), 7751-7756 (2011).</li><li>Berndt, A., Wilkinson, K. A., Heimann, M. J., Bishop, P., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+characterization+of+the+properties+of+SUMO1-specific+monobodies.">In vivo characterization of the properties of SUMO1-specific monobodies.</a> Biochemical Journal. 456 (3), 385-395 (2013).</li></ol>

هنا نقدم استخدام kmUTAG-fl ، بروتين المؤتلف ، للدراسات الوظيفية من السومو في خلايا الثدييات الثابتة وتشريح الغدد الديدان الخيطية. KmUTAG-fl هو كاشف خاص بعموم السومو متسامح مع الإجهاد يتعرف علي البروتينات الاصليه المترافقة مع السومو وسلاسل السومو ويوقعها. وبما ان الهيكل الثالث لشركه السومو مصان ب...

والغرض من هذا الأسلوب هو تسهيل دراسة وتحليل البروتينات المترافقة السومو باستخدام المؤتلف السومو التراكب UTAG (Ulp علامةالمجال) البروتين. كما هو مفصل أدناه ، يمكن استخدام UTAG بدلا من الكواشف الأخرى والنهج لتنقيه وكشف وتصور البروتينات المعدلة السومو. اعتمادا علي ظروف النمو ، قد تحتوي الخلايا علي مئات أو آلاف البروتينات التي يتم تعديلها باستخدام سلاسل السومو أو السومو (للمراجعة انظر Kerscher et al. 20061 و kerscher 20162). وهذا يمثل صعوبة كبيره بالنسبة للتحليلات الوظيفية للبروتينات المعدلة السومو محدده, خصوصا ان جزءا فقط من هدف sumoylation معينه هو في الواقع تعديل3. بالاضافه إلى أدوارهم في العمليات الخلوية الاساسيه مثل التنظيم العابر ، توازن البروتين ، والاستجابة للإجهاد الخلوي ، وأعاده عرض الكروماتين اثناء الانقسام والانقسام العصبي ؛ أصبح من الواضح الآن بما فيه الكفاية ان السومو ، السومو-البروتينات المعدلة ، ومكونات مسار السومو أيضا لديها إمكانات كما المؤشرات الحيوية للامراض مثل السرطان واضطرابات الأعصاب4،5،6 ،7. وهذا يؤكد الحاجة إلى أدوات قويه وموثوقه ومتاحه بسهوله ونهج مبتكره للكشف والتحليل الوظيفي للبروتينات المعدلة السومو في مجموعه متنوعة من الخلايا والعينات.
في العديد من الانظمه ، الأجسام المضادة الخاصة السومو هي الكواشف المفضلة للكشف والعزل والتحليلات الوظيفية للبروتينات المعدلة السومو8،9. ومع ذلك ، فان بعض الأجسام المضادة الخاصة بالسومو المتاحة تجاريا باهظه التكلفة ، ومحدوده الكمية أو التوافر ، وعرضه لإظهار التقارب المتغير بشكل عشوائي والتفاعل التبادلي ، وفي بعض الحالات تنقص استنساخ10. ويتمثل أحد النهج البديلة في التعبير عن العلامات التي تم الوسم بها في الخلايا المتحولة والكائنات الحية ، ولكن ربط علامات المربه إلى السومو قد يخفض بشكل مصطنع اقترانه بأهداف البروتين11. بالاضافه إلى ذلك ، لا تكون المربية مفيده عند تقييم الخلايا أو الانسجه غير المحولة.
Ulp1 هو الانزيم البروتيني السومو المحفوظة من s. سيريفيسياي ان كلا العمليات السلائف السومو و desumoylates السومو البروتينات مترافق12. قمنا بتطوير كاشف UTAG استنادا إلى الملاحظة صدفه ان طفرة من السيستين الحفاز (C580S) في Ulp1's السومو معالجه Ulp domain (UD) لا يمنع فقط السومو الانقسام ولكن أيضا الفخاخ السومو-البروتينات مترافق مع ارتفاع الغرائب12. للبساطة ، أشرنا إلى هذه القطعة الطرفية Ulp1 (C580S) الخاصة بالجهاز الذي يشبه الكربوكسي باسم UTAG (اختصار ل UD TAG). UTAG هو بروتين التراكب عموم السومو التي تمثل بديلا مفيدا لمكافحه السومو الأجسام المضادة المستخدمة للعزل والكشف عن البروتينات المعدلة السومو. الأهم من ذلك ، فانه يعترف علي وجه التحديد-مطوية أصلا ، السومو مترافق وليس فقط واحد أو عده المردة علي السومو. لتحسين كل من الاستقرار البروتين و السومو قوه ملزمه من UTAG ، ونحن ولدت البديل من UTAG من الخميرة المتسامحة الإجهاد كلوفيريميسسيس ماركسيانوس (كم). KmUTAG باحكام يربط السومو-الاقتران مع نانومولار تقارب13. بالاضافه إلى ذلك ، kmUTAG مقاومه لدرجات الحرارة المرتفعة (42 درجه مئوية) ، والحد من العوامل (5 مم TCEP-تريس (2-كربوكسيايثيل) هيدروكلوريد فوسفونين) ، المسخ (ما يصل إلى 2 م اليوريا) ، والعوامل المؤكسدة (0.6 ٪ بيروكسيد الهيدروجين) ، والمنظفات غير الايونيه. هذا التحمل الإجهاد مفيد خلال حاله تنقيه قاسيه وأوقات الحضانة لفترات طويلة ، وضمان الاستقرار والنشاط السومو المحاصرة. ومع ذلك ، ليس من المستغرب ان يكون نشاط KmUTAG لمحاصره السومو غير متوافق مع الكواشف المعدلة من السيستين والمنظفات الايونيه ومستخلصات البروتين المشوهة تماما. التقارب الملحوظ وخصائص KmUTAG تشير إلى ان هذا الكاشف قد تصبح جزءا من المرجع القياسي لدراسة البروتينات sumoylated في أنواع متعددة.
هنا نقدم طريقه بسيطه للكشف عن البروتينات المعدلة السومو في الخلايا الثديية والديدان الخيطية باستخدام بروتين الانصهار الفلورية mCherry-كموتاغ المؤتلف (kmUTAG-fl).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Well Cell Culture Plates</td>
			<td>Genesee Scientific/Olympus Plastics</td>
			<td>25-105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-545-003</td>
			<td>Used as a secondary antibody for mouse monoclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Gibco 14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dylight 488 conjugated AffiniPure Goat Anti-Moue IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-485-146</td>
			<td>Used as a secondary antibody for mouse monoclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Coverglass for Growth Cover Glasses</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12545101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLUORO-GEL II with DAPI</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>50-246-93)</td>
			<td>Mounting media in step 1.11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLUORO-GEL with DABCO</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>17985-02</td>
			<td>With DAPI added to 1 &#181;g/mL; mounting media in step 2.2.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine-HCl</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP3815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine-HCl</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>6000-43-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KmUTAG-fl</td>
			<td>Kerafast</td>
			<td></td>
			<td>KmUTAG reagents are available on Kerafast.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oneblock Western-CL blocking buffer</td>
			<td>Prometheus</td>
			<td>20-313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, Phosphate Buffered Saline, 10X Solution</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP3994</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNT2 cell line</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>95012613</td>
			<td>Normal prostate epithelium immortalized with SV40.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSPOT1</td>
			<td>(ChromoTek GmbH)</td>
			<td>ev-1</td>
			<td>https://www.chromotek.com/fileadmin/user_upload/pdfs/Datasheets/pSpot1_v1.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUMO 6F2</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>SUMO 6F2</td>
			<td>SUMO 6F2 was deposited to the DSHB by Pelisch, F. / Hay, R.T. (DSHB Hybridoma Product SUMO 6F2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUMO protease buffer [10x]</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>500 mM Tris-HCl, pH 8.0, 2% NP-40, 1.5 M NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUMO-2 Antibody 8A2</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>SUMO-2 8A2</td>
			<td>SUMO-2 8A2 was deposited to the DSHB by Matunis, M. (DSHB Hybridoma Product SUMO-2 8A2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP-HCL</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>51805-45-9</td>
			<td>Used as a reducing agent at a concentration of 5mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>Used for permeablization at 0.1% in DPBS/PBS(for worms)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

localization of sumo-modified proteins using fluorescent sumo-trapping proteins

هنا نقدم طريقه جديده لدراسة البروتينات وتوطينها شبه الخلوي في خلايا الثدييات والبويضات الخيطية. هذا الأسلوب يستخدم المؤتلف تعديل السومو-محاصره جزء من البروتين, kmUTAG, المستمدة من الانزيم البروتيني Ulp1 السومو من الخميرة الناشئة المتسامحة الإجهاد كلوفيريميسسيس ماركسيانوس. لقد قمنا بتكييف خصائص kmUTAG لغرض دراسة sumoylation في مجموعه متنوعة من النظم النموذجية دون استخدام الأجسام المضادة. لدراسة السومو ، KmUTAG لديها العديد من المزايا بالمقارنة مع النهج المستندة إلى الأجسام المضادة. يتم إنتاج هذا الكاشف المتسامح مع الإجهاد السومو ريكومبينانتلي ، فانه يعترف ايسواشكال السومو الأصلي من العديد من الأنواع ، وعلي عكس الأجسام المضادة المتاحة تجاريا فانه يظهر انخفاض تقارب لحره ، السومو غير مترافق. وتشمل النتائج التمثيلية المبينة هنا توطين الاقترانات السومو في خلايا ثقافة الانسجه الثديية والبويضات الخيطية.

KmUTAG-fl هو المؤتلف ، mCherry الموسومة البروتين السومو المحاصرة. لإنتاج kmUTAG-fl ، ونحن المستنسخة codon الأمثل مككرز-kmUTAG في pSPOT1 التعبير الفوقي البكتيري (الشكل 1). بعد الاستقراء ، تم تنقيه بروتين kmUTAG-fl علي بقعه فخ ، والتملص ، والمجمدة حتى مزيد من الاستخدام. لضمان النشاط ?...

Watch this Scientific Journal Video about Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins at JoVE.com

Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

السومو هو البروتين المعدل الأساسي والمحفوظ بشكل كبير والصغير الحجم. في هذا البروتوكول ، نقوم بوصف استخدام بروتين التراكب السومو الذي يتسامح مع الإجهاد (kmUTAG) لتصور الاصليه ، وغير الموسومة السومو الاقتران وتوطينها في مجموعه متنوعة من أنواع الخلايا.

توطين البروتينات المعدلة السومو باستخدام السومو الفلورسنت-البروتينات الملائمة

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...

أهمية هذا البروتوكول هو استخدام رواية الفلورسنت سومو محاصرة بروتين UTAG للكشف عن المعدل البروتين سومو في مختلف الخلايا eukaryotic. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي بروتوكول مباشر للكشف عن الأجسام المضادة خالية من سومو في مجموعة متنوعة من الخلايا، بما في ذلك زراعة الأنسجة الثدييات والنياتودا الخيطية. يلعب SUMO أدوارًا مهمة في السرطان والاضطرابات العصبية ، وهذا يؤكد الحاجة إلى أدوات قوية وموثوقة للكشف عن البروتينات المعدلة من سومو وتحليلها وظيفيًا.لأن سومو هو الحفاظ على درجة عالية، يمكن استخدام البروتين الفلوري سومو محاصرة UTAG لتسمية سومو مترافق في العديد من الكائنات الحية المختلفة. يوضح هذا الفيديو استخدامه في خلايا الثدييات. بالإضافة إلى ذلك، يصف النص الكامل استخدامه في البويضات الخيطية.العرض المرئي لهذه التقنية يوفر تلميحات هامة لعلاج الخلايا قبل التلطيخ والكشف SUMO. للبدء، تنمو خلايا زراعة الأنسجة في الاختيار على 22 ملليمتر غطاء جولة زلات في لوحات TC ستة جيدا حتى 70 إلى 80٪التقاء. اغسل الخلايا لفترة وجيزة مع ملليلتر واحد من DPBS.لإصلاح الخلايا، إضافة ملليلتر من 4٪ PFA الطازجة وDPBS إلى كل بئر. احتضان الخلايا لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. اغسل الخلايا الثابتة ثلاث مرات لمدة خمس دقائق في ملليلتر واحد من DPBS أثناء تناول اللوحة.ل Permeabilize الخلايا، احتضان لمدة 15 دقيقة مع 1٪ تريتون X-100 في DPBS. غسل الخلايا مرة أخرى، كما كان من قبل. احتضان الخلايا مع 500 ميكرولترات من 1 المولى الجليسين HCL 2 pH لمدة 10 ثانية.ثم تحييد الحموضة على الفور مع 500 ميكرولترers من 10X سومو Protease العازلة، أو SPB. بعد غسل الخلايا كما كان من قبل، وإزالة زلات الغطاء من البئر ووضعها في غرفة الرطوبة. لUTAG-FL تلطيخ فقط، مزيج ميكروغرام واحد من UTAG-FL مع 100 ميكرولترات من 1X SPB تحتوي على خمسة متر TCEP في أنبوب.ثم، ماصة المزيج على الخلايا على زلة الغطاء واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة في غرفة الرطوبة. لغسل قسائم الغطاء، الماصات 200 ميكرولترات من DPBS على كل زلة الغطاء وترك في مكان لمدة 10 دقائق. كرر الغسيل مرتين اُكرَان.إزالة زلات الغطاء من الغسيل الماضي وعكس على شريحة المجهرية تنظيفها مسبقا مع قطرة من المتوسط المتصاعد. تخزين العينات بين عشية وضحاها في 20 درجة مئوية الفريزر قبل عرض تحت المجهر. تصور الخلايا باستخدام مجموعات التصفية المناسبة لـ DAPI وتكساس ريد.الرجاء مراجعة النص الكامل لبروتوكول حول كيفية تسمية سومو والرنا الثابتة الخيطية الخيطية. في حين أن وضع العلامات على خلايا الثدييات هو واضح جدا، ووضع العلامات البويضات الخيطية يتطلب التدريب المسبق في تشريح الشناء. وأظهرت KmUTAG-FL المحتضنة مع خلايا PMT2 ثابتة تلطيخ نووي متميز.وكان كل من التلطيخ النووي المنتشر و البؤر النووية المتميزة مرئيين. تم تأكيد التوطين النووي باستخدام التلطيخ المشترك مع DAPI. واتساقا مع نشاط التراكب SUMO في KmUTAG-FL، كان نمط التوطين النووي يذكرنا بتلوين SUMO23.أكد التلطيخ المشترك مع الأجسام المضادة لـ SUMO23 8A2 التعريب المشترك لـ KmUTAG-FL مع إشارة SUMO23. وهذا يؤكد فعالية KmUTAG-FL للكشف عن SUMO23 في خلايا الثدييات. السناد المعزولة من البويضات المنتجة للبالغين hermaphrodite ج.تم تصنيف اليغانز الديدان الخيطية مع الأجسام المضادة سومو. بما يتفق مع التقارير السابقة، الأجسام المضادة لسومو المترجمة في البداية إلى plasm النووية من البويضات الطورية في وقت متأخر من myotic. ثم أعيد توزيعها على مجمع الحلقة المركزي للرموز الثنائية حيث انهار المغلف النووي واتّيبت الكروموسومات نحو لوحة metaphase.في الاستعدادات الموازية، كشفت الغنودات المسماة بـ KmUTAG-FL عن أنماط مماثلة. تحولت KmUTAG-FL من وضع العلامات على النوكللوبلازم إلى التركيز على مجمع الحلقة حيث بدأت البويضات وأكملت عملية انهيار المغلف النووي. هذه النتائج التحقق من صحة KmUTAG-FL كأداة مفيدة لتحليل myosis والعمليات ذات الصلة SUMO في ج.elegans وربما غيرها من الديدان الخيطية. أثناء إجراء التثبيت ، من المهم استخدام ما قبل الفورمالدهيد الطازج ووقت التثبيت القصير للحفاظ على سومو مطوية أصليًا بحيث يمكن التعرف عليها من قبل KmUTAG. وبما أن هيكل سومو الثالثي محافظ بدرجة عالية، فمن المرجح جداً أن متغيرات سومو من أنظمة النماذج الإضافية وغير النموذجية يمكن تحليلها باستخدام كاشف KmUTAG-FL.حاليا، ونحن نستخدم هذا الفلورسنت سومو المحاصرة بروتين UTAG لدراسة وظيفة سومو خلال الإجهاد الخلوي. وأخيراً، يرجى ملاحظة أنه ينبغي تنفيذ جميع الخطوات باستخدام شبه شكلي المثبت في غطاء أمان المختبر ويجب التخلص من هذا الكاشف بشكل صحيح.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identification of Plant Ice-binding Proteins Through Assessment of Ice-recrystallization Inhibition and Isolation Using Ice-affinity Purification

تحديد البروتينات النباتية الجليد ملزمة من خلال تقييم تثبيط الآيس التبلور وعزل عن طريق الآيس تقارب تنقية

Ice-binding proteins (IBPs) belong to a family of stress-induced proteins that are synthesized by certain organisms exposed to subzero temperatures. In ...

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.

خالية من المنظفات فائق السرعة إعادة تشكيل بروتينات الغشاء إلى بليرس الدهن باستخدام فوسوجينيك بروتيوليبوسوميس تكميلية مشحونة.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers ...

Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

كشف المنظفات تراعي التفاعلات بين البروتينات الغشاء

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

How to Quantify the Fraction of Photoactivated Fluorescent Proteins in Bulk and in Live Cells

كيفية تحديد جزء صغير البروتينات الفلورية فوتواكتيفاتيد بكميات كبيرة وفي الخلايا الحية

Photoactivatable and -convertible fluorescent proteins (PA-FPs) have been used in fluorescence live-cell microscopy for analyzing the dynamics of cells ...

Fluorescent Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels

تلوين الفضة الفلورسنت من البروتينات في المواد الهلامية Polyacrylamide

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide ...

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

استخدام البروتينات الانصهار المؤتلف في منصة فحص حوزتي فلورسنت وما ريناتوريشن في جل

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...

Characterizing Cellular Proteins with In-cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins

توصيف البروتينات الخلوية مع الأكسدة الضوئية السريعة في الخلية من البروتينات

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting method used to characterize protein structure and interactions. ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

المقطع المستعرض من الأرز الناضج(Oryza sativa L.) حبات لمسح المجهر الإلكتروني التصوير باستخدام نصائح ماصة كدعم تعطيل

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Optimized Incorporation of Alkynyl Fatty Acid Analogs for the Detection of Fatty Acylated Proteins using Click Chemistry

الدمج الأمثل لنظائر الأحماض الدهنية ألكينيل للكشف عن البروتينات الأسيلات الدهنية باستخدام Click Chemistry

Fatty acylation, the covalent addition of saturated fatty acids to protein substrates, is important in regulating a myriad of cellular functions in ...

Production of Recombinant PRMT Proteins using the Baculovirus Expression Vector System

إنتاج بروتينات PRMT المؤتلفة باستخدام نظام ناقلات التعبير عن فيروس باكولو

Protein arginine methyltransferases (PRMTs) methylate arginine residues on a wide variety of proteins that play roles in numerous cellular processes. ...