Name: localization of sumo-modified proteins using fluorescent sumo-trapping proteins
Uploaded: 2019-04-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins at JoVE.com

Vi vil gerne takke alle medlemmer af Kerscher Lab for deres støtte, Nathalie Nguyen for kritisk læsning af manuskriptet, og Lidia EPP for sekventering. Dette arbejde er blevet støttet af Commonwealth Research kommercialisering fond MF16-034-LS til OK. Forskningsstøtte til W & M studerende blev leveret af Bailey-Huston Research fond, og Charles Center Honors stipendier til RY og CH.

1. SUMO-påvisning i faste vævskultur celler ved hjælp af rekombinant KmUTAG-FL SUMO-diffusor protein
<ol><li>Grow væv kultur celler valg på 22 mm rundt dække glider i 6-Well TC plader indtil 70%-80% konflydende. Udfør trin 1.2 – 1.8 i 6-brøndens plade.</li>
	<li>Vask cellerne kortvarigt med 1 mL DPBS (Dulbeccos fosfat-buffer-bufferet saltvand)</li>
	<li>Til fiksering forberedes en ny opløsning af 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) opløsning (fortyndet i DPBS). For at reparere celler skal du tilføje 2 mL 4% PFA i DPB...

<ol>
	<li>Kerscher, O., Felberbaum, R., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+proteins+by+ubiquitin+and+ubiquitin-like+proteins.">Modification of proteins by ubiquitin and ubiquitin-like proteins.</a> Cell and Developmental Biology. 22, 159-180 (2006).</li><li>Kerscher, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> SUMOylation. , 1-11 (2016).</li><li>Hay, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO:+a+history+of+modification.">SUMO: a history of modification.</a> Molecular Cell. 18 (1), 1-12 (2005).</li><li>Fu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+SUMO-specific+protease+2+induces+mitochondria+mediated+neurodegeneration.">Disruption of SUMO-specific protease 2 induces mitochondria mediated neurodegeneration.</a> PLoS Genetics. 10 (10), e1004579-e1004579 (2014).</li><li>Zhang, H., Kuai, X., Ji, Z., Li, Z., Shi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Over-expression+of+small+ubiquitin-related+modifier-1+and+sumoylated+p53+in+colon+cancer.">Over-expression of small ubiquitin-related modifier-1 and sumoylated p53 in colon cancer.</a> Cell biochemistry and biophysics. 67 (3), 1081-1087 (2013).</li><li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO-specific+protease+1+promotes+prostate+cancer+progression+and+metastasis.">SUMO-specific protease 1 promotes prostate cancer progression and metastasis.</a> Oncogene. 32 (19), 2493-2498 (2013).</li><li>Karami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+SUMO-Protease+SENP7S+Regulates+&#946;-catenin+Signaling+and+Mammary+Epithelial+Cell+Transformation.">Novel SUMO-Protease SENP7S Regulates &#946;-catenin Signaling and Mammary Epithelial Cell Transformation.</a> Scientific Reports. 7 (1), 46477 (2017).</li><li>Pelisch, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+SUMO-Dependent+Protein+Network+Regulates+Chromosome+Congression+during+Oocyte+Meiosis.">A SUMO-Dependent Protein Network Regulates Chromosome Congression during Oocyte Meiosis.</a> Molecular Cell. 65 (1), 66-77 (2017).</li><li>Zhang, X. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO-2/3+modification+and+binding+regulate+the+association+of+CENP-E+with+kinetochores+and+progression+through+mitosis.">SUMO-2/3 modification and binding regulate the association of CENP-E with kinetochores and progression through mitosis.</a> Molecular Cell. 29 (6), 729-741 (2008).</li><li>Baker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducibility+crisis:+Blame+it+on+the+antibodies.">Reproducibility crisis: Blame it on the antibodies.</a> Nature News. 521 (7552), 274-276 (2015).</li><li>Wang, Z., Prelich, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quality+control+of+a+transcriptional+regulator+by+SUMO-targeted+degradation.">Quality control of a transcriptional regulator by SUMO-targeted degradation.</a> Molecular and Cellular Biology. 29 (7), 1694-1706 (2009).</li><li>Li, S. J., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+protease+required+for+cell-cycle+progression+in+yeast.">A new protease required for cell-cycle progression in yeast.</a> Nature. 398 (6724), 246-251 (1999).</li><li>Peek, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO+targeting+of+a+stress-tolerant+Ulp1+SUMO+protease.">SUMO targeting of a stress-tolerant Ulp1 SUMO protease.</a> PLoS ONE. 13 (1), e0191391 (2018).</li><li>Edgar, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+13+Blastomere+Culture+and+Analysis.">Chapter 13 Blastomere Culture and Analysis.</a> Methods in Cell Biology. 48, 303-321 (1995).</li><li>Pelisch, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+SUMO+modification+regulates+mitotic+chromosome+assembly+and+cell+cycle+progression+in+Caenorhabditis+elegans.">Dynamic SUMO modification regulates mitotic chromosome assembly and cell cycle progression in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Communications. 5 (1), 769 (2014).</li><li>Dillingham, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+single-stranded+DNA+binding+protein+as+a+probe+for+sensitive,+real-time+assays+of+helicase+activity.">Fluorescent single-stranded DNA binding protein as a probe for sensitive, real-time assays of helicase activity.</a> Biophysical Journal. 95 (7), 3330-3339 (2008).</li><li>Ruckman, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2'-Fluoropyrimidine+RNA-based+aptamers+to+the+165-amino+acid+form+of+vascular+endothelial+growth+factor+(VEGF165).+Inhibition+of+receptor+binding+and+VEGF-induced+vascular+permeability+through+interactions+requiring+the+exon+7-encoded+domain.">2'-Fluoropyrimidine RNA-based aptamers to the 165-amino acid form of vascular endothelial growth factor (VEGF165). Inhibition of receptor binding and VEGF-induced vascular permeability through interactions requiring the exon 7-encoded domain.</a> The Journal of Biological Chemistry. 273 (32), 20556-20567 (1998).</li><li>Hughes, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+specific+inhibitors+of+SUMO-1-+and+SUMO-2/3-mediated+protein-protein+interactions+using+Affimer+(Adhiron)+technology.">Generation of specific inhibitors of SUMO-1- and SUMO-2/3-mediated protein-protein interactions using Affimer (Adhiron) technology.</a> Science Signaling. 10 (505), eaaj2005 (2017).</li><li>Lopata, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affimer+proteins+for+F-actin:+novel+affinity+reagents+that+label+F-actin+in+live+and+fixed+cells.">Affimer proteins for F-actin: novel affinity reagents that label F-actin in live and fixed cells.</a> Scientific Reports. 8 (1), 6572 (2018).</li><li>Gilbreth, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoform-specific+monobody+inhibitors+of+small+ubiquitin-related+modifiers+engineered+using+structure-guided+library+design.">Isoform-specific monobody inhibitors of small ubiquitin-related modifiers engineered using structure-guided library design.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (19), 7751-7756 (2011).</li><li>Berndt, A., Wilkinson, K. A., Heimann, M. J., Bishop, P., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+characterization+of+the+properties+of+SUMO1-specific+monobodies.">In vivo characterization of the properties of SUMO1-specific monobodies.</a> Biochemical Journal. 456 (3), 385-395 (2013).</li></ol>

Her introducerer vi brugen af kmUTAG-fl, et rekombinant protein, til funktionelle undersøgelser af SUMO i faste pattedyrceller og dissekterede fyrretræsnematoden gonader. KmUTAG-fl er et stress-tolerant pan-SUMO-specifikt reagens, der genkender og fælder indfødte SUMO-konjugeret proteiner og SUMO-kæder. Da suis tertiære struktur er meget bevaret, er det meget sandsynligt, at SUMO-varianter fra yderligere model-og ikke-modelsystemer kan analyseres med kmUTAG-fl-reagensen. KmUTAG-fl kan som sådan repræsentere et ny...

Formålet med denne metode er at gøre det lettere at studere og analysere SUMO-konjugeret proteiner ved hjælp af det rekombinante SUMO-opfangnings UTAG-protein (Ulp Domain Tag). Som beskrevet nedenfor kan UTAG bruges i stedet for andre reagenser og tilgange til at rense, opdage og visualisere SUMO-modificerede proteiner. Afhængigt af vækstbetingelserne kan cellerne indeholde hundreder eller tusinder af proteiner, der er modificeret med SUMO-eller SUMO-kæder (til gennemsyn, se Kerscher et al. 20061 og kerscher 20162). Dette udgør et betydeligt problem for de funktionelle analyser af specifikke SUMO-modificerede proteiner, især da kun en brøkdel af et bestemt sumoyleringsmål faktisk er ændret3. Ud over deres roller i væsentlige cellulære processer såsom transkriptional regulering, protein homøostase, respons på cellulære stress, og kromatin remodeling under mitose og meiose; Det er nu blevet tilstrækkeligt klart, at Sumo, Sumo-modificerede proteiner, og Sumo pathway komponenter også har potentiale som biomarkører for patologier såsom kræft og neurodegenerative sygdomme4,5,6 ,7. Dette understreger behovet for robuste, pålidelige og let tilgængelige værktøjer og innovative tilgange til påvisning og funktionel analyse af SUMO-modificerede proteiner i en række forskellige celler og prøver.
I mange systemer er Sumo-specifikke antistoffer reagenserne i valg til påvisning, isolering og funktionelle analyser af Sumo-modificerede proteiner8,9. Men nogle kommercielt tilgængelige SUMO-specifikke antistoffer er dyre, begrænset i mængde eller tilgængelighed, tilbøjelige til at udstille vildt variable tilhørsforhold og Cross-reaktivitet, og i nogle tilfælde mangler reproducerbarhed10. En alternativ tilgang er udtrykket af epitop-tagget Sumo i transformerede celler og organismer, men sammenkædning af epitop Tags med Sumo kan kunstigt sænke dets konjugering til protein målene11. Desuden er epitoper ikke nyttige, når utransformerede celler eller væv evalueres.
Ulp1 er en bevaret SUMO-proteasehæmmere fra S. cerevisiae , som begge forarbejder Sumo-prækursor og desumoylates Sumo-konjugeret protein12. Vi udviklede utag-reagensen baseret på den serendipitøse observation, at en mutation af den katalytiske cystein (C580S) i Ulp1's Sumo-behandling Ulp domæne (ud) ikke kun forhindrer Sumo spaltning, men også fælder Sumo-konjugeret proteiner med høj aviditet12. For nemheds skyld, vi henviste til denne carboxy-Terminal SUMO-diffusering Ulp1 (C580S) fragment som UTAG (kort for UD TAG). UTAG er et rekombinant pan-SUMO-fælde fangstprotein, der repræsenterer et nyttigt alternativ til anti-SUMO-antistoffer, der anvendes til isolering og påvisning af SUMO-modificerede proteiner. Vigtigere, det specifikt genkender indbygget foldet, konjugeret SUMO og ikke blot en eller flere epitoper på SUMO. For at forbedre både protein stabiliteten og den SUMO bindende styrke UTAG genererede vi en variant af UTAG fra den stress-tolerante gær Kluyveromyces marxianus (km). KmUTAG binder SUMO-conjugates stramt med nanomolær affinitet13. Derudover er kmUTAG modstandsdygtig over for forhøjede temperaturer (42 °C), reduktionsmidler (5 mM TCEP-tris (2-carboxyethyl) phosphinhydrochlorid), denatureringsmidler (op til 2 M urea), oxiderende midler (0,6% hydrogenperoxid) og ikke-ioniske rengøringsmidler. Denne stress tolerance er gavnlig under barske rensnings forhold og langvarig inkubationstid, hvilket sikrer dens stabilitet og SUMO-fælde fangstaktivitet. Det er dog ikke overraskende, at Kmutag's SUMO-fælde fangstaktivitet er uforenelig med cystein-modificerende reagenser, ionholdige rengøringsmidler og fuldt denaturerede protein ekstrakter. Kmutags bemærkelsesværdige affinitet og egenskaber indikerer, at dette reagens kan blive en del af standardrepertoiret til studiet af sumoylerede proteiner i flere arter.
Her giver vi en enkel metode til påvisning af SUMO-modificerede proteiner i pattedyrsceller og nematoder ved hjælp af et rekombinant fluorescerende mCherry-KmUTAG-fusionsprotein (kmUTAG-FL).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Well Cell Culture Plates</td>
			<td>Genesee Scientific/Olympus Plastics</td>
			<td>25-105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-545-003</td>
			<td>Used as a secondary antibody for mouse monoclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Gibco 14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dylight 488 conjugated AffiniPure Goat Anti-Moue IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-485-146</td>
			<td>Used as a secondary antibody for mouse monoclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Coverglass for Growth Cover Glasses</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12545101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLUORO-GEL II with DAPI</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>50-246-93)</td>
			<td>Mounting media in step 1.11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLUORO-GEL with DABCO</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>17985-02</td>
			<td>With DAPI added to 1 &#181;g/mL; mounting media in step 2.2.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine-HCl</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP3815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine-HCl</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>6000-43-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KmUTAG-fl</td>
			<td>Kerafast</td>
			<td></td>
			<td>KmUTAG reagents are available on Kerafast.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oneblock Western-CL blocking buffer</td>
			<td>Prometheus</td>
			<td>20-313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, Phosphate Buffered Saline, 10X Solution</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP3994</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNT2 cell line</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>95012613</td>
			<td>Normal prostate epithelium immortalized with SV40.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSPOT1</td>
			<td>(ChromoTek GmbH)</td>
			<td>ev-1</td>
			<td>https://www.chromotek.com/fileadmin/user_upload/pdfs/Datasheets/pSpot1_v1.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUMO 6F2</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>SUMO 6F2</td>
			<td>SUMO 6F2 was deposited to the DSHB by Pelisch, F. / Hay, R.T. (DSHB Hybridoma Product SUMO 6F2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUMO protease buffer [10x]</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>500 mM Tris-HCl, pH 8.0, 2% NP-40, 1.5 M NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUMO-2 Antibody 8A2</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>SUMO-2 8A2</td>
			<td>SUMO-2 8A2 was deposited to the DSHB by Matunis, M. (DSHB Hybridoma Product SUMO-2 8A2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP-HCL</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>51805-45-9</td>
			<td>Used as a reducing agent at a concentration of 5mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>Used for permeablization at 0.1% in DPBS/PBS(for worms)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

localization of sumo-modified proteins using fluorescent sumo-trapping proteins

Her præsenterer vi en ny metode til at studere sumoylering af proteiner og deres sub-cellulære lokalisering i pattedyrceller og fyrretræsnematoden oocytter. Denne metode udnytter et rekombinant modificeret SUMO-diffuse Rings protein fragment, kmUTAG, afledt af Ulp1 SUMO proteasehæmmere af den stress-tolerante spirende gær Kluyveromyces marxianus. Vi har tilpasset egenskaberne for kmUTAG med det formål at studere sumoylering i en række modelsystemer uden brug af antistoffer. Til studiet af SUMO, KmUTAG har flere fordele i forhold til antistof-baserede tilgange. Dette stress-tolerante SUMO-diffuse Rings reagens fremstilles i kombination, det genkender indfødte SUMO-isoformer fra mange arter, og i modsætning til kommercielt tilgængelige antistoffer viser det reduceret affinitet til fri, ukonjugeret SUMO. De repræsentative resultater, der er vist her, omfatter lokalisering af SUMO-konjugater i pattedyrs vævskultur celler og fyrretræsnematoden oocytter.

KmUTAG-fl er et rekombinant, mCherry-Tagged SUMO-diffuse Rings protein. For at producere kmUTAG-fl klonede vi en codon-optimeret mCherry-kmUTAG i pSPOT1 bakteriel overekspression plasmid (figur 1). Efter induktion blev kmUTAG-fl-proteinet renset på spot-TRAP, elueret og frosset indtil videre brug. For at sikre, at KmUTAG-fl har en SUMO-diffuse Rings aktivitet, bekræftede vi binding til SUMO1-konjugeret perler og udfældning af et SUMO-CAT-fusionsprotein (da...

Watch this Scientific Journal Video about Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins at JoVE.com

Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

Sumo er et vigtigt og meget bevaret, lille ubiquitin-lignende ændrings-protein. I denne protokol beskriver vi brugen af et stress-tolerant rekombinant SUMO-diffuse Rings protein (kmUTAG) til at visualisere indfødte, ukodede SUMO-konjugater og deres lokalisering i en række forskellige celletyper.

Lokalisering af SUMO-modificerede proteiner ved hjælp af fluorescerende Sumo-diffuse Rings proteiner

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...

Betydningen af denne protokol er brugen af en ny fluorescerende SUMO-fældefangst UTAG protein til påvisning af proteinmodifikator SUMO i forskellige eukaryote celler. Den største fordel ved denne teknik er en enkel protokol for antistoffri påvisning af SUMO i en række celler, herunder pattedyrvævskultur og nematode gonader. SUMO spiller en vigtig rolle i kræft- og neurodegenerative lidelser, og dette understreger behovet for robuste og pålidelige værktøjer til påvisning og funktionel analyse af SUMO-modificerede proteiner.Da SUMO er meget bevaret, kan det fluorescerende UTAG-protein i ALTO-fældefangst bruges til at mærke konjugeret SUMO i mange forskellige organismer. Denne video viser dens anvendelse i pattedyrceller. Desuden beskriver den fulde tekst dens anvendelse i nematode oocytter.Den visuelle demonstration af denne teknik giver kritiske tips til behandling af celler før farvning og SUMO detektion. Til at begynde, vokse væv kultur celler valg på 22-millimeter runde dække glider i seks-godt TC plader indtil 70 til 80% sammenløb. Cellerne vaskes kortvarigt med en milliliter DPBS.For at fikse cellerne tilsættes to milliliter frisk 4% PFA og DPBS til hver brønd. Inkuber cellerne i 20 minutter ved stuetemperatur. De faste celler vaskes tre gange i fem minutter i en milliliter DPBS, mens pladen skal dust.For at permeabilize cellerne, inkubere i 15 minutter med 1%Triton X-100 i DPBS. Vask cellerne igen, som før. Cellerne inkuberes med 500 mikroliter på 1 kindarglycin HCL pH 2 i 10 sekunder.Derefter neutraliseres pH straks med 500 mikroliter af 10X SUMO Protease buffer, eller SPB. Efter vask af cellerne som før, skal du fjerne dækslet glider fra brønden og placere dem i en luftfugtighed kammer. For UTAG-FL-farvning blandes kun et mikrogram UTAG-FL med 100 mikroliter 1X SPB indeholdende fem millimolar TCEP i et rør.Derefter pipette blandingen på cellerne på dækslet slip og inkubere ved stuetemperatur i en time i luftfugtigheden kammer. For at vaske dækslet glider, pipette 200 mikroliter af DPBS på hvert dæksel slip og lad på plads i 10 minutter. Gentag vasken to gange mere.Fjern dækslet fra den sidste vask og invertere på en forrensede mikroskopi dias med en dråbe montering medium. Opbevar prøverne natten over i en 20 grader Celsius fryser, før du ser under mikroskopet. Visualiser cellerne ved hjælp af de relevante filtersæt til DAPI og Texas Red.Se den fulde tekst til en protokol om, hvordan du mærker SUMO og faste nematode gonader. Mens mærkning pattedyr celler er temmelig ligetil, mærkning nematode oocytter kræver forudgående uddannelse i gonad dissektioner. KmUTAG-FL inkuberet med faste PMT2 celler viste en særskilt nuklear farvning.Både diffuse nukleare farvning og forskellige nukleare foci var synlige. Nuklear lokalisering blev bekræftet ved hjælp af co-farvning med DAPI. I overensstemmelse med SUMO fældefangst aktivitet kmUTAG-FL, den nukleare lokalisering mønster mindede om SUMO23 farvning.Co-farvning med anti-SUMO23 8A2 antistof bekræftede co-lokalisering af KmUTAG-FL med SUMO23 signal. Dette validerer effekten af KmUTAG-FL til at opdage SUMO23 i pattedyrceller. Isolerede gonader fra oocyt-producerende voksne hermafrodit c.elegans nematoder var mærket med anti-SUMO antistof. I overensstemmelse med tidligere rapporter, anti-SUMO antistof oprindeligt lokaliseret til den nukleare plasme af sent myotisk prophase oocytter. Derefter omfordeles til den centrale ring kompleks af de parrede homologer som den nukleare kuvert brød sammen og kromosomer kongressens mod metafase plade.I parallelle præparater afslørede gonader mærket med KmUTAG-FL lignende mønstre. KmUTAG-FL skiftede fra mærkning af nukleoplasmen til at koncentrere sig om ringkomplekset, da oocytterne begyndte og afsluttede processen med nukleare kuvertfordeling. Disse resultater validerer KmUTAG-FL som et nyttigt redskab til analyse af myosis og SUMO-relaterede processer i c.elegans og eventuelt andre nematoder. Mens du udfører fiksering, er det afgørende at bruge frisk paraformaldehyd og en kort fikseringstid for at holde SUMO indbygget foldet, så det kan genkendes af KmUTAG. Da SUMO's tertiære struktur er stærkt bevaret, er det meget sandsynligt, at SUMO varianter fra yderligere model og ikke-model systemer kan analyseres med KmUTAG-FL reagens.I øjeblikket bruger vi denne roman fluorescerende SUMO-fældefangst UTAG protein til at studere funktionen af SUMO under cellulære stress. Endelig skal du være opmærksom på, at alle trin, der anvender det fiksative paraformaldehyd, skal udføres i en laboratoriesikkerhedshætte, og dette reagens skal bortskaffes korrekt.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identification of Plant Ice-binding Proteins Through Assessment of Ice-recrystallization Inhibition and Isolation Using Ice-affinity Purification

Identifikation af Plant Ice-bindende Proteiner Gennem Vurdering af Ice-omkrystallisation inhibering og isolering ved hjælp af is-affinitet Oprensning

Ice-binding proteins (IBPs) belong to a family of stress-induced proteins that are synthesized by certain organisms exposed to subzero temperatures. In ...

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.

Vaskemiddel-fri ultrahurtig rekonstituering af membranproteiner i Lipid dobbeltlag ved hjælp af Fusogenic komplementære-ladet Proteoliposomes.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers ...

Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

Påvisning af vaskemiddel-følsomme interaktioner mellem Membranproteiner

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

How to Quantify the Fraction of Photoactivated Fluorescent Proteins in Bulk and in Live Cells

Hvordan man kan kvantificere brøkdel af Photoactivated fluorescerende proteiner i Bulk og i levende celler

Photoactivatable and -convertible fluorescent proteins (PA-FPs) have been used in fluorescence live-cell microscopy for analyzing the dynamics of cells ...

Fluorescent Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels

Fluorescerende sølv farvning af proteinerne i polyacrylamidgeler

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide ...

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

Brug af rekombinant Fusion proteiner i et fluorescerende Protease Assay Platform og deres i-gel genopretning

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...

Characterizing Cellular Proteins with In-cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins

Karakteriserecellulære proteiner med in-cell hurtig fotokemisk oxidation af proteiner

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting method used to characterize protein structure and interactions. ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Tværgående 2000 af ældre ris(Oryza sativa L.) Kerner til scanning elektronmikroskopi imaging ved hjælp af pipette tips som immobilisering Support

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Optimized Incorporation of Alkynyl Fatty Acid Analogs for the Detection of Fatty Acylated Proteins using Click Chemistry

Optimeret inkorporering af alkynylfedtsyreanaloger til påvisning af fedtaylerede proteiner ved hjælp af klikkemi

Fatty acylation, the covalent addition of saturated fatty acids to protein substrates, is important in regulating a myriad of cellular functions in ...

Production of Recombinant PRMT Proteins using the Baculovirus Expression Vector System

Produktion af rekombinante PRMT-proteiner ved hjælp af Baculovirus Expression Vector System

Protein arginine methyltransferases (PRMTs) methylate arginine residues on a wide variety of proteins that play roles in numerous cellular processes. ...