Name: localization of sumo-modified proteins using fluorescent sumo-trapping proteins
Uploaded: 2019-04-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins at JoVE.com

We willen graag alle leden van het Kerscher Lab bedanken voor hun steun, Nathalie Nguyen voor de kritische lezing van het manuscript, en Lidia EPP voor sequencing. Dit werk is ondersteund door de Commonwealth Research commercialisatie Fonds MF16-034-LS op OK. Ondersteuning van het onderzoek voor W & M studenten werd verzorgd door de Bailey-Huston onderzoek Fonds, en Charles Center eert beurzen aan RY en CH.

1. de opsporing van SUMO in de cellen van de vaste weefselcultuur gebruikend recombinant KmUTAG-FL SUMO-vangt proteïne
<ol><li>Kweek weefselkweek cellen van keuze op 22 mm ronde deksel glijdt in 6-goed TC platen tot 70%-80% Confluent. Voer stap 1,2 – 1.8 uit in de 6-well plaat.</li>
	<li>Was de cellen kort met 1 mL DPBS (Dulbecco fosfaat-gebufferde zoutoplossing)</li>
	<li>Voor fixatie, bereid een nieuwe oplossing van 4% Paraformaldehyde (oplossing) (verdund in DPBS). Om cellen vast te stellen, voegt u 2 mL 4%-DPBS ...

<ol>
	<li>Kerscher, O., Felberbaum, R., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+proteins+by+ubiquitin+and+ubiquitin-like+proteins.">Modification of proteins by ubiquitin and ubiquitin-like proteins.</a> Cell and Developmental Biology. 22, 159-180 (2006).</li><li>Kerscher, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> SUMOylation. , 1-11 (2016).</li><li>Hay, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO:+a+history+of+modification.">SUMO: a history of modification.</a> Molecular Cell. 18 (1), 1-12 (2005).</li><li>Fu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+SUMO-specific+protease+2+induces+mitochondria+mediated+neurodegeneration.">Disruption of SUMO-specific protease 2 induces mitochondria mediated neurodegeneration.</a> PLoS Genetics. 10 (10), e1004579-e1004579 (2014).</li><li>Zhang, H., Kuai, X., Ji, Z., Li, Z., Shi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Over-expression+of+small+ubiquitin-related+modifier-1+and+sumoylated+p53+in+colon+cancer.">Over-expression of small ubiquitin-related modifier-1 and sumoylated p53 in colon cancer.</a> Cell biochemistry and biophysics. 67 (3), 1081-1087 (2013).</li><li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO-specific+protease+1+promotes+prostate+cancer+progression+and+metastasis.">SUMO-specific protease 1 promotes prostate cancer progression and metastasis.</a> Oncogene. 32 (19), 2493-2498 (2013).</li><li>Karami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+SUMO-Protease+SENP7S+Regulates+&#946;-catenin+Signaling+and+Mammary+Epithelial+Cell+Transformation.">Novel SUMO-Protease SENP7S Regulates &#946;-catenin Signaling and Mammary Epithelial Cell Transformation.</a> Scientific Reports. 7 (1), 46477 (2017).</li><li>Pelisch, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+SUMO-Dependent+Protein+Network+Regulates+Chromosome+Congression+during+Oocyte+Meiosis.">A SUMO-Dependent Protein Network Regulates Chromosome Congression during Oocyte Meiosis.</a> Molecular Cell. 65 (1), 66-77 (2017).</li><li>Zhang, X. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO-2/3+modification+and+binding+regulate+the+association+of+CENP-E+with+kinetochores+and+progression+through+mitosis.">SUMO-2/3 modification and binding regulate the association of CENP-E with kinetochores and progression through mitosis.</a> Molecular Cell. 29 (6), 729-741 (2008).</li><li>Baker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducibility+crisis:+Blame+it+on+the+antibodies.">Reproducibility crisis: Blame it on the antibodies.</a> Nature News. 521 (7552), 274-276 (2015).</li><li>Wang, Z., Prelich, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quality+control+of+a+transcriptional+regulator+by+SUMO-targeted+degradation.">Quality control of a transcriptional regulator by SUMO-targeted degradation.</a> Molecular and Cellular Biology. 29 (7), 1694-1706 (2009).</li><li>Li, S. J., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+protease+required+for+cell-cycle+progression+in+yeast.">A new protease required for cell-cycle progression in yeast.</a> Nature. 398 (6724), 246-251 (1999).</li><li>Peek, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO+targeting+of+a+stress-tolerant+Ulp1+SUMO+protease.">SUMO targeting of a stress-tolerant Ulp1 SUMO protease.</a> PLoS ONE. 13 (1), e0191391 (2018).</li><li>Edgar, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+13+Blastomere+Culture+and+Analysis.">Chapter 13 Blastomere Culture and Analysis.</a> Methods in Cell Biology. 48, 303-321 (1995).</li><li>Pelisch, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+SUMO+modification+regulates+mitotic+chromosome+assembly+and+cell+cycle+progression+in+Caenorhabditis+elegans.">Dynamic SUMO modification regulates mitotic chromosome assembly and cell cycle progression in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Communications. 5 (1), 769 (2014).</li><li>Dillingham, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+single-stranded+DNA+binding+protein+as+a+probe+for+sensitive,+real-time+assays+of+helicase+activity.">Fluorescent single-stranded DNA binding protein as a probe for sensitive, real-time assays of helicase activity.</a> Biophysical Journal. 95 (7), 3330-3339 (2008).</li><li>Ruckman, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2'-Fluoropyrimidine+RNA-based+aptamers+to+the+165-amino+acid+form+of+vascular+endothelial+growth+factor+(VEGF165).+Inhibition+of+receptor+binding+and+VEGF-induced+vascular+permeability+through+interactions+requiring+the+exon+7-encoded+domain.">2'-Fluoropyrimidine RNA-based aptamers to the 165-amino acid form of vascular endothelial growth factor (VEGF165). Inhibition of receptor binding and VEGF-induced vascular permeability through interactions requiring the exon 7-encoded domain.</a> The Journal of Biological Chemistry. 273 (32), 20556-20567 (1998).</li><li>Hughes, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+specific+inhibitors+of+SUMO-1-+and+SUMO-2/3-mediated+protein-protein+interactions+using+Affimer+(Adhiron)+technology.">Generation of specific inhibitors of SUMO-1- and SUMO-2/3-mediated protein-protein interactions using Affimer (Adhiron) technology.</a> Science Signaling. 10 (505), eaaj2005 (2017).</li><li>Lopata, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affimer+proteins+for+F-actin:+novel+affinity+reagents+that+label+F-actin+in+live+and+fixed+cells.">Affimer proteins for F-actin: novel affinity reagents that label F-actin in live and fixed cells.</a> Scientific Reports. 8 (1), 6572 (2018).</li><li>Gilbreth, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoform-specific+monobody+inhibitors+of+small+ubiquitin-related+modifiers+engineered+using+structure-guided+library+design.">Isoform-specific monobody inhibitors of small ubiquitin-related modifiers engineered using structure-guided library design.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (19), 7751-7756 (2011).</li><li>Berndt, A., Wilkinson, K. A., Heimann, M. J., Bishop, P., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+characterization+of+the+properties+of+SUMO1-specific+monobodies.">In vivo characterization of the properties of SUMO1-specific monobodies.</a> Biochemical Journal. 456 (3), 385-395 (2013).</li></ol>

Hier introduceren we het gebruik van kmUTAG-FL, een recombinant eiwit, voor functionele studies van SUMO in vaste zoogdiercellen en ontleed nematoden gonaden. KmUTAG-FL is een stress-tolerante pan-SUMO specifieke reagens dat herkent en vangt native SUMO-geconjugeerde eiwitten en SUMO ketens. Aangezien SUMO de tertiaire structuur is zeer behouden is het zeer waarschijnlijk dat SUMO varianten van extra model en niet-modelsystemen kunnen worden geanalyseerd met de kmUTAG-FL reagens. Als dusdanig, kan KmUTAG-FL een nuttig al...

Het doel van deze methode is het vergemakkelijken van de studie en analyse van SUMO-geconjugeerde eiwitten met behulp van de recombinante SUMO-trapping UTAG (ULP domein tag) eiwit. Zoals hieronder beschreven, UTAG kan worden gebruikt in plaats van andere reagentia en benaderingen te zuiveren, op te sporen en te visualiseren SUMO-gemodificeerde eiwitten. Afhankelijk van de groeiomstandigheden, cellen kunnen bevatten honderden of duizenden eiwitten die zijn gewijzigd met SUMO of SUMO ketens (voor de herziening Zie Kerscher et al. 20061 en Kerscher 20162). Dit is een aanzienlijke moeilijkheid voor de functionele analyses van specifieke SUMO-gemodificeerde eiwitten, vooral omdat slechts een fractie van een bepaalde sumoylation doelstelling is eigenlijk gewijzigd3. Naast hun rol in essentiële cellulaire processen zoals transcriptie regelgeving, eiwit homeostase, de reactie op cellulaire spanning, en Chromatin het remodelleren tijdens mitose en meiose; het is nu voldoende duidelijk geworden dat Sumo, Sumo-gemodificeerde eiwitten, en Sumo pathway componenten hebben ook potentieel als biomarkers voor pathologieën zoals kanker en neurodegeneratieve aandoeningen4,5,6 ,7. Dit onderstreept de noodzaak van robuuste, betrouwbare en gemakkelijk beschikbare instrumenten en innovatieve benaderingen voor de opsporing en functionele analyse van SUMO-gemodificeerde eiwitten in een verscheidenheid van cellen en monsters.
In veel systemen, Sumo-specifieke antilichamen zijn de reagentia van de keuze voor de detectie, isolatie en functionele analyses van Sumo-gemodificeerde eiwitten8,9. Echter, sommige commercieel verkrijgbare SUMO-specifieke antilichamen zijn duur, beperkt in hoeveelheid of beschikbaarheid, vatbaar voor vertonen wild variabele affiniteiten en cross-reactiviteit, en in sommige gevallen gebrek aan reproduceerbaarheid10. Een alternatieve benadering is de uitdrukking van epitope-Tagged SUMO in getransformeerde cellen en organismen, maar het koppelen van epitope Tags aan SUMO kan kunstmatig lager zijn vervoeging aan eiwitten doelstellingen11. Bovendien, Epitopes zijn niet nuttig wanneer niet-getransformeerde cellen of weefsels worden geëvalueerd.
Ulp1 is een behouden SUMO protease uit S. cerevisiae dat beide processen de Sumo voorloper en desumoylates Sumo-geconjugeerde eiwitten12. We ontwikkelden de UTAG reagens gebaseerd op de toevallige observatie dat een mutatie van de katalytische cysteïne (C580S) in Ulp1's SUMO verwerking ULP domain (UD) niet alleen voorkomt Sumo splitsing, maar ook vallen Sumo-geconjugeerde eiwitten met hoge avidity12. Voor de eenvoud, verwees we naar deze Carboxy-Terminal SUMO-trapping Ulp1 (C580S) fragment als UTAG (kort voor UD TAG). UTAG is een recombinant pan-SUMO het vangen proteïne die een nuttig alternatief voor anti-SUMO antilichamen vertegenwoordigt die voor de isolatie en de opsporing van SUMO-gewijzigde proteïnen worden gebruikt. Belangrijker, het erkent specifiek native-gevouwen, geconjugeerde SUMO en niet alleen een of meerdere epitopes op SUMO. Ter verbetering van zowel de eiwit stabiliteit en SUMO bindende kracht van UTAG, genereerden we een variant van UTAG uit de stress-tolerante gist Kluyveromyces marxianus (km). KmUTAG stevig bindt SUMO-geconjugeerden met nanomolar affiniteit13. Bovendien, kmUTAG is bestand tegen verhoogde temperaturen (42 °C), verminderende agenten (5 mM TCEP-tris (2-carboxyethyl) Fosfine hydrochloride), denatureringsmiddelen (tot 2 M ureum), oxyderende agenten (0,6% waterstofperoxyde), en niet-ionische detergentia. Deze stress tolerantie is gunstig tijdens de harde zuivering en langdurige incubatietijden, zorgen voor de stabiliteit en SUMO-trapping activiteit. Niet verrassend, echter, KmUTAG SUMO-trapping activiteit is onverenigbaar met cysteïne-wijzigen reagentia, Ionische detergenten en volledig gedenatureerde eiwitextracten. De opmerkelijke affiniteit en eigenschappen van KmUTAG geven aan dat dit reagens onderdeel kan worden van het standaard repertoire voor de studie van sumoylated eiwitten in meerdere soorten.
Hier bieden we een eenvoudige methode om SUMO-gemodificeerde eiwitten te detecteren in zoogdiercellen en nematoden met behulp van een recombinant fluorescerende mCherry-KmUTAG Fusion-eiwit (kmUTAG-FL).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Well Cell Culture Plates</td>
			<td>Genesee Scientific/Olympus Plastics</td>
			<td>25-105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-545-003</td>
			<td>Used as a secondary antibody for mouse monoclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Gibco 14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dylight 488 conjugated AffiniPure Goat Anti-Moue IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-485-146</td>
			<td>Used as a secondary antibody for mouse monoclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Coverglass for Growth Cover Glasses</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12545101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLUORO-GEL II with DAPI</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>50-246-93)</td>
			<td>Mounting media in step 1.11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLUORO-GEL with DABCO</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>17985-02</td>
			<td>With DAPI added to 1 &#181;g/mL; mounting media in step 2.2.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine-HCl</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP3815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine-HCl</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>6000-43-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KmUTAG-fl</td>
			<td>Kerafast</td>
			<td></td>
			<td>KmUTAG reagents are available on Kerafast.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oneblock Western-CL blocking buffer</td>
			<td>Prometheus</td>
			<td>20-313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, Phosphate Buffered Saline, 10X Solution</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP3994</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNT2 cell line</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>95012613</td>
			<td>Normal prostate epithelium immortalized with SV40.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSPOT1</td>
			<td>(ChromoTek GmbH)</td>
			<td>ev-1</td>
			<td>https://www.chromotek.com/fileadmin/user_upload/pdfs/Datasheets/pSpot1_v1.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUMO 6F2</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>SUMO 6F2</td>
			<td>SUMO 6F2 was deposited to the DSHB by Pelisch, F. / Hay, R.T. (DSHB Hybridoma Product SUMO 6F2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUMO protease buffer [10x]</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>500 mM Tris-HCl, pH 8.0, 2% NP-40, 1.5 M NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUMO-2 Antibody 8A2</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>SUMO-2 8A2</td>
			<td>SUMO-2 8A2 was deposited to the DSHB by Matunis, M. (DSHB Hybridoma Product SUMO-2 8A2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP-HCL</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>51805-45-9</td>
			<td>Used as a reducing agent at a concentration of 5mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>Used for permeablization at 0.1% in DPBS/PBS(for worms)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

localization of sumo-modified proteins using fluorescent sumo-trapping proteins

Hier presenteren we een nieuwe methode om de sumoylation van eiwitten en hun sub-cellulaire lokalisatie in zoogdiercellen en nematoden oöcyten te bestuderen. Deze methode maakt gebruik van een recombinant gemodificeerde SUMO-trappen eiwit fragment, kmUTAG, afgeleid van de Ulp1 SUMO protease van de stress-tolerante ontluikende gist Kluyveromyces marxianus. Wij hebben de eigenschappen van de kmUTAG voor het bestuderen van sumoylation in een verscheidenheid van modelsystemen zonder het gebruik van antilichamen aangepast. Voor de studie van SUMO, heeft KmUTAG verscheidene voordelen wanneer vergeleken bij antilichaam-gebaseerde benaderingen. Deze stress-tolerante SUMO-trapping reagens is recombinant geproduceerd, erkent native SUMO isovormen van vele soorten, en in tegenstelling tot commercieel beschikbare antilichamen het toont verminderde affiniteit voor vrije, ongeconjugeerde SUMO. Representatieve resultaten hier zijn de lokalisatie van SUMO geconjugeerde in zoogdier weefselkweek cellen en nematoden oöcyten.

KmUTAG-FL is een recombinant, mCherry-Tagged SUMO-trapping proteïne. Om kmUTAG-FL te produceren, klonten wij een codon-geoptimaliseerde mCherry-kmUTAG in de pSPOT1 bacteriële overexpressie plasmide (Figuur 1). Na de inductie werd de kmUTAG-FL proteïne gezuiverd op Spot-TRAP, geëlueerd, en bevroren tot verder gebruik. Om de SUMO-vangstactiviteit van KmUTAG-FL te verzekeren, bevestigden wij het binden aan SUMO1-geconjugeerde parels en precipitatie van een S...

Watch this Scientific Journal Video about Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins at JoVE.com

Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

SUMO is een essentiële en zeer behouden, kleine ubiquitin-achtige modifier proteïne. In dit protocol beschrijven we het gebruik van een stress-tolerante recombinant SUMO-trappen eiwit (kmUTAG) te visualiseren native, untagged SUMO geconjugeerde en hun lokalisatie in een verscheidenheid van soorten cellen.

Lokalisatie van SUMO-gemodificeerde eiwitten met behulp van fluorescerende Sumo-trapping eiwitten

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...

De betekenis van dit protocol is het gebruik van een nieuwe fluorescerende SUMO-trapping UTAG eiwit voor de detectie van het eiwit modifier SUMO in verschillende eukaryotische cellen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is een eenvoudig protocol voor de antilichaamvrije detectie van SUMO in verschillende cellen, waaronder de weefselkweek van zoogdieren en nematodeklieren. SUMO speelt een belangrijke rol bij kanker en neurodegeneratieve aandoeningen, en dit onderstreept de noodzaak van robuuste en betrouwbare tools voor de detectie en functionele analyse van SUMO-gemodificeerde eiwitten.Omdat SUMO zeer behouden is, kan het fluorescerende SUMO-trapping UTAG-eiwit worden gebruikt om geschimenteerde SUMO in veel verschillende organismen te labelen. Deze video toont het gebruik ervan in zoogdiercellen. Daarnaast beschrijft de volledige tekst het gebruik ervan in aaltjes.De visuele demonstratie van deze techniek biedt kritische hints voor de behandeling van cellen voor vlekken en SUMO detectie. Om te beginnen groeien weefsel cultuur cellen van keuze op 22-millimeter ronde deksel glijdt in zes-goed TC platen tot 70 tot 80% confluent. Was de cellen kort met een milliliter DPBS.Om de cellen te repareren, voeg twee milliliter verse 4%PFA en DPBS aan elke put. Incubeer de cellen gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Was de vaste cellen drie keer gedurende vijf minuten in een milliliter DPBS terwijl de plaat wordt gekalift.Om de cellen te permeabiliseren, 15 minuten inbroed met 1%Triton X-100 in DPBS. Was de cellen opnieuw, zoals voorheen. Incubeer de cellen met 500 microliter van 1 molaire glycine HCL pH 2 gedurende 10 seconden.Neutraliseer vervolgens de pH onmiddellijk met 500 microliters van 10X SUMO Protease buffer, of SPB. Na het wassen van de cellen zoals voorheen, verwijder de deksel glijdt uit de put en plaats ze in een vochtigheidskamer. Voor UTAG-FL kleuring alleen, meng een microgram UTAG-FL met 100 microliter van 1X SPB met vijf millimolar TCEP in een buis.Vervolgens pipette de mix op de cellen op de cover slip en uitbroeden bij kamertemperatuur gedurende een uur in de vochtigheidskamer. Om de afdekslipjes te wassen, worden pipette 200 microliters van DPBS op elke afdeksel en laat 10 minuten op zijn plaats. Herhaal de was nog twee keer.Verwijder de afdek uit de laatste wasbeurt en keer om op een voorgezuiverde microscopie schuif met een druppel montagemedium. Bewaar de monsters 's nachts in een 20 graden Celsius vriezer voor het bekijken onder de microscoop. Visualiseer de cellen met behulp van de juiste filtersets voor DAPI en Texas Red.Zie de volledige tekst voor een protocol over het labelen van SUMO en vaste nematode-komaf. Terwijl het labelen van zoogdiercellen vrij eenvoudig is, vereist het labelen van aaltjes eicellen voorafgaande training in gonad dissecties. KmUTAG-FL geïncubeerd met vaste PMT2 cellen toonde een duidelijke nucleaire kleuring.Zowel diffuse nucleaire kleuring en verschillende nucleaire foci waren zichtbaar. Nucleaire lokalisatie werd bevestigd met behulp van co-kleuring met DAPI. In overeenstemming met de SUMO-overvulactiviteit van KmUTAG-FL deed het nucleaire lokalisatiepatroon denken aan SUMO23-kleuring.Co-kleuring met anti-SUMO23 8A2 antilichaam bevestigde de co-lokalisatie van KmUTAG-FL met het SUMO23 signaal. Dit valideert de werkzaamheid van KmUTAG-FL om SUMO23 in zoogdiercellen te detecteren. Geïsoleerde gonaden van eicelproducerende volwassen hermafrodiet c.elegans nematoden werden gelabeld met anti-SUMO antilichaam. In overeenstemming met eerdere rapporten, anti-SUMO antilichaam in eerste instantie gelokaliseerd op de nucleaire plasm van late myotische profase eicellen. Het vervolgens herverdeeld naar de centrale ring complex van de gepaarde homologs als de nucleaire envelop brak en de chromosomen in de richting van de metafase plaat.In parallelle voorbereidingen, gonads gelabeld met KmUTAG-FL bleek soortgelijke patronen. KmUTAG-FL verschoof van het labelen van het nucleoplasma naar het concentreren op het ringcomplex toen eicellen begonnen en voltooiden het proces van nucleaire enveloppe afbraak. Deze resultaten valideren KmUTAG-FL als een nuttig instrument voor de analyse van myose en SUMO-gerelateerde processen in c.elegans en eventueel andere aaltjes. Tijdens het uitvoeren van fixatie is het van cruciaal belang om verse paraformaldehyde en een korte fixatietijd te gebruiken om SUMO native gevouwen te houden, zodat het kan worden herkend door de KmUTAG. Aangezien de tertiaire structuur van SUMO zeer behouden is gebleven, is het zeer waarschijnlijk dat SUMO-varianten van aanvullende model- en niet-modelsystemen kunnen worden geanalyseerd met het KmUTAG-FL-reagens.Momenteel gebruiken we deze nieuwe fluorescerende SUMO-trapping UTAG-eiwit om de functie van SUMO te bestuderen tijdens cellulaire stress. Houd er ten slotte rekening mee dat alle stappen met behulp van het fixatieve paraformaldehyde in een laboratoriumveiligheidskap moeten worden uitgevoerd en dat dit reagens goed moet worden verwijderd.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identification of Plant Ice-binding Proteins Through Assessment of Ice-recrystallization Inhibition and Isolation Using Ice-affinity Purification

Identificatie van Plant Ice-bindende eiwitten Through Beoordeling van Ice-herkristallisatie inhibitie en isolatie met behulp van Ice-affiniteitszuivering

Ice-binding proteins (IBPs) belong to a family of stress-induced proteins that are synthesized by certain organisms exposed to subzero temperatures. In ...

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.

Wasmiddel-vrije ultrasnelle reconstitutie van membraaneiwitten in lipide-Bilayers met behulp van Fusogenic aanvullende geladen Proteoliposomes.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers ...

Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

Detectie van wasmiddel-gevoelige interacties tussen membraaneiwitten

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

How to Quantify the Fraction of Photoactivated Fluorescent Proteins in Bulk and in Live Cells

Hoe te kwantificeren van de Fractie van Photoactivated fluorescerende eiwitten in Bulk en in levende cellen

Photoactivatable and -convertible fluorescent proteins (PA-FPs) have been used in fluorescence live-cell microscopy for analyzing the dynamics of cells ...

Fluorescent Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels

Fluorescerende zilveren kleuring van eiwitten in Polyacrylamide Gels

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide ...

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

Gebruik van recombinante Fusion eiwitten in een fluorescerende Protease Assay Platform en hun In-gel renaturatie

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...

Characterizing Cellular Proteins with In-cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins

Kenmerkend voor cellulaire eiwitten met in-cell snelle fotochemische oxidatie van eiwitten

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting method used to characterize protein structure and interactions. ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Dwarsdoorsnede van rijpe rijst(Oryza sativa L.) Kernels voor scanning elektronenmicroscopie beeldvorming met behulp van pipet tips als immobilisatie ondersteuning

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Optimized Incorporation of Alkynyl Fatty Acid Analogs for the Detection of Fatty Acylated Proteins using Click Chemistry

Geoptimaliseerde integratie van alkynylvetzuuranalogen voor de detectie van vetacyleiwitten met behulp van Click Chemistry

Fatty acylation, the covalent addition of saturated fatty acids to protein substrates, is important in regulating a myriad of cellular functions in ...

Production of Recombinant PRMT Proteins using the Baculovirus Expression Vector System

Productie van recombinante PRMT-eiwitten met behulp van het Baculovirus Expression Vector System

Protein arginine methyltransferases (PRMTs) methylate arginine residues on a wide variety of proteins that play roles in numerous cellular processes. ...