Name: localization of sumo-modified proteins using fluorescent sumo-trapping proteins
Uploaded: 2019-04-27T15:00:00
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Wir bedanken uns bei allen Mitgliedern des Kerscher-Labors für die Unterstützung, Nathalie Nguyen für die kritische Lektüre des Manuskripts und Lidia Epp für die Sequenzierung. Diese Arbeit wurde vom Commonwealth Research Commercialization Fund MF16-034-LS an OK unterstützt. Die Forschungsförderung für W & M-Studierende erfolgte durch den Bailey-Huston Research Fund und die Charles Center Honors Fellowships an RY und CH.

1. SUMO-Erkennung in festen Gewebekulturzellen mit rekombinantem KmUTAG-FL SUMO-Fangneiweiß
<ol><li>Wachsen Sie Gewebekulturzellen der Wahl auf 22 mm Rundabdeckung rutschen in 6-Well-TC-Platten bis 70% – 80% konfluent. Führen Sie die Schritte 1.2 – 1,8 in der 6-well-Platte aus.</li>
	<li>Waschen Sie Zellen kurz mit 1 ml DPBS (Dulbecco es phosphatgepufferte Saline)</li>
	<li>Für die Fixierung, bereiten Sie eine frische Lösung von 4% Paraformaldehyd (PFA) Lösung (verdünnt in DPBS). Um die Zellen zu fixieren, f?...

<ol>
	<li>Kerscher, O., Felberbaum, R., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+proteins+by+ubiquitin+and+ubiquitin-like+proteins.">Modification of proteins by ubiquitin and ubiquitin-like proteins.</a> Cell and Developmental Biology. 22, 159-180 (2006).</li><li>Kerscher, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> SUMOylation. , 1-11 (2016).</li><li>Hay, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO:+a+history+of+modification.">SUMO: a history of modification.</a> Molecular Cell. 18 (1), 1-12 (2005).</li><li>Fu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+SUMO-specific+protease+2+induces+mitochondria+mediated+neurodegeneration.">Disruption of SUMO-specific protease 2 induces mitochondria mediated neurodegeneration.</a> PLoS Genetics. 10 (10), e1004579-e1004579 (2014).</li><li>Zhang, H., Kuai, X., Ji, Z., Li, Z., Shi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Over-expression+of+small+ubiquitin-related+modifier-1+and+sumoylated+p53+in+colon+cancer.">Over-expression of small ubiquitin-related modifier-1 and sumoylated p53 in colon cancer.</a> Cell biochemistry and biophysics. 67 (3), 1081-1087 (2013).</li><li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO-specific+protease+1+promotes+prostate+cancer+progression+and+metastasis.">SUMO-specific protease 1 promotes prostate cancer progression and metastasis.</a> Oncogene. 32 (19), 2493-2498 (2013).</li><li>Karami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+SUMO-Protease+SENP7S+Regulates+&#946;-catenin+Signaling+and+Mammary+Epithelial+Cell+Transformation.">Novel SUMO-Protease SENP7S Regulates &#946;-catenin Signaling and Mammary Epithelial Cell Transformation.</a> Scientific Reports. 7 (1), 46477 (2017).</li><li>Pelisch, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+SUMO-Dependent+Protein+Network+Regulates+Chromosome+Congression+during+Oocyte+Meiosis.">A SUMO-Dependent Protein Network Regulates Chromosome Congression during Oocyte Meiosis.</a> Molecular Cell. 65 (1), 66-77 (2017).</li><li>Zhang, X. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO-2/3+modification+and+binding+regulate+the+association+of+CENP-E+with+kinetochores+and+progression+through+mitosis.">SUMO-2/3 modification and binding regulate the association of CENP-E with kinetochores and progression through mitosis.</a> Molecular Cell. 29 (6), 729-741 (2008).</li><li>Baker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducibility+crisis:+Blame+it+on+the+antibodies.">Reproducibility crisis: Blame it on the antibodies.</a> Nature News. 521 (7552), 274-276 (2015).</li><li>Wang, Z., Prelich, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quality+control+of+a+transcriptional+regulator+by+SUMO-targeted+degradation.">Quality control of a transcriptional regulator by SUMO-targeted degradation.</a> Molecular and Cellular Biology. 29 (7), 1694-1706 (2009).</li><li>Li, S. J., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+protease+required+for+cell-cycle+progression+in+yeast.">A new protease required for cell-cycle progression in yeast.</a> Nature. 398 (6724), 246-251 (1999).</li><li>Peek, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO+targeting+of+a+stress-tolerant+Ulp1+SUMO+protease.">SUMO targeting of a stress-tolerant Ulp1 SUMO protease.</a> PLoS ONE. 13 (1), e0191391 (2018).</li><li>Edgar, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+13+Blastomere+Culture+and+Analysis.">Chapter 13 Blastomere Culture and Analysis.</a> Methods in Cell Biology. 48, 303-321 (1995).</li><li>Pelisch, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+SUMO+modification+regulates+mitotic+chromosome+assembly+and+cell+cycle+progression+in+Caenorhabditis+elegans.">Dynamic SUMO modification regulates mitotic chromosome assembly and cell cycle progression in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Communications. 5 (1), 769 (2014).</li><li>Dillingham, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+single-stranded+DNA+binding+protein+as+a+probe+for+sensitive,+real-time+assays+of+helicase+activity.">Fluorescent single-stranded DNA binding protein as a probe for sensitive, real-time assays of helicase activity.</a> Biophysical Journal. 95 (7), 3330-3339 (2008).</li><li>Ruckman, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2'-Fluoropyrimidine+RNA-based+aptamers+to+the+165-amino+acid+form+of+vascular+endothelial+growth+factor+(VEGF165).+Inhibition+of+receptor+binding+and+VEGF-induced+vascular+permeability+through+interactions+requiring+the+exon+7-encoded+domain.">2'-Fluoropyrimidine RNA-based aptamers to the 165-amino acid form of vascular endothelial growth factor (VEGF165). Inhibition of receptor binding and VEGF-induced vascular permeability through interactions requiring the exon 7-encoded domain.</a> The Journal of Biological Chemistry. 273 (32), 20556-20567 (1998).</li><li>Hughes, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+specific+inhibitors+of+SUMO-1-+and+SUMO-2/3-mediated+protein-protein+interactions+using+Affimer+(Adhiron)+technology.">Generation of specific inhibitors of SUMO-1- and SUMO-2/3-mediated protein-protein interactions using Affimer (Adhiron) technology.</a> Science Signaling. 10 (505), eaaj2005 (2017).</li><li>Lopata, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affimer+proteins+for+F-actin:+novel+affinity+reagents+that+label+F-actin+in+live+and+fixed+cells.">Affimer proteins for F-actin: novel affinity reagents that label F-actin in live and fixed cells.</a> Scientific Reports. 8 (1), 6572 (2018).</li><li>Gilbreth, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoform-specific+monobody+inhibitors+of+small+ubiquitin-related+modifiers+engineered+using+structure-guided+library+design.">Isoform-specific monobody inhibitors of small ubiquitin-related modifiers engineered using structure-guided library design.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (19), 7751-7756 (2011).</li><li>Berndt, A., Wilkinson, K. A., Heimann, M. J., Bishop, P., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+characterization+of+the+properties+of+SUMO1-specific+monobodies.">In vivo characterization of the properties of SUMO1-specific monobodies.</a> Biochemical Journal. 456 (3), 385-395 (2013).</li></ol>

Hier stellen wir die Verwendung von kmUTAG-fl, einem rekombinanten Protein, für funktionelle Studien von SUMO in festen Säugetierzellen und zerlegter Nematoden-Gonaden vor. KmUTAG-fl ist ein stresstolerantes Pan-SUMO-spezifisches Reagenz, das einheimische SUMO-konjugierte Proteine und SUMO-Ketten erkennt und eingefangen. Da die tertiäre Struktur von SUMO stark konserviert ist, ist es sehr wahrscheinlich, dass SUMO-Varianten aus zusätzlichen Modell-und Nicht-Modellsystemen mit dem kmUTAG-fl-Reagenz analysiert werden k...

Ziel dieser Methode ist es, die Erforschung und Analyse von SUMO-konjugierten Proteinen mit dem rekombinanten SUMO-Fallen UTAG (Ulp domainTag) Protein zu erleichtern. Wie im Folgenden beschrieben, kann die UTAG anstelle anderer Reagenzien und Ansätze zur Reinigung, Erkennung und Visualisierung von SUMO-modifizierten Proteinen eingesetzt werden. Je nach Wachstumsbedingungen können Zellen hunderte oder Tausende von Proteinen enthalten, die mit SUMO oder SUMO-Ketten modifiziert werden (siehe Kerscher et al. 20061 und Kerscher 20162). Dies stellt eine erhebliche Schwierigkeit für die funktionelle Analyse bestimmter SUMO-modifizierter Proteine dar, zumal nur ein Bruchteil eines bestimmten Sumoylierungsziels tatsächlich verändertwird 3. Zusätzlich zu ihren Rollen in wesentlichen zellulären Prozessen wie Transkription Regulierung, Protein-Haffinase, die Reaktion auf Zellstress und Chromatinumbau bei Mitose und Meiose; Inzwischen ist hinreichend klar geworden, dass SUMO, SUMO-modifizierte Proteine und SUMO-Pfadkomponenten auch als Biomarker für Pathologien wie Krebs und neurodegenerative Erkrankungen 4, 5,6 Potenzial haben. ,7. Dies unterstreicht die Notwendigkeit robuster, zuverlässiger und leicht verfügbarer Werkzeuge und innovativer Ansätze zur Erkennung und funktionellen Analyse von SUMO-modifizierten Proteinen in einer Vielzahl von Zellen und Proben.
In vielen Systemen sind SUMO-spezifische Antikörper die Reagenzien der Wahl für die Erkennung, Isolierung und funktionelle Analyse von SUMO-modifizierten Proteinen 8,9. Einige kommerziell erhältliche SUMO-spezifische Antikörper sind jedoch teuer, in der Menge oder Verfügbarkeit begrenzt, neigen dazu, völlig variable Affinitäten und Querreaktivität zu zeigen, und in einigen Fällen fehlt esan Reproduzierbarkeit 10. Ein alternativer Ansatz ist der Ausdruck von epitop getaggten SUMO in transformierten Zellen und Organismen, aber die Verknüpfung von Eitop-Tags mit SUMOkannseine Konjugation mit Proteinzielen 11 künstlich verringern. Außerdem sind Epitope nicht sinnvoll, wenn unveränderte Zellen oder Gewebe ausgewertet werden.
Ulp1 ist eine konservierte SUMO-Protease von S. cerevisiae , die sowohl den SUMO-Vorläufer als auch die Desumoylate von SUMO-konjugierten Proteinen 12 verarbeitet. Auf der Grundlage der serviösen Beobachtung, dass eine Mutation des katalytischen Cysteine (C580S) in der SUMO-Verarbeitung von Ulp1 nicht nur die SUMO-Kalkung verhindert, sondern auch SUMO-konjugierte Proteine mit hohem Avidität12. Aus Gründen der Einfachheit haben wir dieses Carbox-Terminal SUMO-Fallen Ulp1-C580S) als UTAG (kurz für UD TAG) bezeichnet. Die UTAG ist ein rekombinantes Pan-SUMO-Fangrettiein, das eine nützliche Alternative zu Anti-SUMO-Antikörpern darstellt, die zur Isolierung und Erkennung von SUMO-modifizierten Proteinen verwendet werden. Wichtig ist, dass es speziell einnehmend gefaltete, konjugierte SUMO erkennt und nicht nur ein oder mehrere Epitope auf SUMO. Um sowohl die Proteinstabilität als auch die SUKO-Bindungsfestigkeit der UTAG zu verbessern, haben wir aus der stresstoleranten Hefe Kluyveromyces marxianus (Km) eine Variante der UTAG entwickelt. KmUTAG bindet SUMO-konjugate eng mit Nanomolaraffinität13. Darüber hinaus ist kmUTAG gegen erhöhte Temperaturen (42 ° C) beständig, Reduktion von Wirkstoffen (5 mM TCEP-Tris-2-Carboxyethyl) Phosphin-Hydrochlorid), Denaturanten (bis zu 2 M Urea), Oxidationsmittel (0,6% Wasserstoffperoxid) und nicht-ionische Reinigungsmittel. Diese Stresstoleranz ist bei rauen Reinigungsbedingungen und längeren Inkubationszeiten vorteilhaft, um ihre Stabilität und SUMO-Fangtätigkeit zu gewährleisten. Es überrascht jedoch nicht, dass die SUMO-Fanging-Aktivität von KmUTAG mit zysteinmodifizierenden Reagenzien, ionischen Reinigungsmitteln und vollständig denaturierten Proteinextrakten unvereinbar ist. Die bemerkenswerte Affinität und Eigenschaften der KmUTAG deuten darauf hin, dass dieses Reagenz zum Standard-Repertoire für die Erforschung von sumoylierten Proteinen in mehreren Arten werden kann.
Hier bieten wir eine einfache Methode an, um SUMO-modifizierte Proteine in Säugetierzellen und Nematoden mit einem rekombinanten Fluoreszenz-MCherry-KmUTAG-Fusionsprotein (kmUTAG-fl) zu erkennen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Well Cell Culture Plates</td>
			<td>Genesee Scientific/Olympus Plastics</td>
			<td>25-105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-545-003</td>
			<td>Used as a secondary antibody for mouse monoclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Gibco 14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dylight 488 conjugated AffiniPure Goat Anti-Moue IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-485-146</td>
			<td>Used as a secondary antibody for mouse monoclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Coverglass for Growth Cover Glasses</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12545101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLUORO-GEL II with DAPI</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>50-246-93)</td>
			<td>Mounting media in step 1.11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLUORO-GEL with DABCO</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>17985-02</td>
			<td>With DAPI added to 1 &#181;g/mL; mounting media in step 2.2.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine-HCl</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP3815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine-HCl</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>6000-43-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KmUTAG-fl</td>
			<td>Kerafast</td>
			<td></td>
			<td>KmUTAG reagents are available on Kerafast.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oneblock Western-CL blocking buffer</td>
			<td>Prometheus</td>
			<td>20-313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, Phosphate Buffered Saline, 10X Solution</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP3994</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNT2 cell line</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>95012613</td>
			<td>Normal prostate epithelium immortalized with SV40.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSPOT1</td>
			<td>(ChromoTek GmbH)</td>
			<td>ev-1</td>
			<td>https://www.chromotek.com/fileadmin/user_upload/pdfs/Datasheets/pSpot1_v1.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUMO 6F2</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>SUMO 6F2</td>
			<td>SUMO 6F2 was deposited to the DSHB by Pelisch, F. / Hay, R.T. (DSHB Hybridoma Product SUMO 6F2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUMO protease buffer [10x]</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>500 mM Tris-HCl, pH 8.0, 2% NP-40, 1.5 M NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUMO-2 Antibody 8A2</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>SUMO-2 8A2</td>
			<td>SUMO-2 8A2 was deposited to the DSHB by Matunis, M. (DSHB Hybridoma Product SUMO-2 8A2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP-HCL</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>51805-45-9</td>
			<td>Used as a reducing agent at a concentration of 5mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>Used for permeablization at 0.1% in DPBS/PBS(for worms)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

localization of sumo-modified proteins using fluorescent sumo-trapping proteins

Hier stellen wir eine neuartige Methode vor, um die Sumoylierung von Proteinen und ihre subzelluläre Lokalisierung in Säugetierzellen und Nematoden-Eizellen zu untersuchen. Bei dieser Methode wird ein rekombinant modifiziertes SUMO-Fangscheiben-Protein-Fragment, kmUTAG, verwendet, abgeleitet von der Ulp1 SUMO Protease der stresstoleranten angehenden Hefe Kluyveromyces marxianus. Wir haben die Eigenschaften der kmUTAG angepasst, um Sumoylierung in einer Vielzahl von Modellsystemen ohne Antikörper zu studieren. Für die Studie von SUMO hat die KmUTAG im Vergleich zu Antikörper-basierten Ansätzen mehrere Vorteile. Dieses stresstolerante SUMO-Fallreagenz wird rekombinant produziert, es erkennt einheimische SUMO-Isoformen von vielen Arten, und im Gegensatz zu kommerziell erhältlichen Antikörpern zeigt es eine reduzierte Affinität für freie, unkonjugierte SUMO. Zu den repräsentativen Ergebnissen, die hier gezeigt werden, gehören die Lokalisierung von SUMO-Konjugaten in Säugegewebekulturzellen und Nematoden-Oozyten.

KmUTAG-fl ist ein rekombinantes, mCherry-getagtes SUMO-Fangning-Protein. Um kmUTAG-fl zu produzieren, haben wir eine mit Kabeljau optimierte mCherry-kmUTAG in das bakterielle Überexpression Plasmid pSPOT1 geklont (Abbildung1). Nach der Obduktion wurde das kmUTAG-Fl-Protein auf Spot-TRAP gereinigt, entleert und bis auf weiteres eingefroren. Um die SUMO-Fangtätigkeit von KmUTAG-fl zu gewährleisten, haben wir die Bindung an SUMO1-konjugierte Perlen und den Ni...

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Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

SUMO ist ein essentielles und hoch konserviertes, kleines, ubiquitin-ähnliches Modifikatorprotein. In diesem Protokoll beschreiben wir die Verwendung eines stresstoleranten rekombinanten, rekombinanten SUMO-Fantifen-Proteins (kmUTAG) zur Visualisierung von nativen, nicht markierten SUMO-Konjugaten und deren Lokalisierung in einer Vielzahl von Zelltypen.

Lokalisierung von SUMO-modifizierten Proteinen mit fluoreszierenden Sumo-Fallen Proteinen

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...

Die Bedeutung dieses Protokolls ist die Verwendung eines neuartigen fluoreszierenden SUMO-trapping UTAG-Proteins zum Nachweis des Proteinmodifizierers SUMO in verschiedenen eukaryotischen Zellen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist ein einfaches Protokoll für den antikörperfreien Nachweis von SUMO in einer Vielzahl von Zellen, einschließlich Säugetiergewebekultur und Nematodengonden. SUMO spielt eine wichtige Rolle bei Krebs und neurodegenerativen Erkrankungen, was die Notwendigkeit robuster und zuverlässiger Instrumente für die Detektion und funktionelle Analyse von SUMO-modifizierten Proteinen unterstreicht.Da SUMO hochkonserviert ist, kann das fluoreszierende SUMO-trapping UTAG-Protein verwendet werden, um konjugierte SUMO in vielen verschiedenen Organismen zu kennzeichnen. Dieses Video zeigt seine Verwendung in Säugetierzellen. Darüber hinaus beschreibt der Volltext seine Verwendung in nematoden Oozyten.Die visuelle Demonstration dieser Technik liefert kritische Hinweise für die Behandlung von Zellen vor der Färbung und SUMO-Erkennung. Zunächst können Gewebekulturzellen der Wahl auf 22-Millimeter-Rundabdeckungen in sechs bohren DEN TC-Platten bis zu 70 bis 80 % konfluent wachsen. Waschen Sie die Zellen kurz mit einem Milliliter DPBS.Um die Zellen zu fixieren, fügen Sie jedem Brunnen zwei Milliliter frische 4%PFA und DPBS hinzu. Inkubieren Sie die Zellen für 20 Minuten bei Raumtemperatur. Waschen Sie die festen Zellen dreimal für fünf Minuten in einem Milliliter DPBS, während Sie die Platte verneinen.Um die Zellen zu permeabilisieren, inkubieren Sie für 15 Minuten mit 1%Triton X-100 in DPBS. Waschen Sie die Zellen wieder, wie zuvor. Inkubieren Sie die Zellen mit 500 Mikrolitern von 1 Molarglycin HCL pH 2 für 10 Sekunden.Dann neutralisieren Sie den pH-Wert sofort mit 500 Mikroliter n10 SUMO Protease Puffer, oder SPB. Nach dem Waschen der Zellen wie zuvor, entfernen Sie die Abdeckung rutscht aus dem Brunnen und legen Sie sie in eine Feuchtigkeitskammer. Nur für UTAG-FL-Färbungeininformationen ein Mikrogramm UTAG-FL mit 100 Mikrolitern 1X SPB mit fünf Millimolaren TCEP in einem Rohr mischen.Dann pipette die Mischung auf die Zellen auf der Abdeckung rutschen und inkubieren bei Raumtemperatur für eine Stunde in der Feuchtigkeitskammer. Um die Abdeckung saugen rutscht, Pipette 200 Mikroliter DPBS auf jeder Abdeckung rutschen und lassen An Ort und Stelle für 10 Minuten. Wiederholen Sie die Wäsche zwei weitere Male.Entfernen Sie die Deckelscheine von der letzten Wäsche und kehren Sie auf einen vorgereinigten Mikroskopieschlitten mit einem Tropfen Montagemedium um. Lagern Sie die Proben über Nacht in einem 20 Grad Celsius Gefrierschrank, bevor Sie unter dem Mikroskop betrachten. Visualisieren Sie die Zellen mithilfe der entsprechenden Filtersätze für DAPI und Texas Red.Bitte lesen Sie den vollständigen Text für ein Protokoll, wie Man SUMO und feste Nematoden-Gonaden beschriften kann. Während die Kennzeichnung von Säugetierzellen ziemlich einfach ist, erfordert die Etikettierung von Nematodenoozyten eine vorherige Ausbildung in Gonadensektionen. KmUTAG-FL inkubiert mit festen PMT2-Zellen zeigte eine deutliche nukleare Färbung.Sowohl diffuse nukleare Färbung als auch ausgeprägte Kernbrennpunkte waren sichtbar. Die kerntechnische Lokalisierung wurde durch Co-Färbung mit DAPI bestätigt. In Übereinstimmung mit der SUMO-Fangaktivität von KmUTAG-FL erinnerte das nukleare Lokalisierungsmuster an die SUMO23-Färbung.Die Co-Färbung mit Anti-SUMO23 8A2 Antikörpern bestätigte die Kolokalisierung von KmUTAG-FL mit dem SUMO23-Signal. Dies bestätigt die Wirksamkeit von KmUTAG-FL zum Nachweis von SUMO23 in Säugetierzellen. Isolierte Gonaden aus eizellenproduzierenden Erwachsenenhermaphrodit c.Elegans Nematoden wurden mit Anti-SUMO-Antikörpern gekennzeichnet. In Übereinstimmung mit früheren Berichten lokalisierte Sichten antikörperzunächst das Kernplasma der späten myotischen Prophase-Oozyten. Es verteilte sich dann auf den zentralen Ringkomplex der gepaarten Homologe, als die Kernhülle zusammenbrach und die Chromosomen auf die Metaphasenplatte zusteuerten.In parallelen Präparaten zeigten Mit KmUTAG-FL beschriftete Gonaden ähnliche Muster. KmUTAG-FL verlagerte sich von der Kennzeichnung des Nukleoplasmas hin zur Konzentration auf den Ringkomplex, als Eizellen begannen und den Prozess des Nuklearen Hüllenabbaus abschlossen. Diese Ergebnisse bestätigen KmUTAG-FL als nützliches Werkzeug für die Analyse von Myose- und SUMO-bezogenen Prozessen in c.Elegans und möglicherweise andere Nematoden. Bei der Fixierung ist es wichtig, frisches Paraformaldehyd und eine kurze Fixierungszeit zu verwenden, um SUMO nativ gefaltet zu halten, so dass es von der KmUTAG erkannt werden kann. Da die tertiäre Struktur von SUMO sehr konserviert ist, ist es sehr wahrscheinlich, dass SUMO-Varianten aus zusätzlichen Modell- und Nicht-Modellsystemen mit dem KmUTAG-FL-Reagenz analysiert werden können.Derzeit verwenden wir dieses neuartige fluoreszierende SUMO-Trapping-UTAG-Protein, um die Funktion von SUMO während zellulären Stresses zu untersuchen. Bitte beachten Sie abschließend, dass alle Schritte mit dem fixativen Paraformaldehyd in einer Sicherheitshaube des Labors durchgeführt werden müssen und dieses Reagenz ordnungsgemäß entsorgt werden muss.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identification of Plant Ice-binding Proteins Through Assessment of Ice-recrystallization Inhibition and Isolation Using Ice-affinity Purification

Identifizierung von Pflanzenproteinen durch die Bewertung der Eis-Rekristallisation Hemmung und Isolation Mit Ice-Affinitätsreinigung Ice-Bindung

Ice-binding proteins (IBPs) belong to a family of stress-induced proteins that are synthesized by certain organisms exposed to subzero temperatures. In ...

Forschung

Biochemie

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.

Waschmittel-freie ultraschnelle Rekonstitution von Membranproteinen in Lipid Bilayer mit Fusogenic ergänzende Rechnung Proteoliposomes.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers ...

Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

Erkennung von Waschmittel-Sensitive Interaktionen zwischen Membranproteine

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

How to Quantify the Fraction of Photoactivated Fluorescent Proteins in Bulk and in Live Cells

Wie den Anteil der photoaktiviert fluoreszierende Proteine in großen Mengen und in lebenden Zellen zu quantifizieren

Photoactivatable and -convertible fluorescent proteins (PA-FPs) have been used in fluorescence live-cell microscopy for analyzing the dynamics of cells ...

Fluorescent Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels

Fluoreszierende silberne Färbung von Proteinen im Polyacrylamid-Gele

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide ...

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

Einsatz von rekombinanten Fusionsproteinen in eine fluoreszierende Protease-Assay-Plattform und ihre In-Gel-Renaturierung

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...

Characterizing Cellular Proteins with In-cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins

Charakterisierung zellulärer Proteine mit in-zelliger schneller photochemischer Oxidation von Proteinen

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting method used to characterize protein structure and interactions. ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Querschnitt von reifem Reis (Oryza sativa L.) Kerne für die Rasterelektronenmikroskopie-Bildgebung mit Pipettenspitzen als Immobilisierungsunterstützung

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Optimized Incorporation of Alkynyl Fatty Acid Analogs for the Detection of Fatty Acylated Proteins using Click Chemistry

Optimierter Einbau von Alkynyl-Fettsäure-Analoga zum Nachweis von fettacylierten Proteinen mittels Klickchemie

Fatty acylation, the covalent addition of saturated fatty acids to protein substrates, is important in regulating a myriad of cellular functions in ...

Production of Recombinant PRMT Proteins using the Baculovirus Expression Vector System

Herstellung rekombinanter PRMT-Proteine unter Verwendung des Baculovirus Expression Vector System

Protein arginine methyltransferases (PRMTs) methylate arginine residues on a wide variety of proteins that play roles in numerous cellular processes. ...