Name: localization of sumo-modified proteins using fluorescent sumo-trapping proteins
Uploaded: 2019-04-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins at JoVE.com

אנו רוצים להודות לכל חברי מעבדת קרשר על תמיכתם, נטלי נגוין לקריאה קריטית של כתב היד, ו Lidia Epp לרצף. עבודה זו נתמכת על ידי קרן המיסחור מחקר של חבר העמים MF16-034-LS כדי OK. הסיוע במחקר לתלמידי W & M סופק על ידי קרן ביילי-יוסטון למחקר, ושארל סנטר כבוד מלגות ל-RY ו-CH.

1. איתור סומו בתאי תרבות קבועה ברקמה באמצעות רקומביננטי KmUTAG-FL חלבון השמנה להשמנה
<ol><li>הגדל תאים התרבות הרקמה של בחירה על 22 מילימטר עגול לכסות מחליק 6-היטב לוחות TC עד 70% – 80% confluent. בצע את שלבים 1.2 – 1.8 בצלחת 6-באר.</li>
	<li>לשטוף את התאים בקצרה עם 1 מ ל של DPBS (מלוחים פוספט באגירה של דולבקו)</li>
	<li>עבור ק...

<ol>
	<li>Kerscher, O., Felberbaum, R., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+proteins+by+ubiquitin+and+ubiquitin-like+proteins.">Modification of proteins by ubiquitin and ubiquitin-like proteins.</a> Cell and Developmental Biology. 22, 159-180 (2006).</li><li>Kerscher, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> SUMOylation. , 1-11 (2016).</li><li>Hay, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO:+a+history+of+modification.">SUMO: a history of modification.</a> Molecular Cell. 18 (1), 1-12 (2005).</li><li>Fu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+SUMO-specific+protease+2+induces+mitochondria+mediated+neurodegeneration.">Disruption of SUMO-specific protease 2 induces mitochondria mediated neurodegeneration.</a> PLoS Genetics. 10 (10), e1004579-e1004579 (2014).</li><li>Zhang, H., Kuai, X., Ji, Z., Li, Z., Shi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Over-expression+of+small+ubiquitin-related+modifier-1+and+sumoylated+p53+in+colon+cancer.">Over-expression of small ubiquitin-related modifier-1 and sumoylated p53 in colon cancer.</a> Cell biochemistry and biophysics. 67 (3), 1081-1087 (2013).</li><li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO-specific+protease+1+promotes+prostate+cancer+progression+and+metastasis.">SUMO-specific protease 1 promotes prostate cancer progression and metastasis.</a> Oncogene. 32 (19), 2493-2498 (2013).</li><li>Karami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+SUMO-Protease+SENP7S+Regulates+&#946;-catenin+Signaling+and+Mammary+Epithelial+Cell+Transformation.">Novel SUMO-Protease SENP7S Regulates &#946;-catenin Signaling and Mammary Epithelial Cell Transformation.</a> Scientific Reports. 7 (1), 46477 (2017).</li><li>Pelisch, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+SUMO-Dependent+Protein+Network+Regulates+Chromosome+Congression+during+Oocyte+Meiosis.">A SUMO-Dependent Protein Network Regulates Chromosome Congression during Oocyte Meiosis.</a> Molecular Cell. 65 (1), 66-77 (2017).</li><li>Zhang, X. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO-2/3+modification+and+binding+regulate+the+association+of+CENP-E+with+kinetochores+and+progression+through+mitosis.">SUMO-2/3 modification and binding regulate the association of CENP-E with kinetochores and progression through mitosis.</a> Molecular Cell. 29 (6), 729-741 (2008).</li><li>Baker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducibility+crisis:+Blame+it+on+the+antibodies.">Reproducibility crisis: Blame it on the antibodies.</a> Nature News. 521 (7552), 274-276 (2015).</li><li>Wang, Z., Prelich, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quality+control+of+a+transcriptional+regulator+by+SUMO-targeted+degradation.">Quality control of a transcriptional regulator by SUMO-targeted degradation.</a> Molecular and Cellular Biology. 29 (7), 1694-1706 (2009).</li><li>Li, S. J., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+protease+required+for+cell-cycle+progression+in+yeast.">A new protease required for cell-cycle progression in yeast.</a> Nature. 398 (6724), 246-251 (1999).</li><li>Peek, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO+targeting+of+a+stress-tolerant+Ulp1+SUMO+protease.">SUMO targeting of a stress-tolerant Ulp1 SUMO protease.</a> PLoS ONE. 13 (1), e0191391 (2018).</li><li>Edgar, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+13+Blastomere+Culture+and+Analysis.">Chapter 13 Blastomere Culture and Analysis.</a> Methods in Cell Biology. 48, 303-321 (1995).</li><li>Pelisch, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+SUMO+modification+regulates+mitotic+chromosome+assembly+and+cell+cycle+progression+in+Caenorhabditis+elegans.">Dynamic SUMO modification regulates mitotic chromosome assembly and cell cycle progression in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Communications. 5 (1), 769 (2014).</li><li>Dillingham, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+single-stranded+DNA+binding+protein+as+a+probe+for+sensitive,+real-time+assays+of+helicase+activity.">Fluorescent single-stranded DNA binding protein as a probe for sensitive, real-time assays of helicase activity.</a> Biophysical Journal. 95 (7), 3330-3339 (2008).</li><li>Ruckman, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2'-Fluoropyrimidine+RNA-based+aptamers+to+the+165-amino+acid+form+of+vascular+endothelial+growth+factor+(VEGF165).+Inhibition+of+receptor+binding+and+VEGF-induced+vascular+permeability+through+interactions+requiring+the+exon+7-encoded+domain.">2'-Fluoropyrimidine RNA-based aptamers to the 165-amino acid form of vascular endothelial growth factor (VEGF165). Inhibition of receptor binding and VEGF-induced vascular permeability through interactions requiring the exon 7-encoded domain.</a> The Journal of Biological Chemistry. 273 (32), 20556-20567 (1998).</li><li>Hughes, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+specific+inhibitors+of+SUMO-1-+and+SUMO-2/3-mediated+protein-protein+interactions+using+Affimer+(Adhiron)+technology.">Generation of specific inhibitors of SUMO-1- and SUMO-2/3-mediated protein-protein interactions using Affimer (Adhiron) technology.</a> Science Signaling. 10 (505), eaaj2005 (2017).</li><li>Lopata, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affimer+proteins+for+F-actin:+novel+affinity+reagents+that+label+F-actin+in+live+and+fixed+cells.">Affimer proteins for F-actin: novel affinity reagents that label F-actin in live and fixed cells.</a> Scientific Reports. 8 (1), 6572 (2018).</li><li>Gilbreth, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoform-specific+monobody+inhibitors+of+small+ubiquitin-related+modifiers+engineered+using+structure-guided+library+design.">Isoform-specific monobody inhibitors of small ubiquitin-related modifiers engineered using structure-guided library design.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (19), 7751-7756 (2011).</li><li>Berndt, A., Wilkinson, K. A., Heimann, M. J., Bishop, P., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+characterization+of+the+properties+of+SUMO1-specific+monobodies.">In vivo characterization of the properties of SUMO1-specific monobodies.</a> Biochemical Journal. 456 (3), 385-395 (2013).</li></ol>

כאן אנו מציגים את השימוש של kmutag-fl, חלבון רקומביננטי, למחקרים פונקציונליים של סומו בתאי יונקים קבועים ובעל בלוטות המין נמטודות. KmUTAG-fl הוא מאוד עמידים ללחץ הפאן-סומו מגיב ספציפי מזהה ומלכודות מקורי סומו מצועם ושרשראות סומו. מאז המבנה השלישוני של סומו הוא שימור מאוד זה סביר מאוד כי משתנים סומ?...

מטרת שיטה זו היא להקל על המחקר והניתוח של חלבונים סומו מצובגים באמצעות רקומביננטי הסומו השמנה UTAG (Ulp בתחום תג) חלבון. כפי שמפורט להלן, UTAG ניתן להשתמש במקום של ריאגנטים אחרים וגישות לטהר, לזהות, ולדמיין חלבונים ששונו סומו. בהתאם לתנאי הגדילה, תאים עשויים להכיל מאות או אלפי חלבונים שהשתנו עם שרשראות סומו או סומו (לסקירה ראה קרשר ואח ' 20061 ו kerscher 20162). זה מייצג קושי ניכר עבור ניתוחים פונקציונליים של חלבונים ספציפיים ששונו הסומו, במיוחד מאז רק חלק של היעד מסוים sumoylation שונה למעשה3. בנוסף לתפקידם בתהליכים סלולאריים חיוניים כגון רגולציה, הומאוסטזיס חלבון, התגובה למתח הסלולר, ושיפוץ כרומטין במהלך מיטוזיס ומיוזיס; עכשיו זה הופך מספיק ברור כי סומו, סומו שונה חלבונים, ורכיבים מסלול סומו יש גם פוטנציאל של ביואריקרס לפתווגיות כגון סרטן והפרעות ניווניות4,5,6 ,7. זה מדגיש את הצורך חזק, אמין, כלים זמינים וגישות חדשניות עבור זיהוי וניתוח פונקציונלי של חלבונים ששונו סומו במגוון של תאים ודגימות.
במערכות רבות, נוגדנים ספציפיים סומו הם ריאגנטים של בחירה עבור איתור, בידוד וניתוחים פונקציונליים של חלבונים ששונו סומו8,9. עם זאת, כמה נוגדנים מסחריים ספציפיים סומו מסוימים הם יקרים, מוגבל בכמות או זמינות, נוטה להציג משתנה בפראות משתנים ופעילות צולבת, ובמקרים מסוימים חוסר התוכנות10. גישה חלופית אחת היא הביטוי של אפירופה-מתויג סומו בתאים ואורגניזמים שעברו שינוי, אך הקישור תגי אפירופה לסומו עשוי באופן מלאכותי להקטין את הקוניוגציה למטרות חלבונים11. בנוסף, האפיסקופים אינם שימושיים כאשר מוערכים תאים או רקמות שאינם משתנים.
Ulp1 הוא פרוטאז סומו שימור מ -S. cerevisiae ס כי שני התהליכים הקודמן סומו ו desumoylates סומו מצווים חלבונים12. פיתחנו את מגיב UTAG מבוסס על התבוננות קרי כי מוטציה של ציסטיין קטליטי (C580S) ב Ulp1's הסומו עיבוד Ulp domain (עוד) לא רק מונע מחשוף סומו אלא גם מלכודות סומו-מצועם חלבונים עם גבוה ובכן12. למען הפשטות, התייחסנו לUlp1 האלה להשמנה של סומו מסופים, בדומה ל-UTAG (קיצור של UD TAG). UTAG הוא חלבון רקומביננטי פאן-סומו השמנה המייצגת חלופה שימושית לנוגדנים אנטי סומו המשמשים לבידוד ואיתור של חלבונים ששונו סומו. וחשוב מכך, הוא מזהה באופן מקורי-מקופל, סומו מצופלת ולא רק אפיסקופים אחד או מספר על סומו. כדי לשפר הן את יציבות החלבון ואת חוזק כריכת סומו של UTAG, יצרנו גרסה של UTAG מן הלחץ עמידים שמרים Kluyveromyces marxianus (ק מ). KmUTAG נקשר בחוזקה סומו-מבצוערים עם זיקה nanomolar13. בנוסף, kmUTAG עמיד בטמפרטורות גבוהות (42 ° c), הפחתת סוכנים (5 מ"מ TCEP-טריס (2-carboxyethyl) פוספלין הידרוכללוריד), denaturants (עד 2 שתנן), סוכני אוקסיגון (0.6% תחמוצת מימן), וחומרי ניקוי לא יוניים. סובלנות זו מועילה במהלך מצב טיהור קשה וזמני דגירה ממושכים, ומבטיחים את היציבות ופעילות ההשמנה של הסומו. לא באופן מפתיע, עם זאת, הפעילות לכידת סומו של KmUTAG אינו תואם את cysteine שינוי ריאגנטים, חומרי ניקוי יוניים ותמציות חלבון מלאה. האהדה והתכונות היוצאות מהכלל של KmUTAG מעידות על כך שניתן להפוך את הדבר לחלק מהרפרטואר הסטנדרטי לחקר חלבונים מסוחיים במינים מרובים.
כאן אנו מספקים שיטה פשוטה כדי לזהות חלבונים ששונו הסומו בתאי היונקים והנטודות באמצעות רקומביננטי פלורסנט mCherry-KmUTAG פיוז'ן חלבון (kmUTAG-fl).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Well Cell Culture Plates</td>
			<td>Genesee Scientific/Olympus Plastics</td>
			<td>25-105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-545-003</td>
			<td>Used as a secondary antibody for mouse monoclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Gibco 14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dylight 488 conjugated AffiniPure Goat Anti-Moue IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-485-146</td>
			<td>Used as a secondary antibody for mouse monoclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Coverglass for Growth Cover Glasses</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12545101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLUORO-GEL II with DAPI</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>50-246-93)</td>
			<td>Mounting media in step 1.11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLUORO-GEL with DABCO</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>17985-02</td>
			<td>With DAPI added to 1 &#181;g/mL; mounting media in step 2.2.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine-HCl</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP3815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine-HCl</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>6000-43-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KmUTAG-fl</td>
			<td>Kerafast</td>
			<td></td>
			<td>KmUTAG reagents are available on Kerafast.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oneblock Western-CL blocking buffer</td>
			<td>Prometheus</td>
			<td>20-313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, Phosphate Buffered Saline, 10X Solution</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP3994</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNT2 cell line</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>95012613</td>
			<td>Normal prostate epithelium immortalized with SV40.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSPOT1</td>
			<td>(ChromoTek GmbH)</td>
			<td>ev-1</td>
			<td>https://www.chromotek.com/fileadmin/user_upload/pdfs/Datasheets/pSpot1_v1.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUMO 6F2</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>SUMO 6F2</td>
			<td>SUMO 6F2 was deposited to the DSHB by Pelisch, F. / Hay, R.T. (DSHB Hybridoma Product SUMO 6F2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUMO protease buffer [10x]</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>500 mM Tris-HCl, pH 8.0, 2% NP-40, 1.5 M NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUMO-2 Antibody 8A2</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>SUMO-2 8A2</td>
			<td>SUMO-2 8A2 was deposited to the DSHB by Matunis, M. (DSHB Hybridoma Product SUMO-2 8A2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP-HCL</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>51805-45-9</td>
			<td>Used as a reducing agent at a concentration of 5mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>Used for permeablization at 0.1% in DPBS/PBS(for worms)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

localization of sumo-modified proteins using fluorescent sumo-trapping proteins

כאן אנו מציגים שיטה מקורית לחקר הסורחון של חלבונים ולוקליזציה התת-תאית שלהם בתאי היונקים והנוציטים. שיטה זו מנצלת רקומביננטי שונה חלבון השמנה משבר, kmUTAG, נגזר פרוטאז Ulp1 סומו של הלחץ עמידים שמרים הmarxianus. התאמתי את המאפיינים של kmUTAG למטרת לימוד סומולציה במגוון מערכות מודל ללא שימוש בנוגדנים. למחקר של סומו, KmUTAG יש כמה יתרונות כאשר לעומת הגישות מבוססות נוגדן. זה מאוד עמידים להשמנה סומו השמנה מופק recombinantly, הוא מזהה איזופורמים מקורי של מינים רבים, ובניגוד נוגדנים זמין מסחרית זה מראה זיקה מופחתת עבור סומו בחינם, מצומת. תוצאות הנציגה המוצגות כאן כוללות לוקליזציה של שערי מעלה סומו בתאי תרבות של רקמת היונקים ו נמטודות אוציטים.

KmUTAG-fl הוא רקומביננטי, החלבון מתויג להשמנה סומו. כדי לייצר kmUTAG-fl, שירמנו מיטוב codon ממוטבת-kmUTAG לתוך הpSPOT1 בקטריאלי בקטריות ביטואמצע (איור 1). לאחר האינדוקציה, החלבון kmUTAG-fl היה מטוהר במלכודת ספוט, שהוקפא והוקפא עד לשימוש נוסף. כדי להבטיח את הפעילות לכידת סומו של K...

Watch this Scientific Journal Video about Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins at JoVE.com

Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

סומו הוא הכרחי ושמרו במידה רבה, חלבון שימור קטן כמו הצירוף. בפרוטוקול זה אנו מתארים את השימוש רקומביננטי העמידות בפני סומו חלבון השמנה להשמנה (kmUTAG) כדי להמחיש מקורי, שערי סומו לא מתויגים ולוקליזציה שלהם במגוון סוגי תאים.

לוקליזציה של חלבונים ששונו באמצעות סומו פלורסנט-השמנה חלבונים

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...

המשמעות של פרוטוקול זה היא השימוש בחלבון UTAG פלואורסצנטי חדשני לוכדת SUMO לגילוי של מכפיל החלבון SUMO בתאים אוקריוטיים שונים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא פרוטוקול פשוט לגילוי ללא נוגדנים של SUMO במגוון תאים, כולל תרבות רקמת יונקים וגונדס נמטודה. SUMO ממלא תפקידים חשובים בסרטן ובהפרעות ניווניות, וזה מדגיש את הצורך בכלים חזקים ואמינים לגילוי וניתוח תפקודי של חלבונים ששונו על ידי SUMO.מכיוון ש-SUMO שמור מאוד, ניתן להשתמש בחלבון UTAG לוכד הסומו הפלואורסצנטי כדי לסמן סומו נדוש באורגניזמים רבים ושונים. סרטון זה מדגים את השימוש בו בתאי יונקים. בנוסף, הטקסט המלא מתאר את השימוש בו בוציטים nematode.ההדגמה החזותית של טכניקה זו מספקת רמזים קריטיים לטיפול בתאים לפני הכתמות וזיהוי SUMO. כדי להתחיל, לגדל תאים תרבות רקמות של בחירה על 22 מילימטר עגול כיסוי מחליק שש בארות TC צלחות עד 70 עד 80% confluent. לשטוף את התאים לזמן קצר עם מיליליטר אחד של DPBS.כדי לתקן את התאים, הוסף שני מיליליטר של 4%PFA ו- DPBS טריים לכל באר. דגירה התאים במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף את התאים הקבועים שלוש פעמים במשך חמש דקות במיליליטר אחד של DPBS תוך כדי אגוזים את הצלחת.כדי לחלחל לתאים, דגירה במשך 15 דקות עם 1%Triton X-100 ב- DPBS. לשטוף את התאים שוב, כמו קודם. הדגירה את התאים עם 500 microliters של 1 טוחן גליצין HCL pH 2 במשך 10 שניות.לאחר מכן לנטרל את ה- pH מיד עם 500 microliters של מאגר פרוטאז סומו 10X, או SPB. לאחר שטיפת התאים כמו קודם, להסיר את החלקות המכסה מן הטוב ולמקם אותם בתא לחות. עבור כתמי UTAG-FL בלבד, יש לערבב מיקרוגרם אחד של UTAG-FL עם 100 מיקרוליטרים של 1X SPB המכילים 5 מילימולרים TCEP בצינור.לאחר מכן, פיפטה לערבב על התאים על להחליק את הכיסוי דגירה בטמפרטורת החדר במשך שעה בתא הלחות. כדי לשטוף את החלקות הכיסוי, פיפטה 200 microliters של DPBS על כל להחליק כיסוי ולהשאיר במקום במשך 10 דקות. חזור על לשטוף פעמיים נוספות.הסר את החלקות המכסה מהכביסה האחרונה והתהפך על מגלשת מיקרוסקופיה מנוקה מראש עם טיפת מדיום הרכבה. לאחסן את הדגימות לילה במקפיא 20 מעלות צלזיוס לפני הצפייה מתחת למיקרוסקופ. הצג את התאים באופן חזותי באמצעות ערכות המסננים המתאימות עבור DAPI ו- Texas Red.נא עיין בטקסט המלא לקבלת פרוטוקול על אופן התיוג של SUMO וגונדו נמטודה קבוע. בעוד תיוג תאים יונקים הוא די פשוט, תיוג oocytes nematode דורש הכשרה מוקדמת ניתוחי גונד. KmUTAG-FL עם תאי PMT2 קבועים הראו כתמים גרעיניים ברורים.הן כתמים גרעיניים מפוזרים והן מוקדים גרעיניים ברורים נראו לעין. לוקליזציה גרעינית אושרה באמצעות כתם שותף עם DAPI. בהתאם לפעילות לכידת SUMO של KmUTAG-FL, דפוס לוקליזציה גרעינית היה מזכיר הכתמת SUMO23.כתמים שותפים בנוגדן נגד SUMO23 8A2 אישרו את ההתאמה של ה-KmUTAG-FL עם אות SUMO23. פעולה זו מאמתת את היעילות של KmUTAG-FL כדי לזהות SUMO23 בתאי יונקים. גונדות מבודדות מהרמפרודיט למבוגרים המייצרות בוציטים.נמטודות אלגנס סומנו בנוגדנים נגד סומו. בקנה אחד עם דיווחים קודמים, נוגדן נגד SUMO בתחילה מקומי לפלסמה הגרעינית של אוציטים פרופאזה מיוטי מאוחר. לאחר מכן הוא הופץ מחדש למתחם הטבעת המרכזי של ההומולוגים הזוגיים כאשר המעטפה הגרעינית התקלקלה והכרומוזומים נעו לכיוון צלחת המטה-פאזה.בהכנות מקבילות, גונאדים שכותרתו עם KmUTAG-FL חשפו דפוסים דומים. KmUTAG-FL עבר מתווית הגרעין להתרכז במתחם הטבעת כאשר oocytes החל והשלים את תהליך פירוק המעטפה הגרעינית. תוצאות אלה מאמתות KmUTAG-FL ככלי שימושי לניתוח של מיוזיס ותהליכים הקשורים SUMO ב- c.אלגנס ואולי נמטודות אחרות. בעת ביצוע קיבעון, זה קריטי להשתמש paraformaldehyde טרי זמן קיבוע קצר כדי לשמור על SUMO מקופל באופן מקורי, כך שהוא יכול להיות מוכר על ידי KmUTAG. מכיוון שהמבנה שליו של SUMO שמור מאוד, סביר מאוד כי גרסאות SUMO ממודלים נוספים ומערכות שאינן מודל ניתן לנתח עם ריאגנט KmUTAG-FL.נכון לעכשיו, אנו משתמשים בחלבון UTAG פלואורסצנטי חדשני זה כדי לחקור את הפונקציה של SUMO במהלך הלחץ התאי. לבסוף, שים לב כי כל השלבים באמצעות paraformaldehyde תיקון צריך להתבצע מכסה המנוע בטיחות במעבדה ואת זה reagent יש להיפטר כראוי.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identification of Plant Ice-binding Proteins Through Assessment of Ice-recrystallization Inhibition and Isolation Using Ice-affinity Purification

זיהוי של הצמח קרח מחייב חלבונים באמצעות הערכה של עיכוב קרח-recrystallization ובידוד באמצעות טיהור קרח-זיקה

Ice-binding proteins (IBPs) belong to a family of stress-induced proteins that are synthesized by certain organisms exposed to subzero temperatures. In ...

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.

ללא דטרגנט מרביים להתחדשות ומבנה של קרום חלבונים לתוך השומנים Bilayers באמצעות Fusogenic משלימים טעונה Proteoliposomes.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers ...

Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

זיהוי של דטרגנט רגיש אינטראקציות בין חלבונים ממברנה

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

How to Quantify the Fraction of Photoactivated Fluorescent Proteins in Bulk and in Live Cells

כיצד ניתן לכמת את השבר של Photoactivated פלורסנט חלבונים בכמות גדולה, תאים חיים

Photoactivatable and -convertible fluorescent proteins (PA-FPs) have been used in fluorescence live-cell microscopy for analyzing the dynamics of cells ...

Fluorescent Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels

צביעת כסף פלורסנט של חלבונים בג'לים לזיהוי

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide ...

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

השימוש פיוז'ן רקומביננטי חלבונים פלטפורמה Assay פרוטאז פלורסנט, Renaturation שלהם בג'ל

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...

Characterizing Cellular Proteins with In-cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins

אפיון חלבונים סלולריים עם החמצון בתוך תא מהיר לפוטוכימיקלים של חלבונים

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting method used to characterize protein structure and interactions. ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

חתך רוחבי של אורז בוגר (Oryza sativa L.) גרעינים לסריקת הדמיית מיקרוסקופיה אלקטרונית באמצעות טיפים פיפטה כתמיכה ללא תנועה

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Optimized Incorporation of Alkynyl Fatty Acid Analogs for the Detection of Fatty Acylated Proteins using Click Chemistry

שילוב ממוטב של אנלוגים לחומצת שומן אלקיניל לגילוי חלבונים אצטט שומניים באמצעות כימיה קליק

Fatty acylation, the covalent addition of saturated fatty acids to protein substrates, is important in regulating a myriad of cellular functions in ...

Production of Recombinant PRMT Proteins using the Baculovirus Expression Vector System

ייצור חלבוני PRMT רקומביננטיים באמצעות מערכת וקטור הביטוי של Baculovirus

Protein arginine methyltransferases (PRMTs) methylate arginine residues on a wide variety of proteins that play roles in numerous cellular processes. ...