Name: localization of sumo-modified proteins using fluorescent sumo-trapping proteins
Uploaded: 2019-04-27T15:00:00
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Vorremmo ringraziare tutti i membri del laboratorio Kerscher per il loro sostegno, Nathalie Nguyen per la lettura critica del manoscritto, e Lidia EPP per il sequenziamento. Questo lavoro è stato sostenuto dal fondo di commercializzazione del Commonwealth Research MF16-034-LS a OK. Il sostegno alla ricerca per gli studenti W & M è stato fornito dal fondo Bailey-Huston Research e dalle borse di studio di Charles Center Honors a RY e CH.

1. rilevazione di SUMO in cellule di coltura di tessuti fissi utilizzando proteina ricombinante KmUTAG-FL SUMO-trapping
<ol><li>Coltivare le cellule di coltura tissutale di scelta sui fogli di copertura rotonda di 22 mm in piastre TC a 6 pozzetti fino al 70% – 80% confluente. Eseguire i passaggi 1.2 – 1.8 nella piastra 6-well.</li>
	<li>Lavare brevemente le cellule con 1 mL di DPBS (soluzione salina tampone fosfato di Dulbecco)</li>
	<li>Per la fissazione, preparare una soluzione fresca di 4% paraformaldeide (PFA) ...

<ol>
	<li>Kerscher, O., Felberbaum, R., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+proteins+by+ubiquitin+and+ubiquitin-like+proteins.">Modification of proteins by ubiquitin and ubiquitin-like proteins.</a> Cell and Developmental Biology. 22, 159-180 (2006).</li><li>Kerscher, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> SUMOylation. , 1-11 (2016).</li><li>Hay, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO:+a+history+of+modification.">SUMO: a history of modification.</a> Molecular Cell. 18 (1), 1-12 (2005).</li><li>Fu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+SUMO-specific+protease+2+induces+mitochondria+mediated+neurodegeneration.">Disruption of SUMO-specific protease 2 induces mitochondria mediated neurodegeneration.</a> PLoS Genetics. 10 (10), e1004579-e1004579 (2014).</li><li>Zhang, H., Kuai, X., Ji, Z., Li, Z., Shi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Over-expression+of+small+ubiquitin-related+modifier-1+and+sumoylated+p53+in+colon+cancer.">Over-expression of small ubiquitin-related modifier-1 and sumoylated p53 in colon cancer.</a> Cell biochemistry and biophysics. 67 (3), 1081-1087 (2013).</li><li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO-specific+protease+1+promotes+prostate+cancer+progression+and+metastasis.">SUMO-specific protease 1 promotes prostate cancer progression and metastasis.</a> Oncogene. 32 (19), 2493-2498 (2013).</li><li>Karami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+SUMO-Protease+SENP7S+Regulates+&#946;-catenin+Signaling+and+Mammary+Epithelial+Cell+Transformation.">Novel SUMO-Protease SENP7S Regulates &#946;-catenin Signaling and Mammary Epithelial Cell Transformation.</a> Scientific Reports. 7 (1), 46477 (2017).</li><li>Pelisch, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+SUMO-Dependent+Protein+Network+Regulates+Chromosome+Congression+during+Oocyte+Meiosis.">A SUMO-Dependent Protein Network Regulates Chromosome Congression during Oocyte Meiosis.</a> Molecular Cell. 65 (1), 66-77 (2017).</li><li>Zhang, X. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO-2/3+modification+and+binding+regulate+the+association+of+CENP-E+with+kinetochores+and+progression+through+mitosis.">SUMO-2/3 modification and binding regulate the association of CENP-E with kinetochores and progression through mitosis.</a> Molecular Cell. 29 (6), 729-741 (2008).</li><li>Baker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducibility+crisis:+Blame+it+on+the+antibodies.">Reproducibility crisis: Blame it on the antibodies.</a> Nature News. 521 (7552), 274-276 (2015).</li><li>Wang, Z., Prelich, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quality+control+of+a+transcriptional+regulator+by+SUMO-targeted+degradation.">Quality control of a transcriptional regulator by SUMO-targeted degradation.</a> Molecular and Cellular Biology. 29 (7), 1694-1706 (2009).</li><li>Li, S. J., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+protease+required+for+cell-cycle+progression+in+yeast.">A new protease required for cell-cycle progression in yeast.</a> Nature. 398 (6724), 246-251 (1999).</li><li>Peek, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO+targeting+of+a+stress-tolerant+Ulp1+SUMO+protease.">SUMO targeting of a stress-tolerant Ulp1 SUMO protease.</a> PLoS ONE. 13 (1), e0191391 (2018).</li><li>Edgar, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+13+Blastomere+Culture+and+Analysis.">Chapter 13 Blastomere Culture and Analysis.</a> Methods in Cell Biology. 48, 303-321 (1995).</li><li>Pelisch, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+SUMO+modification+regulates+mitotic+chromosome+assembly+and+cell+cycle+progression+in+Caenorhabditis+elegans.">Dynamic SUMO modification regulates mitotic chromosome assembly and cell cycle progression in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Communications. 5 (1), 769 (2014).</li><li>Dillingham, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+single-stranded+DNA+binding+protein+as+a+probe+for+sensitive,+real-time+assays+of+helicase+activity.">Fluorescent single-stranded DNA binding protein as a probe for sensitive, real-time assays of helicase activity.</a> Biophysical Journal. 95 (7), 3330-3339 (2008).</li><li>Ruckman, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2'-Fluoropyrimidine+RNA-based+aptamers+to+the+165-amino+acid+form+of+vascular+endothelial+growth+factor+(VEGF165).+Inhibition+of+receptor+binding+and+VEGF-induced+vascular+permeability+through+interactions+requiring+the+exon+7-encoded+domain.">2'-Fluoropyrimidine RNA-based aptamers to the 165-amino acid form of vascular endothelial growth factor (VEGF165). Inhibition of receptor binding and VEGF-induced vascular permeability through interactions requiring the exon 7-encoded domain.</a> The Journal of Biological Chemistry. 273 (32), 20556-20567 (1998).</li><li>Hughes, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+specific+inhibitors+of+SUMO-1-+and+SUMO-2/3-mediated+protein-protein+interactions+using+Affimer+(Adhiron)+technology.">Generation of specific inhibitors of SUMO-1- and SUMO-2/3-mediated protein-protein interactions using Affimer (Adhiron) technology.</a> Science Signaling. 10 (505), eaaj2005 (2017).</li><li>Lopata, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affimer+proteins+for+F-actin:+novel+affinity+reagents+that+label+F-actin+in+live+and+fixed+cells.">Affimer proteins for F-actin: novel affinity reagents that label F-actin in live and fixed cells.</a> Scientific Reports. 8 (1), 6572 (2018).</li><li>Gilbreth, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoform-specific+monobody+inhibitors+of+small+ubiquitin-related+modifiers+engineered+using+structure-guided+library+design.">Isoform-specific monobody inhibitors of small ubiquitin-related modifiers engineered using structure-guided library design.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (19), 7751-7756 (2011).</li><li>Berndt, A., Wilkinson, K. A., Heimann, M. J., Bishop, P., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+characterization+of+the+properties+of+SUMO1-specific+monobodies.">In vivo characterization of the properties of SUMO1-specific monobodies.</a> Biochemical Journal. 456 (3), 385-395 (2013).</li></ol>

Qui introduciamo l'uso di kmUTAG-FL, una proteina ricombinante, per gli studi funzionali del SUMO in cellule di mammiferi fisse e delle gonadi nematode dissezionate. KmUTAG-FL è un reagente specifico Pan-SUMO a tolleranza di stress che riconosce e intrappola le proteine native del SUMO e le catene di SUMO. Poiché la struttura terziaria di SUMO è altamente conservata, è molto probabile che le varianti di SUMO di sistemi aggiuntivi e non modello possano essere analizzate con il reagente kmUTAG-FL. In quanto tale, KmUTA...

Lo scopo di questo metodo è quello di facilitare lo studio e l'analisi delle proteine coniugate con SUMO utilizzando la proteina ricombinante SUMO-trapping UTAG ( tagULP Domain). Come descritto di seguito, UTAG può essere utilizzato al posto di altri reagenti e approcci per purificare, rilevare e visualizzare le proteine di SUMO modificate. A seconda delle condizioni di crescita, le cellule possono contenere centinaia o migliaia di proteine che vengono modificate con le catene SUMO o SUMO (per la revisione vedere Kerscher et al. 20061 e kerscher 20162). Questo rappresenta una notevole difficoltà per le analisi funzionali di specifiche proteine SUMO-modificate, soprattutto perché solo una frazione di un particolare bersaglio di SUMOilazione è effettivamente modificato3. Oltre ai loro ruoli nei processi cellulari essenziali come la regolazione trascrizionale, l'omeostasi proteica, la risposta allo stress cellulare e il rimodellamento della cromatina durante la mitosi e la meiosi; Ora è diventato sufficientemente chiaro che il Sumo, le proteine modificate dal sumo e i componenti del pathway di Sumo hanno anche un potenziale come biomarcatori per patologie come il cancro e le patologie neurodegenerative4,5,6 ,7. Ciò sottolinea la necessità di strumenti robusti, affidabili e prontamente disponibili e di approcci innovativi per la rilevazione e l'analisi funzionale delle proteine di SUMO modificate in una varietà di cellule e campioni.
In molti sistemi, gli anticorpi specifici per Sumo sono i reagenti di scelta per le analisi di rilevazione, isolamento e funzionale delle proteine di Sumo-modificate8,9. Tuttavia, alcuni anticorpi specifici per SUMO disponibili in commercio sono costosi, limitati in quantità o disponibilità, inclini ad esporre affinità selvaggiamente variabili e cross-reattività, e in alcuni casi mancano riproducibilità10. Un approccio alternativo è l'espressione di SUMO con tag epitopo in cellule e organismi trasformati, ma il collegamento di tag epitopi a SUMO può ridurre artificialmente la sua coniugazione agli obiettivi proteici11. Inoltre, gli epitopi non sono utili quando vengono valutate cellule o tessuti non trasformati.
Ulp1 è una proteasi di SUMO conservata da S. cerevisiae che entrambi elabora il precursore di sumo e desumoylates proteine coniugate con Sumo12. Abbiamo sviluppato il reagente UTAG in base all'osservazione serendipitous che una mutazione della cisteina catalitica (C580S) in Ulp1's Sumo ULP dominio (UD) non solo previene la scissione del Sumo, ma anche intrappola le proteine coniugate con sumo con elevate avidità12. Per semplicità, abbiamo fatto riferimento a questo frammento carboxy-terminale SUMO-trapping Ulp1 (C580S) come UTAG (abbreviazione di UD TAG). UTAG è una proteina di intrappolamento Pan-SUMO ricombinante che rappresenta un'utile alternativa agli anticorpi anti-SUMO utilizzati per l'isolamento e il rilevamento di proteine di SUMO-modificate. È importante sottolineare, in particolare, il SUMO coniugato in modo nativo e non solo uno o più epitopi su SUMO. Per migliorare sia la stabilità proteica che la forza legante SUMO di UTAG, abbiamo generato una variante di UTAG dal lievito a tolleranza di stress Kluyveromyces marxianus (km). KmUTAG lega saldamente i coniugati di SUMO con l'affinità nanomolare13. Inoltre, kmUTAG è resistente a temperature elevate (42 ° c), agenti riducenti (5 mM TCEP-tris (2-carbossimetilico) fosfina cloridrato), denaturanti (fino a 2 M di urea), agenti ossidanti (0,6% di perossido di idrogeno) e detergenti non ionici. Questa tolleranza allo stress è utile durante le dure condizioni di purificazione e i tempi di incubazione prolungati, assicurandone la stabilità e l'attività di cattura di SUMO. Non sorprende tuttavia che l'attività di KmUTAG di SUMO-trapping sia incompatibile con i reagenti modificanti la cisteina, i detergenti ionici e gli estratti proteici completamente denaturati. La notevole affinità e proprietà di KmUTAG indicano che questo reagente può diventare parte del repertorio standard per lo studio delle proteine SUMOilate in più specie.
Qui forniamo un metodo semplice per rilevare le proteine di SUMO-modificate in cellule di mammiferi e nematodi utilizzando una proteina di fusione fluorescente mCherry-KmUTAG ricombinante (kmUTAG-FL).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Well Cell Culture Plates</td>
			<td>Genesee Scientific/Olympus Plastics</td>
			<td>25-105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-545-003</td>
			<td>Used as a secondary antibody for mouse monoclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Gibco 14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dylight 488 conjugated AffiniPure Goat Anti-Moue IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-485-146</td>
			<td>Used as a secondary antibody for mouse monoclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Coverglass for Growth Cover Glasses</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12545101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLUORO-GEL II with DAPI</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>50-246-93)</td>
			<td>Mounting media in step 1.11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLUORO-GEL with DABCO</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>17985-02</td>
			<td>With DAPI added to 1 &#181;g/mL; mounting media in step 2.2.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine-HCl</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP3815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine-HCl</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>6000-43-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KmUTAG-fl</td>
			<td>Kerafast</td>
			<td></td>
			<td>KmUTAG reagents are available on Kerafast.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oneblock Western-CL blocking buffer</td>
			<td>Prometheus</td>
			<td>20-313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, Phosphate Buffered Saline, 10X Solution</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP3994</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNT2 cell line</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>95012613</td>
			<td>Normal prostate epithelium immortalized with SV40.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSPOT1</td>
			<td>(ChromoTek GmbH)</td>
			<td>ev-1</td>
			<td>https://www.chromotek.com/fileadmin/user_upload/pdfs/Datasheets/pSpot1_v1.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUMO 6F2</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>SUMO 6F2</td>
			<td>SUMO 6F2 was deposited to the DSHB by Pelisch, F. / Hay, R.T. (DSHB Hybridoma Product SUMO 6F2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUMO protease buffer [10x]</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>500 mM Tris-HCl, pH 8.0, 2% NP-40, 1.5 M NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUMO-2 Antibody 8A2</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>SUMO-2 8A2</td>
			<td>SUMO-2 8A2 was deposited to the DSHB by Matunis, M. (DSHB Hybridoma Product SUMO-2 8A2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP-HCL</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>51805-45-9</td>
			<td>Used as a reducing agent at a concentration of 5mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>Used for permeablization at 0.1% in DPBS/PBS(for worms)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

localization of sumo-modified proteins using fluorescent sumo-trapping proteins

Qui presentiamo un nuovo metodo per studiare la sumoilazione delle proteine e la loro localizzazione subcellulare nelle cellule dei mammiferi e negli ovociti nematodi. Questo metodo utilizza un frammento di proteina di SUMO-trapping modificato ricombinante, kmUTAG, derivato dalla proteasi di SUMO Ulp1 del lievito in erba tollerante allo stress Kluyveromyces marxianus. Abbiamo adattato le proprietà del kmUTAG allo scopo di studiare la sumoilazione in una varietà di sistemi di modelli senza l'uso di anticorpi. Per lo studio di SUMO, KmUTAG ha diversi vantaggi rispetto agli approcci basati su anticorpi. Questo reagente a tolleranza di SUMO è prodotto recombinantly, riconosce le isoforme di SUMO native di molte specie e, a differenza degli anticorpi disponibili in commercio, Mostra una ridotta affinità per il SUMO libero e non coniugato. I risultati rappresentativi qui riportati includono la localizzazione dei coniugati SUMO nelle cellule di coltura tissutale dei mammiferi e negli ovociti nematodi.

KmUTAG-FL è una proteina ricombinante, con etichetta mCherry, che cattura il SUMO. Per produrre kmUTAG-FL, abbiamo clonato un mCherry-kmUTAG ottimizzato per il codone nel plasmide di iperespressione batterica pSPOT1 (Figura 1). Dopo l'induzione, la proteina kmUTAG-FL è stata purificata su spot-TRAP, eluita e congelata fino a ulteriore uso. Per garantire l'attività di intrappolamento di SUMO di KmUTAG-FL, abbiamo confermato il legame con le perle coniugate ...

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Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

Il SUMO è una proteina modificatoria di tipo ubiquitina, essenziale e altamente conservata. In questo protocollo stiamo descrivendo l'uso di una proteina di SUMO-trapping ricombinante tollerante allo stress (kmUTAG) per visualizzare i coniugati SUMO nativi e senza tag e la loro localizzazione in una varietà di tipi di cellule.

Localizzazione delle proteine di SUMO-modificate utilizzando proteine di cattura di Sumo fluorescente

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...

Il significato di questo protocollo è l'uso di una nuova proteina UTAG fluorescente che intrappola sumo per il rilevamento del modificatore proteico SUMO in varie cellule eucariotiche. Il principale vantaggio di questa tecnica è un protocollo semplice per il rilevamento senza anticorpi di SUMO in una varietà di cellule, tra cui la coltura del tessuto dei mammiferi e le gonadi nematode. SUMO svolge ruoli importanti nel cancro e nei disturbi neurodegenerativi, e questo sottolinea la necessità di strumenti robusti e affidabili per il rilevamento e l'analisi funzionale delle proteine modificate suMO.Poiché il SUMO è altamente conservato, la proteina UTAG fluorescente che intrappola il SUMO può essere utilizzata per etichettare il SUMO coniugato in molti organismi diversi. Questo video dimostra il suo uso nelle cellule dei mammiferi. Inoltre, il testo completo descrive il suo uso negli ovociti nematodi.La dimostrazione visiva di questa tecnica fornisce suggerimenti critici per il trattamento delle cellule prima della colorazione e del rilevamento sumo. Per iniziare, far crescere le cellule di coltura tissutale di scelta su coperchi rotondi di 22 millimetri scivola in piastre TC a sei pozzi fino al 70-80% confluente. Lavare brevemente le cellule con un millilitro di DPBS.Per fissare le celle, aggiungere due millilitri di 4%PFA e DPBS freschi a ciascun pozzo. Incubare le cellule per 20 minuti a temperatura ambiente. Lavare le celle fisse tre volte per cinque minuti in un millilitro di DPBS mentre si nuta la piastra.Per permeabilizzare le cellule, incubare per 15 minuti con 1%Triton X-100 in DPBS. Lavare di nuovo le cellule, come prima. Incubare le cellule con 500 microlitri di 1 glicina molare HCL pH 2 per 10 secondi.Quindi neutralizzare immediatamente il pH con 500 microlitri di tampone 10X SUMO Protease, o SPB. Dopo aver lavato le celle come prima, rimuovere i coperchi dal pozzo e posizionarli in una camera di umidità. Solo per la colorazione UTAG-FL, mescolare un microgrammo di UTAG-FL con 100 microlitri di 1X SPB contenenti cinque TCEP millimolare in un tubo.Quindi, pipettare il mix sulle cellule sul coperchio scivolare e incubare a temperatura ambiente per un'ora nella camera di umidità. Per lavare i coperchi, pipettare 200 microlitri di DPBS su ogni slittamento del coperchio e lasciare in posizione per 10 minuti. Ripetere il lavaggio altre due volte.Rimuovere i coperchi dall'ultimo lavaggio e invertire su uno scivolo di microscopia pre-pulito con una goccia di mezzo di montaggio. Conservare i campioni durante la notte in un congelatore a 20 gradi Celsius prima di visualizzarsi al microscopio. Visualizzare le celle utilizzando i set di filtri appropriati per DAPI e Texas Red.Si prega di consultare il testo completo per un protocollo su come etichettare SUMO e gonadi nematodi fissi. Mentre l'etichettatura delle cellule di mammifero è piuttosto semplice, l'etichettatura degli ovociti nematodi richiede un addestramento preliminare nelle dissezioni di gonadi. KmUTAG-FL incubato con cellule PMT2 fisse ha mostrato una colorazione nucleare distinta.Erano visibili sia la colorazione nucleare diffusa che i distinti focolai nucleari. La localizzazione nucleare è stata confermata utilizzando la co-colorazione con DAPI. Coerentemente con l'attività di cattura sumo di KmUTAG-FL, il modello di localizzazione nucleare ricordava la colorazione SUMO23.La co-colorazione con anticorpo anti-SUMO23 8A2 ha confermato la co-localizzazione di KmUTAG-FL con il segnale SUMO23. Ciò convalida l'efficacia di KmUTAG-FL per rilevare SUMO23 nelle cellule di mammifero. Gonadi isolate dall'enfafrodite adulta produttrice di ovociti c.I nematodi elegani sono stati etichettati con anticorpi anti-SUMO. Coerentemente con i rapporti precedenti, anticorpo anti-SUMO inizialmente localizzato nel plasma nucleare degli ovociti prophase miotici tardi. Quindi si ridistribuì al complesso ad anello centrale degli omologhi accoppiati quando l'involucro nucleare si ruppe e i cromosomi si congressarono verso la piastra metafase.Nei preparati paralleli, le gonadi etichettate con KmUTAG-FL hanno rivelato modelli simili. KmUTAG-FL si spostò dall'etichettatura del nucleoplasma alla concentrazione sul complesso ad anello quando gli ovociti iniziarono e completarono il processo di rottura dell'involucro nucleare. Questi risultati convalidano KmUTAG-FL come strumento utile per l'analisi della miosi e dei processi relativi al SUMO in c.elegani ed eventualmente altri nematodi. Durante l'esecuzione della fissazione, è fondamentale utilizzare paraformaldeide fresca e un breve tempo di fissazione per mantenere SUMO piegato nativamente in modo che possa essere riconosciuto dal KmUTAG. Poiché la struttura terziaria di SUMO è altamente conservata, è molto probabile che le varianti SUMO di sistemi aggiuntivi di modello e non modello possano essere analizzate con il reagente KmUTAG-FL.Attualmente, stiamo usando questa nuova proteina UTAG fluorescente che intrappola sumo per studiare la funzione di SUMO durante lo stress cellulare. Infine, si prega di notare che tutte le fasi che utilizzano la paraformaldeide fissativa devono essere eseguite in una cappa di sicurezza di laboratorio e questo reagente deve essere smaltito correttamente.

Research

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Biochemistry

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Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

Uso delle proteine di fusione ricombinante in una piattaforma di analisi fluorescente proteasi e loro rinaturalizzazione In-gel

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...

Characterizing Cellular Proteins with In-cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins

Caratterizzare le proteine cellulari con l'ossidazione fotochimica veloce all'incell delle proteine

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting method used to characterize protein structure and interactions. ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Sezionamento trasversale di riso maturo (Oryza sativa L.) Kernel per la scansione di immagini al microscopio elettronico utilizzando le punte delle pipette come supporto per l'immobilizzazione

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Optimized Incorporation of Alkynyl Fatty Acid Analogs for the Detection of Fatty Acylated Proteins using Click Chemistry

Incorporazione ottimizzata di analoghi degli acidi grassi alchinici per il rilevamento di proteine acilate grasse utilizzando la chimica dei clic

Fatty acylation, the covalent addition of saturated fatty acids to protein substrates, is important in regulating a myriad of cellular functions in ...

Production of Recombinant PRMT Proteins using the Baculovirus Expression Vector System

Produzione di proteine PRMT ricombinanti utilizzando il baculovirus Expression Vector System

Protein arginine methyltransferases (PRMTs) methylate arginine residues on a wide variety of proteins that play roles in numerous cellular processes. ...