Name: localization of sumo-modified proteins using fluorescent sumo-trapping proteins
Uploaded: 2019-04-27T15:00:00
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我々は彼らのサポートのために Kerscher ラボのすべてのメンバーに感謝したい, 原稿の批判的な読書のためのナタリー・グエン, シーケンシングのためのリディア Epp.この作品は、コモンウェルス研究商業化ファンド MF16-034-LS に支持されています。W & M 学生の研究支援は、ベイリー・ヒューストン研究基金によって提供され、チャールズ・センターは RY と CH にフェローシップを表彰した。

1. 組換え KmUTAG-FL 相撲捕集タンパク質を用いた固定組織培養細胞における相撲検出
<ol><li>6ウェル TC プレートの 22 mm の丸カバースリップの組織培養細胞を 70% – 80% のコンフルエントになるまで成長させます。6ウェルプレートでステップ 1.2 ~ 1.8 を実行します。</li>
	<li>DPBS 1ml (ダルベッコ改変のリン酸緩衝生理食塩水) で細胞を簡単に洗浄する</li>
	<li>固定のために、4% パラホルムアルデヒド ...

<ol>
	<li>Kerscher, O., Felberbaum, R., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+proteins+by+ubiquitin+and+ubiquitin-like+proteins.">Modification of proteins by ubiquitin and ubiquitin-like proteins.</a> Cell and Developmental Biology. 22, 159-180 (2006).</li><li>Kerscher, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> SUMOylation. , 1-11 (2016).</li><li>Hay, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO:+a+history+of+modification.">SUMO: a history of modification.</a> Molecular Cell. 18 (1), 1-12 (2005).</li><li>Fu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+SUMO-specific+protease+2+induces+mitochondria+mediated+neurodegeneration.">Disruption of SUMO-specific protease 2 induces mitochondria mediated neurodegeneration.</a> PLoS Genetics. 10 (10), e1004579-e1004579 (2014).</li><li>Zhang, H., Kuai, X., Ji, Z., Li, Z., Shi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Over-expression+of+small+ubiquitin-related+modifier-1+and+sumoylated+p53+in+colon+cancer.">Over-expression of small ubiquitin-related modifier-1 and sumoylated p53 in colon cancer.</a> Cell biochemistry and biophysics. 67 (3), 1081-1087 (2013).</li><li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO-specific+protease+1+promotes+prostate+cancer+progression+and+metastasis.">SUMO-specific protease 1 promotes prostate cancer progression and metastasis.</a> Oncogene. 32 (19), 2493-2498 (2013).</li><li>Karami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+SUMO-Protease+SENP7S+Regulates+&#946;-catenin+Signaling+and+Mammary+Epithelial+Cell+Transformation.">Novel SUMO-Protease SENP7S Regulates &#946;-catenin Signaling and Mammary Epithelial Cell Transformation.</a> Scientific Reports. 7 (1), 46477 (2017).</li><li>Pelisch, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+SUMO-Dependent+Protein+Network+Regulates+Chromosome+Congression+during+Oocyte+Meiosis.">A SUMO-Dependent Protein Network Regulates Chromosome Congression during Oocyte Meiosis.</a> Molecular Cell. 65 (1), 66-77 (2017).</li><li>Zhang, X. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO-2/3+modification+and+binding+regulate+the+association+of+CENP-E+with+kinetochores+and+progression+through+mitosis.">SUMO-2/3 modification and binding regulate the association of CENP-E with kinetochores and progression through mitosis.</a> Molecular Cell. 29 (6), 729-741 (2008).</li><li>Baker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducibility+crisis:+Blame+it+on+the+antibodies.">Reproducibility crisis: Blame it on the antibodies.</a> Nature News. 521 (7552), 274-276 (2015).</li><li>Wang, Z., Prelich, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quality+control+of+a+transcriptional+regulator+by+SUMO-targeted+degradation.">Quality control of a transcriptional regulator by SUMO-targeted degradation.</a> Molecular and Cellular Biology. 29 (7), 1694-1706 (2009).</li><li>Li, S. J., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+protease+required+for+cell-cycle+progression+in+yeast.">A new protease required for cell-cycle progression in yeast.</a> Nature. 398 (6724), 246-251 (1999).</li><li>Peek, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO+targeting+of+a+stress-tolerant+Ulp1+SUMO+protease.">SUMO targeting of a stress-tolerant Ulp1 SUMO protease.</a> PLoS ONE. 13 (1), e0191391 (2018).</li><li>Edgar, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+13+Blastomere+Culture+and+Analysis.">Chapter 13 Blastomere Culture and Analysis.</a> Methods in Cell Biology. 48, 303-321 (1995).</li><li>Pelisch, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+SUMO+modification+regulates+mitotic+chromosome+assembly+and+cell+cycle+progression+in+Caenorhabditis+elegans.">Dynamic SUMO modification regulates mitotic chromosome assembly and cell cycle progression in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Communications. 5 (1), 769 (2014).</li><li>Dillingham, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+single-stranded+DNA+binding+protein+as+a+probe+for+sensitive,+real-time+assays+of+helicase+activity.">Fluorescent single-stranded DNA binding protein as a probe for sensitive, real-time assays of helicase activity.</a> Biophysical Journal. 95 (7), 3330-3339 (2008).</li><li>Ruckman, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2'-Fluoropyrimidine+RNA-based+aptamers+to+the+165-amino+acid+form+of+vascular+endothelial+growth+factor+(VEGF165).+Inhibition+of+receptor+binding+and+VEGF-induced+vascular+permeability+through+interactions+requiring+the+exon+7-encoded+domain.">2'-Fluoropyrimidine RNA-based aptamers to the 165-amino acid form of vascular endothelial growth factor (VEGF165). Inhibition of receptor binding and VEGF-induced vascular permeability through interactions requiring the exon 7-encoded domain.</a> The Journal of Biological Chemistry. 273 (32), 20556-20567 (1998).</li><li>Hughes, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+specific+inhibitors+of+SUMO-1-+and+SUMO-2/3-mediated+protein-protein+interactions+using+Affimer+(Adhiron)+technology.">Generation of specific inhibitors of SUMO-1- and SUMO-2/3-mediated protein-protein interactions using Affimer (Adhiron) technology.</a> Science Signaling. 10 (505), eaaj2005 (2017).</li><li>Lopata, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affimer+proteins+for+F-actin:+novel+affinity+reagents+that+label+F-actin+in+live+and+fixed+cells.">Affimer proteins for F-actin: novel affinity reagents that label F-actin in live and fixed cells.</a> Scientific Reports. 8 (1), 6572 (2018).</li><li>Gilbreth, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoform-specific+monobody+inhibitors+of+small+ubiquitin-related+modifiers+engineered+using+structure-guided+library+design.">Isoform-specific monobody inhibitors of small ubiquitin-related modifiers engineered using structure-guided library design.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (19), 7751-7756 (2011).</li><li>Berndt, A., Wilkinson, K. A., Heimann, M. J., Bishop, P., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+characterization+of+the+properties+of+SUMO1-specific+monobodies.">In vivo characterization of the properties of SUMO1-specific monobodies.</a> Biochemical Journal. 456 (3), 385-395 (2013).</li></ol>

ここでは、固定された哺乳動物細胞における相撲の機能研究のための組み換えタンパク質である kmUTAG の使用について紹介し、線虫生殖腺を解剖した。KmUTAG は、相撲をコンジュゲートしたタンパク質と相撲チェーンを認識し、トラップするストレス耐性の pan 相撲特異的試薬です。相撲の三次構造が高度に保存されているため、追加モデルや非モデル系からの相撲の変種を kmUTAG 試薬で分析で...

この方法の目的は、組換え相撲捕獲 UTAG (ULp ドメインタグ) タンパク質を用いて、相撲共役タンパク質の研究と分析を容易にすることである。以下に詳述するように、UTAG は、他の試薬の代わりに、相撲修飾タンパク質を精製、検出、および視覚化するためのアプローチを使用することができます。成長条件に応じて、細胞は、相撲または相撲の鎖で修飾された数百または数千のタンパク質を含むことができる (レビューのために Kerscher et al. 20061および Kerscher 20162を参照)。これは、特に特定の sumoylation の標的の一部分のみが実際に改変された3であるため、特定の相撲修飾タンパク質の機能解析にとってかなりの困難を表している。転写調節、タンパク質の恒常性、細胞ストレスへの反応、有糸分裂と減数分裂の間のクロマチンのリモデリングなどの重要な細胞プロセスにおけるそれらの役割に加えて、;現在では、相撲、相撲改変タンパク質、および相撲の経路構成要素も、癌や神経変性疾患などの病理のためのバイオマーカーとして可能性があることが十分に明らかになっています4,5,6 、7。これは、さまざまな細胞およびサンプルにおける相撲修飾タンパク質の検出と機能解析のための、堅牢で信頼性が高く、入手しやすいツールと革新的なアプローチの必要性を強調しています。
多くのシステムにおいて、相撲特異的抗体は、相撲修飾タンパク質8,9の検出、分離および機能分析のための選択の試薬です。しかしながら、いくつかの商業的に入手可能な相撲特異的抗体は、高価であり、量または可用性において制限され、乱暴に可変親和性および交差反応性を示す傾向があり、そしていくつかの例では再現性10を欠く。別のアプローチとしては、形質転換された細胞や生物におけるエピトープタグ付き相撲の発現があるが、エピトープタグを相撲に結びつけることは、タンパク質標的11への共役を人為的に下げる可能性がある。さらに、エピトープは、未変換の細胞または組織が評価される場合には有用ではない。
Ulp1 は、相撲前駆体と desumoylates 相撲共役タンパク質12の両方を処理するs. セレビシエから保存された相撲プロテアーゼである。UTAG 試薬は、Ulp1's 相撲加工における触媒性システイン (C580S) の変異が相撲の切断を防ぐだけでなく、相撲共役タンパク質を高いものとして偶然という観測に基づいて開発されました。アビディティ12.簡単にするために、我々は、UTAG (UD タグの略) として、このカルボキシ末端末端相撲トラッピング Ulp1 (C580S) 断片を言及しました。UTAG は、相撲修飾タンパク質の単離と検出に使用される、抗相撲抗体の有用な代替手段を表す組換え汎相撲の捕捉タンパク質である。重要なことに、それは具体的には、相撲の1つまたは複数のエピトープだけでなく、ネイティブに折り畳まれた相撲を認識しています。UTAG のタンパク質安定性と相撲の結合強度の両方を向上させるために、ストレス耐性酵母Kluyveromyces marxianus (Km) から UTAG の変種を生成した。KmUTAG は、相撲-コンジュゲートをナノモルアフィニティ13と緊密に結合します。さらに、kmUTAG は、高温 (42 ° c)、還元剤 (5 mM TCEP-トリス (2-carboxyethyl) 塩酸ホスフィン)、denaturants (最大 2 M 尿素)、酸化剤 (0.6% 過酸化水素)、および非イオン性洗剤に対して耐性があります。このストレス耐性は、過酷な浄化条件と長時間のインキュベーション時間の間に有益であり、その安定性と相撲捕獲活性を保証します。しかし、KmUTAG の相撲捕獲活動は、システイン修飾試薬やイオン性洗剤、完全に変性したタンパク質抽出物とは互換性がありません。KmUTAG の顕著な親和性および特性は、この試薬が複数の種に sumoylated タンパク質の研究のための標準的なレパートリーの一部となる可能性があることを示す。
ここでは、組換え蛍光 mCherry-KmUTAG 融合タンパク質 (kmUTAG) を使用して、哺乳動物細胞および線虫における相撲修飾タンパク質を検出する簡単な方法を提供します。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Well Cell Culture Plates</td>
			<td>Genesee Scientific/Olympus Plastics</td>
			<td>25-105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-545-003</td>
			<td>Used as a secondary antibody for mouse monoclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Gibco 14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dylight 488 conjugated AffiniPure Goat Anti-Moue IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-485-146</td>
			<td>Used as a secondary antibody for mouse monoclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Coverglass for Growth Cover Glasses</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12545101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLUORO-GEL II with DAPI</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>50-246-93)</td>
			<td>Mounting media in step 1.11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLUORO-GEL with DABCO</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>17985-02</td>
			<td>With DAPI added to 1 &#181;g/mL; mounting media in step 2.2.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine-HCl</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP3815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine-HCl</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>6000-43-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KmUTAG-fl</td>
			<td>Kerafast</td>
			<td></td>
			<td>KmUTAG reagents are available on Kerafast.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oneblock Western-CL blocking buffer</td>
			<td>Prometheus</td>
			<td>20-313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, Phosphate Buffered Saline, 10X Solution</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP3994</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNT2 cell line</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>95012613</td>
			<td>Normal prostate epithelium immortalized with SV40.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSPOT1</td>
			<td>(ChromoTek GmbH)</td>
			<td>ev-1</td>
			<td>https://www.chromotek.com/fileadmin/user_upload/pdfs/Datasheets/pSpot1_v1.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUMO 6F2</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>SUMO 6F2</td>
			<td>SUMO 6F2 was deposited to the DSHB by Pelisch, F. / Hay, R.T. (DSHB Hybridoma Product SUMO 6F2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUMO protease buffer [10x]</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>500 mM Tris-HCl, pH 8.0, 2% NP-40, 1.5 M NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUMO-2 Antibody 8A2</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>SUMO-2 8A2</td>
			<td>SUMO-2 8A2 was deposited to the DSHB by Matunis, M. (DSHB Hybridoma Product SUMO-2 8A2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP-HCL</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>51805-45-9</td>
			<td>Used as a reducing agent at a concentration of 5mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>Used for permeablization at 0.1% in DPBS/PBS(for worms)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

localization of sumo-modified proteins using fluorescent sumo-trapping proteins

ここでは、哺乳動物細胞および線虫卵細胞におけるタンパク質およびそのサブ細胞局在の sumoylation を研究する新規な方法を提示している。この方法は、組換え改変された相撲捕集タンパク質断片を利用し、kmUTAG は、ストレス耐性出芽酵母Kluyveromyces marxianusの Ulp1 相撲プロテアーゼに由来する。我々は、抗体を使用せずに様々なモデルシステムで sumoylation を研究する目的で、kmUTAG の特性を適応してきた。相撲の研究のために、KmUTAG は抗体ベースのアプローチと比較するといくつかの利点があります。このストレス耐性の相撲捕集試薬は、組換えに生産され、多くの種から天然の相撲アイソフォームを認識し、かつ市販の抗体とは異なり、自由で非抱合型相撲に対する親和性の低下を示す。ここに示された代表的な結果は、哺乳動物組織培養細胞および線虫卵子における相撲コンジュゲートの局在を含む。

KmUTAG-fl は、組み換え、mCherry タグ付きの相撲トラッピングタンパク質です。KmUTAG を作製するために、コドン最適化された mCherry kmUTAG を pSPOT1 細菌過剰発現プラスミドにクローニングした (図 1)。誘導後、kmUTAG タンパク質をスポットトラップ上で精製し、溶出し、さらに使用するまで凍結した。KmUTAG の相撲捕獲活動を確実にするために、SUMO1 に?...

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Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

相撲は必須で高度に保存された、小さなユビキチンのような修飾タンパク質です。このプロトコルでは、ストレス耐性組換え相撲捕捉タンパク質 (kmUTAG) を使用して、ネイティブ、タグなしの相撲コンジュゲート、およびさまざまな種類の細胞での局在を可視化することを説明しています。

蛍光相撲捕集タンパク質を用いた SUMO 修飾タンパク質の局在化

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...

このプロトコルの意義は、様々な真核細胞におけるタンパク質修飾体のSUMOの検出に新しい蛍光SUMOトラップUTAGタンパク質を用いることが重要である。この技術の主な利点は、哺乳類組織培養および線虫性腺を含む様々な細胞におけるSUMOの抗体を含まない検出のための簡単なプロトコルである。SUMOはがんや神経変性疾患において重要な役割を果たしており、SUMO改変タンパク質の検出と機能解析のための堅牢で信頼性の高いツールの必要性を強調しています。SUMOは高度に保存されているため、蛍光SUMOトラップUTAGタンパク質を使用して、多くの異なる生物で共役スモを標識することができます。このビデオは、哺乳類細胞での使用を示しています。また、全文は線虫の卵母細胞での使用について説明する。この技術の視覚的なデモンストレーションは、染色およびSUMO検出前の細胞の治療のための重要なヒントを提供する。まず、70〜80%コンフルエントまで6ウェルTCプレートの22ミリメートルの丸いカバースリップで選択した組織培養細胞を成長させます。1ミリリットルのDPBSで細胞を短時間洗います。細胞を固定するには、新鮮な4%PFAとDPBSの2ミリリットルを各ウェルに加えます。室温で20分間細胞をインキュベートする。固定細胞を1ミリリットルのDPBSで5分間3回洗浄し、プレートを仕上げながら洗浄します。細胞を透過し、DPBSで1%トリトンX-100で15分間インキュベートする。前のように、細胞をもう一度洗います。500マイクロリットルの1モルグリシンHCL pH2を10秒間インキュベートします。次に、10X SUMOプロテアーゼバッファー、またはSPBの500マイクロリットルですぐにpHを中和します。以前のように細胞を洗浄した後、ウェルからカバースリップを取り除き、湿度チャンバーに入れます。UTAG-FL染色の場合のみ、チューブ内に5ミリモルTCEPを含む1X SPBの100マイクロリットルとUTAG-FLの1マイクログラムを混合してください。次いで、カバースリップ上の細胞にピペットを混ぜ、湿度チャンバ内で1時間室温でインキュベートする。カバースリップを洗浄するには、各カバースリップに200マイクロリットルのDPBSをピペットし、10分間所定の位置に残します。さらに2回洗い流します。最後の洗浄からカバースリップを取り外し、取り付け媒体の滴で事前に洗浄された顕微鏡スライドに反転します。顕微鏡で見る前に、サンプルを摂氏20度の冷凍庫に一晩保管してください。DAPI とテキサスレッドの適切なフィルター セットを使用してセルを視覚化します。SUMO と固定線虫腺のラベル付け方法に関するプロトコルの全文を参照してください。哺乳類細胞の標識は非常に簡単ですが、線虫卵母細胞を標識するには、生殖腺解剖の事前トレーニングが必要です。固定PMT2細胞をインキュベートしたKmUTAG-FLは、明確な核染色を示した。拡散核染色と明確な核病巣の両方が見えました。核局在化はDAPIとの共染色を用いて確認した。KmUTAG-FLのSUMO捕捉活性と一致して、核局在パターンはSUMO23染色を連想させる。抗SUMO23 8A2抗体による共染色により、SumO23シグナルによるKmUTAG-FLの共局在化が確認された。これは、哺乳動物細胞におけるSUMO23を検出するKmUTAG-FLの有効性を検証する。卵母細胞産生成人雌雄同体cから単離された生殖腺。エレガンス線虫は抗SUMO抗体で標識した。以前の報告と一致して、抗SUMO抗体は、初期筋性気相卵母細胞の核プラスムに最初に局在した。その後、核封筒が分解し、染色体がメタフェーズプレートに向かってコングレスされると、ペアのホモログの中央環複合体に再配布されました。並行して、KmUTAG-FLで標識された生殖腺も同様のパターンを明らかにした。KmUTAG-FLは、卵母細胞が始まり、核エンベロープ分解のプロセスを完了するにつれて、核内皮の標識から環状複合体に集中することに移行した。これらの結果は、Cの筋症およびSUMO関連プロセスの分析に役立つツールとしてKmUTAG-FLを検証する。エレガンスとおそらく他の線虫。固定を行う間、新鮮なパラホルムアルデヒドと短い固定時間を使用して、SumOをネイティブに折りたたんでKmUTAGで認識できるようにしておくことが重要です。SUMOの三次構造は高度に保存されているため、追加モデルおよび非モデル系のSUMO変異体をKmUTAG-FL試薬で解析できる可能性が非常に高い。現在、この新しい蛍光相撲捕捉UTAGタンパク質を用いて、細胞ストレス時のSUMOの機能を研究しています。最後に、固定パラホルムアルデヒドを使用するすべてのステップは、実験室の安全フードで行われるべきであり、この試薬は適切に処分されなければならないことに注意してください。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identification of Plant Ice-binding Proteins Through Assessment of Ice-recrystallization Inhibition and Isolation Using Ice-affinity Purification

アイスアフィニティー精製を用いた氷再結晶阻害とアイソレーションの評価による植物の氷結合タンパク質の同定

Ice-binding proteins (IBPs) belong to a family of stress-induced proteins that are synthesized by certain organisms exposed to subzero temperatures. In ...

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.

洗剤無料補完充電プロテオリポソーム融合ペプチドを用いた脂質膜に膜タンパク質の超高速再構成。

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers ...

Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

洗剤に敏感な膜タンパク質相互作用の検出

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

How to Quantify the Fraction of Photoactivated Fluorescent Proteins in Bulk and in Live Cells

センサー蛍光蛋白質生きているセルおよびバルク量を定量化する方法

Photoactivatable and -convertible fluorescent proteins (PA-FPs) have been used in fluorescence live-cell microscopy for analyzing the dynamics of cells ...

Fluorescent Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels

蛍光タンパク質のポリアクリルアミドゲルの銀製の汚損

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide ...

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

蛍光プロテアーゼ アッセイプラット フォームとそのゲルの下で遺伝子組換えの融合蛋白質の使用

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...

Characterizing Cellular Proteins with In-cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins

細胞内高速光化学タンパク質による細胞タンパク質の特性分析

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting method used to characterize protein structure and interactions. ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

成熟米の横断断面(オリザ・サティバ L.ピペットチップを固定化支援として用いた走査電子顕微鏡イメージング用カーネル

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Optimized Incorporation of Alkynyl Fatty Acid Analogs for the Detection of Fatty Acylated Proteins using Click Chemistry

クリックケミストリーを用いた脂肪酸アシル化タンパク質の検出のためのアルキニル脂肪酸類似体の最適化された組み込み

Fatty acylation, the covalent addition of saturated fatty acids to protein substrates, is important in regulating a myriad of cellular functions in ...

Production of Recombinant PRMT Proteins using the Baculovirus Expression Vector System

バキュロウイルス発現ベクターシステムを用いた組換えPRMTタンパク質の生産

Protein arginine methyltransferases (PRMTs) methylate arginine residues on a wide variety of proteins that play roles in numerous cellular processes. ...