Name: localization of sumo-modified proteins using fluorescent sumo-trapping proteins
Uploaded: 2019-04-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins at JoVE.com

Vi vil gjerne takke alle medlemmer av Kerscher-laboratoriet for deres støtte, Nathalie Nguyen for kritisk lesning av manuskriptet, og Lidia EPP for sekvenser. Dette arbeidet har blitt støttet av Commonwealth Research kommersialisering fondet MF16-034-LS til OK. Forskning støtte for W & M studentene ble levert av Bailey-Huston Research Fund, og Charles Center Honors stipend til RY og CH.

1. SUMO deteksjon i fast vev kultur celler ved hjelp av rekombinant KmUTAG-FL SUMO-fangst protein
<ol><li>Grow vev kultur celler av valget på 22 mm rund deksel slips i 6-brønn TC plater til 70% – 80% confluent. Utfør trinn 1,2 – 1,8 i 6-brønn platen.</li>
	<li>Vask celler en kort stund med 1 mL DPBS (Dulbecco ' s fosfat-bufret saltvann)</li>
	<li>For fiksering, utarbeide en frisk løsning av 4% Paraformaldehyde (PFA) løsning (fortynnet i DPBS). For å fikse celler, tilsett 2 mL 4% PFA i DPBS til hver brønn. R...

<ol>
	<li>Kerscher, O., Felberbaum, R., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+proteins+by+ubiquitin+and+ubiquitin-like+proteins.">Modification of proteins by ubiquitin and ubiquitin-like proteins.</a> Cell and Developmental Biology. 22, 159-180 (2006).</li><li>Kerscher, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> SUMOylation. , 1-11 (2016).</li><li>Hay, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO:+a+history+of+modification.">SUMO: a history of modification.</a> Molecular Cell. 18 (1), 1-12 (2005).</li><li>Fu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+SUMO-specific+protease+2+induces+mitochondria+mediated+neurodegeneration.">Disruption of SUMO-specific protease 2 induces mitochondria mediated neurodegeneration.</a> PLoS Genetics. 10 (10), e1004579-e1004579 (2014).</li><li>Zhang, H., Kuai, X., Ji, Z., Li, Z., Shi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Over-expression+of+small+ubiquitin-related+modifier-1+and+sumoylated+p53+in+colon+cancer.">Over-expression of small ubiquitin-related modifier-1 and sumoylated p53 in colon cancer.</a> Cell biochemistry and biophysics. 67 (3), 1081-1087 (2013).</li><li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO-specific+protease+1+promotes+prostate+cancer+progression+and+metastasis.">SUMO-specific protease 1 promotes prostate cancer progression and metastasis.</a> Oncogene. 32 (19), 2493-2498 (2013).</li><li>Karami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+SUMO-Protease+SENP7S+Regulates+&#946;-catenin+Signaling+and+Mammary+Epithelial+Cell+Transformation.">Novel SUMO-Protease SENP7S Regulates &#946;-catenin Signaling and Mammary Epithelial Cell Transformation.</a> Scientific Reports. 7 (1), 46477 (2017).</li><li>Pelisch, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+SUMO-Dependent+Protein+Network+Regulates+Chromosome+Congression+during+Oocyte+Meiosis.">A SUMO-Dependent Protein Network Regulates Chromosome Congression during Oocyte Meiosis.</a> Molecular Cell. 65 (1), 66-77 (2017).</li><li>Zhang, X. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO-2/3+modification+and+binding+regulate+the+association+of+CENP-E+with+kinetochores+and+progression+through+mitosis.">SUMO-2/3 modification and binding regulate the association of CENP-E with kinetochores and progression through mitosis.</a> Molecular Cell. 29 (6), 729-741 (2008).</li><li>Baker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducibility+crisis:+Blame+it+on+the+antibodies.">Reproducibility crisis: Blame it on the antibodies.</a> Nature News. 521 (7552), 274-276 (2015).</li><li>Wang, Z., Prelich, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quality+control+of+a+transcriptional+regulator+by+SUMO-targeted+degradation.">Quality control of a transcriptional regulator by SUMO-targeted degradation.</a> Molecular and Cellular Biology. 29 (7), 1694-1706 (2009).</li><li>Li, S. J., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+protease+required+for+cell-cycle+progression+in+yeast.">A new protease required for cell-cycle progression in yeast.</a> Nature. 398 (6724), 246-251 (1999).</li><li>Peek, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO+targeting+of+a+stress-tolerant+Ulp1+SUMO+protease.">SUMO targeting of a stress-tolerant Ulp1 SUMO protease.</a> PLoS ONE. 13 (1), e0191391 (2018).</li><li>Edgar, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+13+Blastomere+Culture+and+Analysis.">Chapter 13 Blastomere Culture and Analysis.</a> Methods in Cell Biology. 48, 303-321 (1995).</li><li>Pelisch, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+SUMO+modification+regulates+mitotic+chromosome+assembly+and+cell+cycle+progression+in+Caenorhabditis+elegans.">Dynamic SUMO modification regulates mitotic chromosome assembly and cell cycle progression in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Communications. 5 (1), 769 (2014).</li><li>Dillingham, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+single-stranded+DNA+binding+protein+as+a+probe+for+sensitive,+real-time+assays+of+helicase+activity.">Fluorescent single-stranded DNA binding protein as a probe for sensitive, real-time assays of helicase activity.</a> Biophysical Journal. 95 (7), 3330-3339 (2008).</li><li>Ruckman, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2'-Fluoropyrimidine+RNA-based+aptamers+to+the+165-amino+acid+form+of+vascular+endothelial+growth+factor+(VEGF165).+Inhibition+of+receptor+binding+and+VEGF-induced+vascular+permeability+through+interactions+requiring+the+exon+7-encoded+domain.">2'-Fluoropyrimidine RNA-based aptamers to the 165-amino acid form of vascular endothelial growth factor (VEGF165). Inhibition of receptor binding and VEGF-induced vascular permeability through interactions requiring the exon 7-encoded domain.</a> The Journal of Biological Chemistry. 273 (32), 20556-20567 (1998).</li><li>Hughes, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+specific+inhibitors+of+SUMO-1-+and+SUMO-2/3-mediated+protein-protein+interactions+using+Affimer+(Adhiron)+technology.">Generation of specific inhibitors of SUMO-1- and SUMO-2/3-mediated protein-protein interactions using Affimer (Adhiron) technology.</a> Science Signaling. 10 (505), eaaj2005 (2017).</li><li>Lopata, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affimer+proteins+for+F-actin:+novel+affinity+reagents+that+label+F-actin+in+live+and+fixed+cells.">Affimer proteins for F-actin: novel affinity reagents that label F-actin in live and fixed cells.</a> Scientific Reports. 8 (1), 6572 (2018).</li><li>Gilbreth, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoform-specific+monobody+inhibitors+of+small+ubiquitin-related+modifiers+engineered+using+structure-guided+library+design.">Isoform-specific monobody inhibitors of small ubiquitin-related modifiers engineered using structure-guided library design.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (19), 7751-7756 (2011).</li><li>Berndt, A., Wilkinson, K. A., Heimann, M. J., Bishop, P., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+characterization+of+the+properties+of+SUMO1-specific+monobodies.">In vivo characterization of the properties of SUMO1-specific monobodies.</a> Biochemical Journal. 456 (3), 385-395 (2013).</li></ol>

Her introduserer vi bruken av kmUTAG-FL, et rekombinant protein, for funksjonelle studier av SUMO i faste pattedyrceller og dissekert nematode gonader. KmUTAG-fl er en stress-tolerant Pan-SUMO spesifikk reagens som anerkjenner og feller innfødte SUMO-bøyd proteiner og SUMO kjeder. Siden SUMO ' s tertiær struktur er svært bevart er det svært sannsynlig at SUMO varianter fra ekstra modell og ikke-modellsystemer kan analyseres med kmUTAG-fl reagens. Som sådan kan KmUTAG-fl representere et nyttig alternativ eller sekun...

Formålet med denne metoden er å lette studiet og analyse av SUMO-bøyd proteiner ved hjelp av rekombinant SUMO-fangst UTAG (ULP Domain tag) protein. Som beskrevet nedenfor, kan UTAG brukes i stedet for andre reagenser og tilnærminger for å rense, oppdage og visualisere SUMO-modifiserte proteiner. Avhengig av vekstforhold, kan cellene inneholde hundrevis eller tusenvis av proteiner som er modifisert med SUMO eller SUMO kjeder (for gjennomgang se Kerscher et al. 20061 og Kerscher 20162). Dette representerer en betydelig vanskelighetsgrad for de funksjonelle analysene av spesifikke SUMO-modifiserte proteiner, spesielt siden bare en brøkdel av et bestemt sumoylation mål faktisk er modifisert3. I tillegg til sine roller i essensielle cellulære prosesser som transcriptional regulering, protein homeostase, responsen på mobilnettet stress, og kromatin remodeling under mitose og meiose; Det har nå blitt tilstrekkelig klart at Sumo, Sumo-modifiserte proteiner, og Sumo Pathway komponenter har også potensial som biomarkører for sykdommer som kreft og nevrodegenerative lidelser4,5,6 ,7. Dette understreker behovet for robuste, pålitelige og lett tilgjengelige verktøy og innovative tilnærminger for påvisning og funksjonell analyse av SUMO-modifiserte proteiner i en rekke celler og prøver.
I mange systemer, Sumo-spesifikke antistoffer er reagensene av valget for deteksjon, isolering og funksjonelle analyser av Sumo-modifiserte proteiner8,9. Men noen kommersielt tilgjengelige SUMO-spesifikke antistoffer er kostbare, begrenset i kvantitet eller tilgjengelighet, utsatt for å vise vilt variable slektskap og kryss-reaktivitet, og i noen tilfeller mangler reproduserbarhet10. En alternativ tilnærming er uttrykk for epitope SUMO i forvandlet celler og organismer, men linking epitope koder til SUMO kan kunstig senke Bøyning til protein mål11. I tillegg er epitopes ikke nyttig når transformert celler eller vev evalueres.
Ulp1 er en bevart SUMO protease fra S. cerevisiae at begge prosessene i Sumo forløper og desumoylates Sumo-bøyd proteiner12. Vi utviklet UTAG reagens basert på serendipitous observasjon at en mutasjon av katalysatoren cystein (C580S) i Ulp1's SUMO prosessering ULP domene (UD) ikke bare hindrer Sumo KLØFT men også feller Sumo-bøyd proteiner med høy avidity12. For enkelhet, refererte vi til dette carboxy-Terminal SUMO-fangst Ulp1 (C580S) fragment som UTAG (forkortelse for UD TAG). UTAG er et rekombinant Pan-SUMO-fangst protein som representerer et nyttig alternativ til anti-SUMO-antistoffer som brukes til isolering og påvisning av SUMO-modifiserte proteiner. Viktigere, det spesielt anerkjenner innfødt-foldet, bøyd SUMO og ikke bare en eller flere epitopes på SUMO. For å forbedre både protein stabiliteten og SUMO bindende styrke UTAG, genererte vi en variant av UTAG fra stress-tolerant gjær Kluyveromyces marxianus (km). KmUTAG tett binder SUMO-konjugater med nanomolar affinitet13. I tillegg er kmUTAG motstandsdyktig mot forhøyede temperaturer (42 ° c), reduksjonsmidler (5 mM TCEP-Tris (2-carboxyethyl) fosfin hydrochloride), denaturants (opp til 2 M urea), oksiderende midler (0,6% hydrogen peroxide), og ikke-ioniske vaskemidler. Dette stress toleranse er gunstig under harde rensing tilstand og langvarig inkubasjons ganger, sikre sin stabilitet og SUMO-fangst aktivitet. Ikke overraskende, imidlertid, KmUTAG ' SUMO-fange aktivitet er inkompitabel med cystein-endring reagenser, ioniske rengjøringsmidler og fullt ut denaturert protein ekstrakter. Den bemerkelsesverdige affinitet og egenskapene til KmUTAG tyder på at denne reagens kan bli en del av standard repertoaret for studiet av sumoylated proteiner i flere arter.
Her gir vi en enkel metode for å oppdage SUMO-modifiserte proteiner i pattedyrceller og nematoder ved hjelp av et rekombinant fluorescerende mCherry-KmUTAG Fusion protein (kmUTAG-fl).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Well Cell Culture Plates</td>
			<td>Genesee Scientific/Olympus Plastics</td>
			<td>25-105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-545-003</td>
			<td>Used as a secondary antibody for mouse monoclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Gibco 14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dylight 488 conjugated AffiniPure Goat Anti-Moue IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-485-146</td>
			<td>Used as a secondary antibody for mouse monoclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Coverglass for Growth Cover Glasses</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12545101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLUORO-GEL II with DAPI</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>50-246-93)</td>
			<td>Mounting media in step 1.11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLUORO-GEL with DABCO</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>17985-02</td>
			<td>With DAPI added to 1 &#181;g/mL; mounting media in step 2.2.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine-HCl</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP3815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine-HCl</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>6000-43-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KmUTAG-fl</td>
			<td>Kerafast</td>
			<td></td>
			<td>KmUTAG reagents are available on Kerafast.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oneblock Western-CL blocking buffer</td>
			<td>Prometheus</td>
			<td>20-313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, Phosphate Buffered Saline, 10X Solution</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP3994</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNT2 cell line</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>95012613</td>
			<td>Normal prostate epithelium immortalized with SV40.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSPOT1</td>
			<td>(ChromoTek GmbH)</td>
			<td>ev-1</td>
			<td>https://www.chromotek.com/fileadmin/user_upload/pdfs/Datasheets/pSpot1_v1.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUMO 6F2</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>SUMO 6F2</td>
			<td>SUMO 6F2 was deposited to the DSHB by Pelisch, F. / Hay, R.T. (DSHB Hybridoma Product SUMO 6F2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUMO protease buffer [10x]</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>500 mM Tris-HCl, pH 8.0, 2% NP-40, 1.5 M NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUMO-2 Antibody 8A2</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>SUMO-2 8A2</td>
			<td>SUMO-2 8A2 was deposited to the DSHB by Matunis, M. (DSHB Hybridoma Product SUMO-2 8A2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP-HCL</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>51805-45-9</td>
			<td>Used as a reducing agent at a concentration of 5mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>Used for permeablization at 0.1% in DPBS/PBS(for worms)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

localization of sumo-modified proteins using fluorescent sumo-trapping proteins

Her presenterer vi en ny metode for å studere sumoylation av proteiner og deres sub-cellulære lokalisering i pattedyrceller og nematode oocytter. Denne metoden utnytter en rekombinant modifisert SUMO-fangst protein fragment, kmUTAG, avledet fra Ulp1 SUMO protease av stress-tolerant spirende gjær Kluyveromyces marxianus. Vi har tilpasset egenskapene til kmUTAG med det formål å studere sumoylation i en rekke modellsystemer uten bruk av antistoffer. For studiet av SUMO, KmUTAG har flere fordeler sammenlignet med antistoff-baserte tilnærminger. Dette stress-tolerant SUMO-fangst reagens er produsert recombinantly, gjenkjenner den innfødte SUMO isoformene fra mange arter, og i motsetning til kommersielt tilgjengelige antistoffer det viser redusert affinitet for gratis, unconjugated SUMO. Representative resultater som vises her inkluderer lokalisering av SUMO konjugater i pattedyr vev kultur celler og nematode oocytter.

KmUTAG-fl er et rekombinant, mCherry-Tagged SUMO-fangst protein. For å produsere kmUTAG-FL, klonet vi en Codon-optimalisert mCherry-kmUTAG i pSPOT1 bakteriell overuttrykte plasmider (figur 1). Etter induksjon, kmUTAG-fl protein ble renset på spot-TRAP, eluert, og frosset inntil videre bruk. For å sikre SUMO-fangst aktivitet av KmUTAG-FL, bekreftet vi binding til SUMO1-bøyd perler og utfelling av en SUMO-CAT Fusion protein (data ikke vist, men se tidligere...

Watch this Scientific Journal Video about Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins at JoVE.com

Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

SUMO er et essensielt og svært bevart, lite, ubiquitin-lignende endrings protein. I denne protokollen beskriver vi bruken av en stress-tolerant rekombinant SUMO-fangst protein (kmUTAG) å visualisere native, umerkede SUMO konjugater og deres lokalisering i en rekke celletyper.

Lokalisering av SUMO-modifisert proteiner bruke fluorescerende Sumo-fangst proteiner

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...

Betydningen av denne protokollen er bruken av et nytt fluorescerende SUMO-fangst UTAG-protein for påvisning av proteinmodifikatoren SUMO i ulike eukaryotiske celler. Den største fordelen med denne teknikken er en enkel protokoll for antistofffri påvisning av SUMO i en rekke celler, inkludert pattedyrvevskultur og nematode gonader. SUMO spiller viktige roller i kreft og nevrodegenerative lidelser, og dette understreker behovet for robuste og pålitelige verktøy for påvisning og funksjonell analyse av SUMO-modifiserte proteiner.Fordi SUMO er svært bevart, kan det fluorescerende SUMO-fangstutag-proteinet brukes til å merke konjugert SUMO i mange forskjellige organismer. Denne videoen demonstrerer bruken i pattedyrceller. I tillegg beskriver hele teksten bruken i nematode oocytes.Den visuelle demonstrasjonen av denne teknikken gir kritiske hint for behandling av celler før farging og SUMO-deteksjon. Til å begynne, vokse vev kultur celler av valget på 22-millimeter runde dekselet glir i seks-godt TC plater til 70 til 80% samløpet. Vask cellene kort med en milliliter DPBS.For å fikse cellene, legg til to milliliter med friske 4% PFA og DPBS til hver brønn. Inkuber cellene i 20 minutter ved romtemperatur. Vask de faste cellene tre ganger i fem minutter i en milliliter DPBS mens du nutating platen.For å gjennomsyre cellene, inkuber i 15 minutter med 1% Triton X-100 i DPBS. Vask cellene igjen, som før. Inkuber cellene med 500 mikroliter med 1 molarglysin HCL pH 2 i 10 sekunder.Deretter nøytraliser pH umiddelbart med 500 mikroliter på 10X SUMO Protease buffer, eller SPB. Etter vask av cellene som før, fjern dekselet glir fra brønnen og legg dem i et fuktighetskammer. For UTAG-FL-farging kan du bare blande ett mikrogram UTAG-FL med 100 mikroliter 1X SPB som inneholder fem millimolar TCEP i et rør.Deretter pipette blandingen på cellene på dekselet slip og inkubere ved romtemperatur i en time i fuktighetskammeret. For å vaske dekselet slips, pipette 200 mikroliter av DPBS på hvert deksel slip og la på plass i 10 minutter. Gjenta vasken to ganger til.Fjern dekselet fra den siste vasken og inverter på et forhåndsrengjort mikroskopisklie med en dråpe monteringsmedium. Oppbevar prøvene over natten i en 20 graders Celsius fryser før du ser under mikroskopet. Visualiser cellene ved hjelp av de riktige filtersettene for DAPI og Texas Red.Vennligst se hele teksten for en protokoll om hvordan du merker SUMO og faste nematode gonads. Mens merking av pattedyrceller er ganske grei, merking nematode oocytes krever tidligere opplæring i gonad disseksjoner. KmUTAG-FL inkubert med faste PMT2-celler viste en distinkt kjernefysisk farging.Både diffus kjernefysisk farging og distinkte kjernefysiske foci var synlige. Kjernefysisk lokalisering ble bekreftet ved hjelp av samtidig farging med DAPI. I samsvar med SUMO-fangstaktiviteten til KmUTAG-FL, minner det kjernefysiske lokaliseringsmønsteret om SUMO23-farging.Samtidig farging med anti-SUMO23 8A2 antistoff bekreftet co-lokalisering av KmUTAG-FL med SUMO23 signalet. Dette validerer effekten av KmUTAG-FL for å oppdage SUMO23 i pattedyrceller. Isolerte gonader fra oocyte-produserende voksen hermafroditt c.elegans nematoder ble merket med anti-SUMO antistoff. I samsvar med tidligere rapporter, anti-SUMO antistoff opprinnelig lokalisert til kjernefysisk plasma av sen myotisk prophase oocytes. Det deretter omfordelt til den sentrale ring kompleks av de parede homologs som kjernefysisk konvolutt brøt sammen og kromosomene kongressde mot metaphase plate.I parallelle preparater avslørte gonader merket med KmUTAG-FL lignende mønstre. KmUTAG-FL skiftet fra å merke kjernen til å konsentrere seg om ringkomplekset da oocytter begynte og fullførte prosessen med kjernefysisk konvoluttsammenbrudd. Disse resultatene validerer KmUTAG-FL som et nyttig verktøy for analyse av myosis og SUMO-relaterte prosesser i c.elegans og muligens andre nematoder. Mens du utfører fiksering, er det viktig å bruke fersk paraformaldehyd og en kort fikseringstid for å holde SUMO opprinnelig brettet slik at den kan gjenkjennes av KmUTAG. Siden SUMOs tertiære struktur er svært bevart, er det svært sannsynlig at SUMO-varianter fra flere modell- og ikke-modellsystemer kan analyseres med KmUTAG-FL-reagensen.For tiden bruker vi denne romanen fluorescerende SUMO-fangst UTAG protein for å studere funksjonen til SUMO under cellulær stress. Til slutt må du være oppmerksom på at alle trinnene ved hjelp av fikseringsparaformaldehyd skal utføres i en sikkerhetshette for laboratorier, og at denne reagensen må kastes på riktig måte.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identification of Plant Ice-binding Proteins Through Assessment of Ice-recrystallization Inhibition and Isolation Using Ice-affinity Purification

Identifisering av Plant is-bindende proteiner ved å bedømme is-rekrystallisasjon inhibering og isolering ved bruk av is-affinitetsrensing

Ice-binding proteins (IBPs) belong to a family of stress-induced proteins that are synthesized by certain organisms exposed to subzero temperatures. In ...

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.

Vaskemiddel uten lynraske rekonstituering membran proteiner i Lipid Bilayers bruker Fusogenic komplementære-ladet Proteoliposomes.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers ...

Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

Påvisning av vaskemiddel-sensitive interaksjoner mellom membran proteiner

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

How to Quantify the Fraction of Photoactivated Fluorescent Proteins in Bulk and in Live Cells

Hvordan kvantifisere brøkdel av Photoactivated fluorescerende proteiner i Bulk og lever celler

Photoactivatable and -convertible fluorescent proteins (PA-FPs) have been used in fluorescence live-cell microscopy for analyzing the dynamics of cells ...

Fluorescent Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels

Fluorescerende sølv farging av proteiner i polyakrylamid Gels

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide ...

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

Bruk av rekombinant Fusion proteiner i en fluorescerende Protease analysen plattform og deres i-gel-Renaturation

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...

Characterizing Cellular Proteins with In-cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins

Karakterisere cellulære proteiner med i cellfast fotokjemisk oksidasjon av proteiner

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting method used to characterize protein structure and interactions. ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Tverrgående seksjonering av eldre ris (Oryza sativa L.) Kjerner for skanning av elektronmikroskopiavbildning ved hjelp av pipettespisser som immobiliseringsstøtte

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Optimized Incorporation of Alkynyl Fatty Acid Analogs for the Detection of Fatty Acylated Proteins using Click Chemistry

Optimalisert inkorporering av Alkynyl fettsyreanaloger for påvisning av fettakylerte proteiner ved hjelp av klikkkjemi

Fatty acylation, the covalent addition of saturated fatty acids to protein substrates, is important in regulating a myriad of cellular functions in ...

Production of Recombinant PRMT Proteins using the Baculovirus Expression Vector System

Produksjon av rekombinante PRMT-proteiner ved hjelp av Baculovirus Expression Vector System

Protein arginine methyltransferases (PRMTs) methylate arginine residues on a wide variety of proteins that play roles in numerous cellular processes. ...