Name: localization of sumo-modified proteins using fluorescent sumo-trapping proteins
Uploaded: 2019-04-27T15:00:00
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Gostaríamos de agradecer a todos os membros do laboratório Kerscher por seu apoio, Nathalie Nguyen para a leitura crítica do manuscrito, e Lidia EPP para seqüenciamento. Este trabalho tem sido apoiado pelo Commonwealth Research comercialização fundo MF16-034-LS para OK. O apoio à pesquisa para estudantes de W & M foi fornecido pelo fundo de pesquisa Bailey-Huston, e Charles Center Honors bolsas para RY e CH.

1. detecção de SUMO em células de cultura de tecido fixo usando proteína recombinante KmUTAG-FL SUMO-trapping
<ol><li>Cresça as pilhas da cultura do tecido da escolha na tampa redonda de 22 milímetros desliza em placas do TC de 6 poços até 70%-80% confluent. Realize as etapas 1.2 – 1.8 na placa de 6 poços.</li>
	<li>Lave brevemente as células com 1 mL de DPBS (solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco)</li>
	<li>Para fixação, prepare uma solução fresca de solução de paraformaldeído a 4% (PFA...

<ol>
	<li>Kerscher, O., Felberbaum, R., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+proteins+by+ubiquitin+and+ubiquitin-like+proteins.">Modification of proteins by ubiquitin and ubiquitin-like proteins.</a> Cell and Developmental Biology. 22, 159-180 (2006).</li><li>Kerscher, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> SUMOylation. , 1-11 (2016).</li><li>Hay, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO:+a+history+of+modification.">SUMO: a history of modification.</a> Molecular Cell. 18 (1), 1-12 (2005).</li><li>Fu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+SUMO-specific+protease+2+induces+mitochondria+mediated+neurodegeneration.">Disruption of SUMO-specific protease 2 induces mitochondria mediated neurodegeneration.</a> PLoS Genetics. 10 (10), e1004579-e1004579 (2014).</li><li>Zhang, H., Kuai, X., Ji, Z., Li, Z., Shi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Over-expression+of+small+ubiquitin-related+modifier-1+and+sumoylated+p53+in+colon+cancer.">Over-expression of small ubiquitin-related modifier-1 and sumoylated p53 in colon cancer.</a> Cell biochemistry and biophysics. 67 (3), 1081-1087 (2013).</li><li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO-specific+protease+1+promotes+prostate+cancer+progression+and+metastasis.">SUMO-specific protease 1 promotes prostate cancer progression and metastasis.</a> Oncogene. 32 (19), 2493-2498 (2013).</li><li>Karami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+SUMO-Protease+SENP7S+Regulates+&#946;-catenin+Signaling+and+Mammary+Epithelial+Cell+Transformation.">Novel SUMO-Protease SENP7S Regulates &#946;-catenin Signaling and Mammary Epithelial Cell Transformation.</a> Scientific Reports. 7 (1), 46477 (2017).</li><li>Pelisch, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+SUMO-Dependent+Protein+Network+Regulates+Chromosome+Congression+during+Oocyte+Meiosis.">A SUMO-Dependent Protein Network Regulates Chromosome Congression during Oocyte Meiosis.</a> Molecular Cell. 65 (1), 66-77 (2017).</li><li>Zhang, X. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO-2/3+modification+and+binding+regulate+the+association+of+CENP-E+with+kinetochores+and+progression+through+mitosis.">SUMO-2/3 modification and binding regulate the association of CENP-E with kinetochores and progression through mitosis.</a> Molecular Cell. 29 (6), 729-741 (2008).</li><li>Baker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducibility+crisis:+Blame+it+on+the+antibodies.">Reproducibility crisis: Blame it on the antibodies.</a> Nature News. 521 (7552), 274-276 (2015).</li><li>Wang, Z., Prelich, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quality+control+of+a+transcriptional+regulator+by+SUMO-targeted+degradation.">Quality control of a transcriptional regulator by SUMO-targeted degradation.</a> Molecular and Cellular Biology. 29 (7), 1694-1706 (2009).</li><li>Li, S. J., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+protease+required+for+cell-cycle+progression+in+yeast.">A new protease required for cell-cycle progression in yeast.</a> Nature. 398 (6724), 246-251 (1999).</li><li>Peek, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO+targeting+of+a+stress-tolerant+Ulp1+SUMO+protease.">SUMO targeting of a stress-tolerant Ulp1 SUMO protease.</a> PLoS ONE. 13 (1), e0191391 (2018).</li><li>Edgar, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+13+Blastomere+Culture+and+Analysis.">Chapter 13 Blastomere Culture and Analysis.</a> Methods in Cell Biology. 48, 303-321 (1995).</li><li>Pelisch, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+SUMO+modification+regulates+mitotic+chromosome+assembly+and+cell+cycle+progression+in+Caenorhabditis+elegans.">Dynamic SUMO modification regulates mitotic chromosome assembly and cell cycle progression in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Communications. 5 (1), 769 (2014).</li><li>Dillingham, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+single-stranded+DNA+binding+protein+as+a+probe+for+sensitive,+real-time+assays+of+helicase+activity.">Fluorescent single-stranded DNA binding protein as a probe for sensitive, real-time assays of helicase activity.</a> Biophysical Journal. 95 (7), 3330-3339 (2008).</li><li>Ruckman, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2'-Fluoropyrimidine+RNA-based+aptamers+to+the+165-amino+acid+form+of+vascular+endothelial+growth+factor+(VEGF165).+Inhibition+of+receptor+binding+and+VEGF-induced+vascular+permeability+through+interactions+requiring+the+exon+7-encoded+domain.">2'-Fluoropyrimidine RNA-based aptamers to the 165-amino acid form of vascular endothelial growth factor (VEGF165). Inhibition of receptor binding and VEGF-induced vascular permeability through interactions requiring the exon 7-encoded domain.</a> The Journal of Biological Chemistry. 273 (32), 20556-20567 (1998).</li><li>Hughes, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+specific+inhibitors+of+SUMO-1-+and+SUMO-2/3-mediated+protein-protein+interactions+using+Affimer+(Adhiron)+technology.">Generation of specific inhibitors of SUMO-1- and SUMO-2/3-mediated protein-protein interactions using Affimer (Adhiron) technology.</a> Science Signaling. 10 (505), eaaj2005 (2017).</li><li>Lopata, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affimer+proteins+for+F-actin:+novel+affinity+reagents+that+label+F-actin+in+live+and+fixed+cells.">Affimer proteins for F-actin: novel affinity reagents that label F-actin in live and fixed cells.</a> Scientific Reports. 8 (1), 6572 (2018).</li><li>Gilbreth, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoform-specific+monobody+inhibitors+of+small+ubiquitin-related+modifiers+engineered+using+structure-guided+library+design.">Isoform-specific monobody inhibitors of small ubiquitin-related modifiers engineered using structure-guided library design.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (19), 7751-7756 (2011).</li><li>Berndt, A., Wilkinson, K. A., Heimann, M. J., Bishop, P., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+characterization+of+the+properties+of+SUMO1-specific+monobodies.">In vivo characterization of the properties of SUMO1-specific monobodies.</a> Biochemical Journal. 456 (3), 385-395 (2013).</li></ol>

Aqui apresentamos o uso de kmUTAG-FL, uma proteína recombinante, para estudos funcionais de SUMO em células de mamíferos fixas e gônadas de nematódeos dissecados. O KmUTAG-FL é um reagente específico de Pan-SUMO, tolerante ao stress, que reconhece e intercepta proteínas conjugadas de SUMO nativas e cadeias de SUMO. Desde que a estrutura terciária de sumô é altamente conservada é muito provável que as variações de sumô do modelo adicional e dos sistemas do não-modelo possam ser analisadas com o reagente d...

A finalidade deste método é facilitar o estudo e a análise de proteínas SUMO-conjugadas usando a proteína recombinante de SUMO-trapping UTAG ( etiquetado domínio deULP). Como detalhado abaixo, UTAG pode ser usado no lugar de outros reagentes e aproximações para purify, detecta, e visualiza proteínas SUMO-modificadas. Dependendo das condições de crescimento, as células podem conter centenas ou milhares de proteínas que são modificadas com cadeias sumô ou SUMO (para revisão ver Kerscher et al. 2006 e kerscher 20162). Isto representa uma dificuldade considerável para as análises funcionais de proteínas de sumo-modificadas específicas, especialmente porque somente uma fração de um alvo particular da sumoilação é modificada realmente3. Além de seus papéis em processos celulares essenciais, tais como regulação transcricional, homeostase protéica, a resposta ao estresse celular, e remodelação da cromatina durante a mitose e meiose; tornou-se agora suficientemente desobstruído que o sumo, as proteínas sumo-modificadas, e os componentes do caminho do sumo igualmente têm o potencial como biomarcadores para patologias tais como o cancro e desordens neurodegenerativas4,5,6 ,7. Isso ressalta a necessidade de ferramentas robustas, confiáveis e prontamente disponíveis e abordagens inovadoras para a detecção e análise funcional de proteínas SUMO-modificadas em uma variedade de células e amostras.
Em muitos sistemas, os anticorpos de sumo-específicos são os reagentes da escolha para a deteção, a isolação e as análises funcionais deproteínas sumo-modificadas8,9. Entretanto, alguns anticorpos sumô-específicos comercialmente disponíveis são caros, limitados em quantidade ou disponibilidade, propensos a expor afinidades e reatividade cruzada de forma descontroladamente variável e, em alguns casos, falta de reprodutibilidade10. Uma abordagem alternativa é a expressão do epítopo mapeado-Tagged sumo em células transformadas e organismos, mas ligando epítopo Tags para sumo pode artificialmente diminuir a sua conjugação de alvos de proteínas11. Adicionalmente, os epítopos não são úteis quando as células ou tecidos não transformados são avaliados.
Ulp1 é uma protease de SUMO conservada de S. cerevisiae que processa o precursor de sumo e desumoylates proteínas CONJUGADAS com sumo-12. Nós desenvolvemos o reagente de utag baseado na observação serendipitous que uma mutação da cisteína catalítica (C580S) em Ulp1's sumo que processa ULP domínio (UD) não somente impede a segmentação de sumô mas igualmente prende proteínas sumo-conjugadas com a elevação avidez12. Para simplificar, nós nos referimos a este fragmento carboxy-terminal SUMO-aprisionamento Ulp1 (C580S) como UTAG (abreviada para UD TAG). UTAG é uma proteína de aprisionamento de Pan-SUMO recombinante que representa uma alternativa útil aos anticorpos anti-SUMO utilizados para o isolamento e detecção de proteínas SUMO-modificadas. Importante, ele especificamente reconhece nativamente dobrado, conjugada sumo e não apenas um ou vários epítopos no sumo. Para melhorar a estabilidade da proteína e a força obrigatória de SUMO de UTAG, nós geramos uma variação de UTAG do fermento stress-tolerante Kluyveromyces marxianus (quilômetro). A KmUTAG liga firmemente os conjugados sumô com a afinidade nanomolares13. Adicionalmente, kmUTAG é resistente a temperaturas elevadas (42 ° c), agentes redutores (5 mM TCEP-tris (2-carboxietil) cloridrato de fosfina), desnaturantes (até 2 M de ureia), agentes oxidantes (0,6% de peróxido de hidrogênio) e detergentes não iônicos. Esta tolerância ao stress é benéfica durante a condição de purificação dura e tempos de incubação prolongados, assegurando a sua estabilidade e atividade de captura de sumô. Não surpreendentemente, no entanto, a atividade do KmUTAG SUMO-trapping é incompatível com reagentes modificadores da cisteína, detergentes iônicos e extratos proteicos totalmente desnaturados. A afinidade e as propriedades notáveis de KmUTAG indicam que este reagente pode se tornar parte do repertório padrão para o estudo de proteínas sumoylated em espécies múltiplas.
Aqui nós fornecemos um método simples para detectar proteínas sumo-modificadas em pilhas de mamíferos e nematóides usando uma proteína de fusão fluorescente mcherry-kmutag de recombinação (kmutag-FL).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Well Cell Culture Plates</td>
			<td>Genesee Scientific/Olympus Plastics</td>
			<td>25-105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-545-003</td>
			<td>Used as a secondary antibody for mouse monoclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Gibco 14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dylight 488 conjugated AffiniPure Goat Anti-Moue IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-485-146</td>
			<td>Used as a secondary antibody for mouse monoclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Coverglass for Growth Cover Glasses</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12545101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLUORO-GEL II with DAPI</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>50-246-93)</td>
			<td>Mounting media in step 1.11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLUORO-GEL with DABCO</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>17985-02</td>
			<td>With DAPI added to 1 &#181;g/mL; mounting media in step 2.2.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine-HCl</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP3815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine-HCl</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>6000-43-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KmUTAG-fl</td>
			<td>Kerafast</td>
			<td></td>
			<td>KmUTAG reagents are available on Kerafast.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oneblock Western-CL blocking buffer</td>
			<td>Prometheus</td>
			<td>20-313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, Phosphate Buffered Saline, 10X Solution</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP3994</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNT2 cell line</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>95012613</td>
			<td>Normal prostate epithelium immortalized with SV40.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSPOT1</td>
			<td>(ChromoTek GmbH)</td>
			<td>ev-1</td>
			<td>https://www.chromotek.com/fileadmin/user_upload/pdfs/Datasheets/pSpot1_v1.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUMO 6F2</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>SUMO 6F2</td>
			<td>SUMO 6F2 was deposited to the DSHB by Pelisch, F. / Hay, R.T. (DSHB Hybridoma Product SUMO 6F2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUMO protease buffer [10x]</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>500 mM Tris-HCl, pH 8.0, 2% NP-40, 1.5 M NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUMO-2 Antibody 8A2</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>SUMO-2 8A2</td>
			<td>SUMO-2 8A2 was deposited to the DSHB by Matunis, M. (DSHB Hybridoma Product SUMO-2 8A2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP-HCL</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>51805-45-9</td>
			<td>Used as a reducing agent at a concentration of 5mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>Used for permeablization at 0.1% in DPBS/PBS(for worms)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

localization of sumo-modified proteins using fluorescent sumo-trapping proteins

Aqui nós estamos apresentando um método novo estudar a sumoilação das proteínas e sua localização Subcellular em pilhas de mamíferos e em oocytes do nematóide. Este método utiliza um fragmento de proteína de SUMO-aprisionamento modificado recombinante, kmUTAG, derivado do Ulp1 SUMO protease da levedura de brotamento tolerante ao estresse Kluyveromyces marxianus. Nós adaptamos as propriedades do kmutag com a finalidade de estudar a sumoilação em uma variedade de sistemas modelo sem o uso dos anticorpos. Para o estudo de SUMO, KmUTAG tem várias vantagens quando comparada com abordagens baseadas em anticorpos. Este reagente stress-tolerante do SUMO-aprisionamento é produzido recombinantly, reconhece isoformas de SUMO nativos de muitas espécies, e ao contrário dos anticorpos comercialmente disponíveis mostra a afinidade reduzida para o SUMO livre, Unconjugated. Os resultados representativos mostrados aqui incluem a localização de conjugados de sumo em pilhas da cultura de mamíferos do tecido e em oocytes do nematóide.

KmUTAG-FL é um recombinante, mCherry-Tagged SUMO-trapping proteína. Para a produção de kmUTAG-FL, clonamos um mCherry-kmUTAG otimizado para o Codon no plasmídeo de superexpressão bacteriana pSPOT1 (Figura 1). Após a indução, a proteína kmUTAG-FL foi purificada em armadilha Spot, eluída e congelada até uso posterior. Para garantir a atividade de armadilhagem de sumô de KmUTAG-FL, confirmamos a ligação a grânulos conjugados com SUMO1 e precipita...

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Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

SUMO é um essencial e altamente conservado, pequena ubiquitina-like modificador de proteína. Neste protocolo nós estamos descrevendo o uso de uma proteína de SUMO-aprisionamento recombinante stress-tolerante (kmUTAG) para visualizar os conjugados nativos, Untagged de SUMO e sua localização em uma variedade de tipos da pilha.

Localização de proteínas SUMO-modificadas usando proteínas de captura de sumo fluorescentes

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...

O significado deste protocolo é o uso de uma nova proteína UTAG fluorescente de captura de SUM PARA a detecção do modificador de proteína SUM em várias células eucarióticas. A principal vantagem desta técnica é um protocolo simples para a detecção sem anticorpos de SUM em uma variedade de células, incluindo cultura de tecido mamífero e gônnadas nematoides. O SUM SUM desempenha papéis importantes em câncer e distúrbios neurodegenerativos, e isso reforça a necessidade de ferramentas robustas e confiáveis para a detecção e análise funcional de proteínas modificadas por SUM.Como o SUM é altamente conservado, a proteína UTAG fluorescente de captura de SUMh pode ser usada para rotular o SUM conjugado em muitos organismos diferentes. Este vídeo demonstra seu uso em células de mamíferos. Além disso, o texto completo descreve seu uso em oócitos nematode.A demonstração visual desta técnica fornece dicas críticas para o tratamento das células antes da coloração e detecção de SUMÔ. Para começar, cresça células de cultura tecidual escolhidas em deslizamentos de cobertura redonda de 22 milímetros em placas TC de seis poços até 70 a 80% de confluentes. Lave as células brevemente com um mililitro de DPBS.Para corrigir as células, adicione dois mililitros de PFA fresco de 4%e DPBS a cada poço. Incubar as células por 20 minutos em temperatura ambiente. Lave as células fixas três vezes durante cinco minutos em um mililitro de DPBS enquanto emcrusta a placa.Para permeabiliizar as células, incubar por 15 minutos com 1%Triton X-100 em DPBS. Lave as células de novo, como antes. Incubar as células com 500 microliters de 1 molar glycine HCL pH 2 por 10 segundos.Em seguida, neutralize o pH imediatamente com 500 microliters de 10X SUMO Protease buffer, ou SPB. Depois de lavar as células como antes, remova os deslizamentos de cobertura do poço e coloque-as em uma câmara de umidade. Apenas para a coloração UTAG-FL, misture um micrograma de UTAG-FL com 100 microliters de 1X SPB contendo cinco mililitros de TCEP em um tubo.Em seguida, pipete a mistura sobre as células no deslizamento de cobertura e incubar à temperatura ambiente por uma hora na câmara de umidade. Para lavar os deslizamentos de cobertura, pipeta 200 microliters de DPBS em cada deslizamento de cobertura e deixar no lugar por 10 minutos. Repita a lavagem mais duas vezes.Remova os deslizamentos de cobertura da última lavagem e inverta em um slide de microscopia pré-limpo com uma gota de meio de montagem. Armazene as amostras durante a noite em um congelador de 20 graus Celsius antes de visualizar sob o microscópio. Visualize as células usando os conjuntos de filtros apropriados para DAPI e Texas Red.Consulte o texto completo para um protocolo sobre como rotular SUM e gôndeas nematoides fixas. Embora rotular células de mamíferos seja bastante simples, rotular oócitos nematode requer treinamento prévio em dissecções de gônada. KmUTAG-FL incubado com células PMT2 fixas mostrou uma mancha nuclear distinta.Tanto a coloração nuclear difusa quanto os focos nucleares distintos eram visíveis. A localização nuclear foi confirmada por meio de co-coloração com DAPI. Consistente com a atividade de captura de SUMÔ da KmUTAG-FL, o padrão de localização nuclear era uma reminiscência da coloração SUMO23.A co-coloração com anticorpo anti-SUMO23 8A2 confirmou a co-localização do KmUTAG-FL com o sinal SUMO23. Isso valida a eficácia do KmUTAG-FL para detectar SUMO23 em células de mamíferos. Gônnadas isoladas da hermafrodita adulta produtora de oócito c.nematoides elegans foram rotulados com anticorpo anti-SUM. Consistente com relatórios anteriores, anticorpo anti-SUM inicialmente localizado ao plasmo nuclear de oócitos de prophase mioticos tardios. Ele então redistribuiu para o complexo de anel central dos homólogos emparelhados como o envelope nuclear quebrou e os cromossomos congressos em direção à placa de metafásico.Em preparações paralelas, gônadas rotuladas com KmUTAG-FL revelaram padrões semelhantes. KmUTAG-FL passou de rotular o nucleoplasma para concentrar-se no complexo do anel quando os oócitos começaram e concluíram o processo de quebra do envelope nuclear. Esses resultados validam o KmUTAG-FL como uma ferramenta útil para a análise de processos relacionados à mísia e sumô em c.elegans e possivelmente outros nematoides. Ao realizar a fixação, é fundamental usar paraformaldeído fresco e um curto tempo de fixação para manter o SUMO dobrado nativamente para que possa ser reconhecido pelo KmUTAG. Uma vez que a estrutura terciária do SUMO é altamente conservada, é muito provável que as variantes SUMO de modelos adicionais e sistemas não-modelo possam ser analisadas com o reagente KmUTAG-FL.Atualmente, estamos usando esta nova proteína UTAG fluorescente para estudar a função de SUM durante o estresse celular. Por fim, observe que todas as etapas que utilizam o paraformaldeído fixante devem ser realizadas em uma capa de segurança de laboratório e este reagente deve ser descartado corretamente.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identification of Plant Ice-binding Proteins Through Assessment of Ice-recrystallization Inhibition and Isolation Using Ice-affinity Purification

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Ice-binding proteins (IBPs) belong to a family of stress-induced proteins that are synthesized by certain organisms exposed to subzero temperatures. In ...

Bioquímica

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.

Livre de detergente ultra reconstituição das proteínas de membrana em lípidos Bilayers usando Fusogenic Proteoliposomes complementares carregada.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers ...

Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

Deteção de detergente sensíveis interações entre proteínas de membrana

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How to Quantify the Fraction of Photoactivated Fluorescent Proteins in Bulk and in Live Cells

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Fluorescent Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels

Coloração fluorescente de prata das proteínas em gel de poliacrilamida

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide ...

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

Utilização de proteínas recombinantes de fusão em uma plataforma de ensaio de Protease fluorescente e sua renaturalização em-gel

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...

Characterizing Cellular Proteins with In-cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins

Caracterização de proteínas celulares com oxidação fotoquímica rápida de proteínas

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting method used to characterize protein structure and interactions. ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Secção Transversa de Arroz Maduro (Oryza sativa L.) Kernels para digitalização de imagens de microscopia eletrônica usando dicas de pipeta como suporte à imobilização

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Optimized Incorporation of Alkynyl Fatty Acid Analogs for the Detection of Fatty Acylated Proteins using Click Chemistry

Incorporação otimizada de Análogos de Ácido Graxo Alkynyl para a detecção de proteínas aciclantes gordurosas usando a Química do Clique

Fatty acylation, the covalent addition of saturated fatty acids to protein substrates, is important in regulating a myriad of cellular functions in ...

Production of Recombinant PRMT Proteins using the Baculovirus Expression Vector System

Produção de Proteínas PRMT Recombinantes utilizando o Sistema Vetorial de Expressão baculovírus

Protein arginine methyltransferases (PRMTs) methylate arginine residues on a wide variety of proteins that play roles in numerous cellular processes. ...