Name: localization of sumo-modified proteins using fluorescent sumo-trapping proteins
Uploaded: 2019-04-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins at JoVE.com

Мы хотели бы поблагодарить всех членов лаборатории Кершера за их поддержку, Натали Нгуен для критического чтения рукописи, и Лидия ЭПР для секвенирования. Эта работа была поддержана Фондом коммерциализации исследований Содружества MF16-034-LS в OK. Исследовательская поддержка для студентов W & M была предоставлена Фондом научных исследований Бейли-Хьюстон, а Карлов центр чтит стипендии RY и CH.

1. Обнаружение сумо в клетках культуры фиксированной ткани с использованием рекомбинантного белка сумо KmUTAG-FL
<ol><li>Выращивать ткань культуры клетки выбора на 22 мм круглый крышка скользит в 6-хорошо TC пластин до 70%-80% свободно. Выполните шаги 1.2-1.8 в 6-хорошо пластины.</li>
	<li>Мойте клетки крат?...

<ol>
	<li>Kerscher, O., Felberbaum, R., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+proteins+by+ubiquitin+and+ubiquitin-like+proteins.">Modification of proteins by ubiquitin and ubiquitin-like proteins.</a> Cell and Developmental Biology. 22, 159-180 (2006).</li><li>Kerscher, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> SUMOylation. , 1-11 (2016).</li><li>Hay, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO:+a+history+of+modification.">SUMO: a history of modification.</a> Molecular Cell. 18 (1), 1-12 (2005).</li><li>Fu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+SUMO-specific+protease+2+induces+mitochondria+mediated+neurodegeneration.">Disruption of SUMO-specific protease 2 induces mitochondria mediated neurodegeneration.</a> PLoS Genetics. 10 (10), e1004579-e1004579 (2014).</li><li>Zhang, H., Kuai, X., Ji, Z., Li, Z., Shi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Over-expression+of+small+ubiquitin-related+modifier-1+and+sumoylated+p53+in+colon+cancer.">Over-expression of small ubiquitin-related modifier-1 and sumoylated p53 in colon cancer.</a> Cell biochemistry and biophysics. 67 (3), 1081-1087 (2013).</li><li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO-specific+protease+1+promotes+prostate+cancer+progression+and+metastasis.">SUMO-specific protease 1 promotes prostate cancer progression and metastasis.</a> Oncogene. 32 (19), 2493-2498 (2013).</li><li>Karami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+SUMO-Protease+SENP7S+Regulates+&#946;-catenin+Signaling+and+Mammary+Epithelial+Cell+Transformation.">Novel SUMO-Protease SENP7S Regulates &#946;-catenin Signaling and Mammary Epithelial Cell Transformation.</a> Scientific Reports. 7 (1), 46477 (2017).</li><li>Pelisch, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+SUMO-Dependent+Protein+Network+Regulates+Chromosome+Congression+during+Oocyte+Meiosis.">A SUMO-Dependent Protein Network Regulates Chromosome Congression during Oocyte Meiosis.</a> Molecular Cell. 65 (1), 66-77 (2017).</li><li>Zhang, X. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO-2/3+modification+and+binding+regulate+the+association+of+CENP-E+with+kinetochores+and+progression+through+mitosis.">SUMO-2/3 modification and binding regulate the association of CENP-E with kinetochores and progression through mitosis.</a> Molecular Cell. 29 (6), 729-741 (2008).</li><li>Baker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducibility+crisis:+Blame+it+on+the+antibodies.">Reproducibility crisis: Blame it on the antibodies.</a> Nature News. 521 (7552), 274-276 (2015).</li><li>Wang, Z., Prelich, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quality+control+of+a+transcriptional+regulator+by+SUMO-targeted+degradation.">Quality control of a transcriptional regulator by SUMO-targeted degradation.</a> Molecular and Cellular Biology. 29 (7), 1694-1706 (2009).</li><li>Li, S. J., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+protease+required+for+cell-cycle+progression+in+yeast.">A new protease required for cell-cycle progression in yeast.</a> Nature. 398 (6724), 246-251 (1999).</li><li>Peek, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO+targeting+of+a+stress-tolerant+Ulp1+SUMO+protease.">SUMO targeting of a stress-tolerant Ulp1 SUMO protease.</a> PLoS ONE. 13 (1), e0191391 (2018).</li><li>Edgar, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+13+Blastomere+Culture+and+Analysis.">Chapter 13 Blastomere Culture and Analysis.</a> Methods in Cell Biology. 48, 303-321 (1995).</li><li>Pelisch, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+SUMO+modification+regulates+mitotic+chromosome+assembly+and+cell+cycle+progression+in+Caenorhabditis+elegans.">Dynamic SUMO modification regulates mitotic chromosome assembly and cell cycle progression in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Communications. 5 (1), 769 (2014).</li><li>Dillingham, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+single-stranded+DNA+binding+protein+as+a+probe+for+sensitive,+real-time+assays+of+helicase+activity.">Fluorescent single-stranded DNA binding protein as a probe for sensitive, real-time assays of helicase activity.</a> Biophysical Journal. 95 (7), 3330-3339 (2008).</li><li>Ruckman, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2'-Fluoropyrimidine+RNA-based+aptamers+to+the+165-amino+acid+form+of+vascular+endothelial+growth+factor+(VEGF165).+Inhibition+of+receptor+binding+and+VEGF-induced+vascular+permeability+through+interactions+requiring+the+exon+7-encoded+domain.">2'-Fluoropyrimidine RNA-based aptamers to the 165-amino acid form of vascular endothelial growth factor (VEGF165). Inhibition of receptor binding and VEGF-induced vascular permeability through interactions requiring the exon 7-encoded domain.</a> The Journal of Biological Chemistry. 273 (32), 20556-20567 (1998).</li><li>Hughes, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+specific+inhibitors+of+SUMO-1-+and+SUMO-2/3-mediated+protein-protein+interactions+using+Affimer+(Adhiron)+technology.">Generation of specific inhibitors of SUMO-1- and SUMO-2/3-mediated protein-protein interactions using Affimer (Adhiron) technology.</a> Science Signaling. 10 (505), eaaj2005 (2017).</li><li>Lopata, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affimer+proteins+for+F-actin:+novel+affinity+reagents+that+label+F-actin+in+live+and+fixed+cells.">Affimer proteins for F-actin: novel affinity reagents that label F-actin in live and fixed cells.</a> Scientific Reports. 8 (1), 6572 (2018).</li><li>Gilbreth, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoform-specific+monobody+inhibitors+of+small+ubiquitin-related+modifiers+engineered+using+structure-guided+library+design.">Isoform-specific monobody inhibitors of small ubiquitin-related modifiers engineered using structure-guided library design.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (19), 7751-7756 (2011).</li><li>Berndt, A., Wilkinson, K. A., Heimann, M. J., Bishop, P., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+characterization+of+the+properties+of+SUMO1-specific+monobodies.">In vivo characterization of the properties of SUMO1-specific monobodies.</a> Biochemical Journal. 456 (3), 385-395 (2013).</li></ol>

Здесь мы вводим использование kmUTAG-FL, рекомбинантного белка, для функциональных исследований сумо в стационарных клетках млекопитающих и расчлененных гомелях. KmUTAG-FL является стресс-терпимым Пан-сумо конкретных реагентов, что признает и ловушки родной сумо-спрятаных белков и сумо цепей...

Цель этого метода состоит в том, чтобы облегчить изучение и анализ белков сумо-спряга с использованием рекомбинантной белки, удерживающей захват сумо UTAG (ULP доменного тега). Как описано ниже, UTAG может использоваться вместо других реагентов и подходов для очищения, обнаружения и визуализации сумо-модифицированных белков. В зависимости от условий роста, клетки могут содержать сотни или тысячи белков, которые модифицированы с сумо или сумо цепей (для обзора см. Kerscher et al. 20061 и кершер 20162). Это представляет значительные трудности для функционального анализа конкретных сумо-модифицированных белков, тем более, что только часть конкретной цели фосфорилировании фактически изменены3. В дополнение к их роли в основных клеточных процессов, таких как транскрипционного регулирования, белка гомеостаза, ответ на клеточный стресс, и хроматина ремоделирования во время митоза и мейоз; Теперь стало достаточно ясно, что сумо, сумо-модифицированных белков и компонентов сумо пути также имеют потенциал в качестве биомаркеров для патологий, таких как рак и нейродегенеративных расстройств4,5,6 ,7. Это подчеркивает необходимость надежных, надежных и легко доступных инструментов и инновационных подходов для обнаружения и функционального анализа сумо-модифицированных белков в различных клетках и образцах.
Во многих системах антитела, специфическая для сумо, являются реагентами выбора для обнаружения, изоляции и функционального анализа сумо-модифицированных белков8,9. Однако, некоторые коммерчески доступные сумо-специфические антитела дорогие, ограниченные по количеству или доступности, склонные выставлять дико переменные сходства и перекрестную реактивность, и в некоторых случаях отсутствие воспроизводимости10. Одним из альтернативных подходов является выражение эпитопа-тегами сумо в трансформированных клетках и организмах, но связывая Теги эпитопа к сумо может искусственно понизить его сопряжение с целями протеина11. Кроме того, эпитопы не полезны при оценке нетрансформиенных клеток или тканей.
Ulp1 является консервативным протеазы сумо из с. цервиии, что оба процесса прекурсоров сумо и desumoylates сумо-спрягается белки12. Мы разработали реагента UTAG на основе счастливого наблюдения, что мутация каталитического цистеина (C580S) в Ulp1's сумо ULP domain (UD) не только предотвращает расщепление сумо, но и ловушки сумо-спрягается белков с высоким Жадность12. Для простоты, мы ссылались на этот карквадратные терминала сумо Ulp1 (C580S) фрагмент как UTAG (короткий для UD TAG). UTAG является рекомбинантной Пан-сумо улавливания белка, который представляет собой полезную альтернативу анти-сумо антител, используемых для изоляции и обнаружение сумо-модифицированных белков. Важно отметить, что он специально признает, изначально сложенный, спрягается сумо, а не только один или несколько эпитопов на сумо. Для улучшения как белка стабильности и силы сумо связывания UTAG, мы породили вариант UTAG из стрессоустойчивых дрожжей Клюйверомика marxianus (km). KmUTAG плотно связывает сумо-спрятаврат с наносолнечной сродство13. Кроме того, kmUTAG устойчив к повышенным температурам (42 ° с), уменьшающих агенты (5 мм ТВИС-РИЦ (2-карбокезил) фосфин гидрохлорид), денатуранты (до 2 м мочевины), окисляющие вещества (0,6% перекиси водорода) и неионные моющие средства. Этот стресс терпимости выгодно во время суровых условиях очистки и длительное время инкубации, обеспечивая его стабильность и сумо-захвата деятельности. Не удивительно, однако, KmUTAG в сумо-захвата деятельность несовместима с цистеин-модификации реагентов, ионные моющие средства и полностью денатурированного белка экстрактов. Замечательное сходство и свойства KmUTAG показывают, что этот реагент может стать частью стандартного репертуара для исследования sumoylated белков в нескольких видов.
Здесь мы предоставляем простой метод для обнаружения сумо-модифицированных белков в клетках млекопитающих и нематод с использованием рекомбинантного флуоресцентный белок-KmUTAG Fusion белка (kmUTAG-FL).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Well Cell Culture Plates</td>
			<td>Genesee Scientific/Olympus Plastics</td>
			<td>25-105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-545-003</td>
			<td>Used as a secondary antibody for mouse monoclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Gibco 14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dylight 488 conjugated AffiniPure Goat Anti-Moue IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-485-146</td>
			<td>Used as a secondary antibody for mouse monoclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Coverglass for Growth Cover Glasses</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12545101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLUORO-GEL II with DAPI</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>50-246-93)</td>
			<td>Mounting media in step 1.11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLUORO-GEL with DABCO</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>17985-02</td>
			<td>With DAPI added to 1 &#181;g/mL; mounting media in step 2.2.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine-HCl</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP3815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine-HCl</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>6000-43-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KmUTAG-fl</td>
			<td>Kerafast</td>
			<td></td>
			<td>KmUTAG reagents are available on Kerafast.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oneblock Western-CL blocking buffer</td>
			<td>Prometheus</td>
			<td>20-313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, Phosphate Buffered Saline, 10X Solution</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP3994</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNT2 cell line</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>95012613</td>
			<td>Normal prostate epithelium immortalized with SV40.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSPOT1</td>
			<td>(ChromoTek GmbH)</td>
			<td>ev-1</td>
			<td>https://www.chromotek.com/fileadmin/user_upload/pdfs/Datasheets/pSpot1_v1.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUMO 6F2</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>SUMO 6F2</td>
			<td>SUMO 6F2 was deposited to the DSHB by Pelisch, F. / Hay, R.T. (DSHB Hybridoma Product SUMO 6F2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUMO protease buffer [10x]</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>500 mM Tris-HCl, pH 8.0, 2% NP-40, 1.5 M NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUMO-2 Antibody 8A2</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>SUMO-2 8A2</td>
			<td>SUMO-2 8A2 was deposited to the DSHB by Matunis, M. (DSHB Hybridoma Product SUMO-2 8A2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP-HCL</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>51805-45-9</td>
			<td>Used as a reducing agent at a concentration of 5mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>Used for permeablization at 0.1% in DPBS/PBS(for worms)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

localization of sumo-modified proteins using fluorescent sumo-trapping proteins

Здесь мы представляем новый метод изучения фосфорилировании белков и их суб-клеточной локализации в клетках млекопитающих и не, ооцитов. Этот метод использует рекомбинантные изменения сумо захвата белка фрагмент, kmUTAG, производные от Ulp1 сумо протеазы стресс-терпимой многообещающий дрожжей Клюйверомика marxianus. Мы адаптировали свойства kmUTAG с целью изучения сумоилирования в различных модельных системах без применения антител. Для изучения сумо, KmUTAG имеет несколько преимуществ по сравнению с антителами на основе подходов. Этот стресс-терпимый сумо-захвата реагента производится рекомбинантли, он признает родной сумо изоформы от многих видов, и в отличие от коммерчески доступных антител он показывает снижение сродство для свободного, неприпрянепрямой сумо. Репрезентативные результаты, показанные здесь, включают локализацию контургейтов сумо в клетках культуры млекопитающих и немелях ооцитов.

KmUTAG-FL является рекомбинантной, mCherry-меткой сумо-улавливания белка. Для производства kmUTAG-FL, мы клонировали Codon-оптимизированный mCherry-kmUTAG в pSPOT1 бактериального Сверхэкспрессия плазмид (рис. 1). После индукции, протеин kmUTAG-FL был очищен на Spot-ЛОВУШКЕ, увял, и за?...

Watch this Scientific Journal Video about Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins at JoVE.com

Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

Сумо является важным и очень консервативны, Малый убиквитин-как модификатор белка. В этом протоколе мы описываем использование устойчивых к стрессу рекомбинантного белка-улавливания сумо (kmUTAG) для визуализации родных, незамаркированных спрятаных концентов сумо и их локализации в различных типах клеток.

Локализация сумо-модифицированных белков с использованием флуоресцентного сумо-улавливания белков

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...

Значение этого протокола заключается в использовании нового флуоресцентного белка SUMO-ловушки UTAG для обнаружения белкового модификатора SUMO в различных эукариотических клетках. Основным преимуществом этого метода является простой протокол для обнаружения SUMO без антител в различных клетках, включая культуру тканей млекопитающих и нематодные гонады. SUMO играет важную роль в раковых и нейродегенеративных расстройствах, и это подчеркивает необходимость надежных и надежных инструментов для обнаружения и функционального анализа сумо-модифицированных белков.Поскольку SUMO очень сохраняется, флуоресцентный белок UTAG, улавливАющий SUMO, может быть использован для обозначения конъюгированных СУМО во многих различных организмах. Это видео демонстрирует его использование в клетках млекопитающих. Кроме того, полный текст описывает его использование в нематодных ооцитах.Визуальная демонстрация этого метода дает критические подсказки для лечения клеток до окрашивания и обнаружения СУМО. Для начала вырастите клетки культуры тканей выбора на 22-миллиметровой круглой крышке скользит в шести-хорошо TC пластин до 70 до 80% стечения. Вымойте клетки кратко с одним миллилитров DPBS.Чтобы исправить клетки, добавьте два миллилитров свежих 4%PFA и DPBS к каждому хорошо. Инкубировать клетки в течение 20 минут при комнатной температуре. Вымойте фиксированные клетки три раза в течение пяти минут в один миллилитр DPBS при гайке пластины.Чтобы пронизать клетки, инкубировать в течение 15 минут с 1%Triton X-100 в DPBS. Вымойте клетки снова, как и раньше. Инкубировать клетки с 500 микролитров 1 молярного глицина HCL pH 2 в течение 10 секунд.Затем немедленно нейтрализуем рН с помощью 500 микролитров буфера 10X SUMO Protease или SPB. После мытья клеток, как и прежде, удалить крышку скользит из дома и поместить их в камеру влажности. Только для окрашивания UTAG-FL смешайте один микрограмм UTAG-FL со 100 микролитров 1X SPB, содержащими пять миллимоляров TCEP в трубке.Затем, пипетка смесь на клетки на крышке скольжения и инкубировать при комнатной температуре в течение одного часа в камере влажности. Чтобы вымыть крышку скользит, пипетка 200 микролитров DPBS на каждой крышке скольжения и оставить на месте в течение 10 минут. Повторите стирку еще два раза.Удалите крышку скользит от последней стирки и инвертировать на предварительно очищенные микроскопии слайд с каплей монтажа среды. Храните образцы на ночь в морозильной камере 20 градусов по Цельсию перед просмотром под микроскопом. Визуализуйте ячейки с помощью соответствующих наборов фильтров для DAPI и Texas Red.Пожалуйста, смотрите полный текст протокола о том, как маркировать SUMO и фиксированные нематодные гонады. Хотя маркировка клеток млекопитающих довольно проста, маркировка нематодных яйцеклеток требует предварительной подготовки в гонадных вскрытиях. KmUTAG-FL, инкубированный фиксированными клетками PMT2, показал отчетливое ядерное окрашивание.Были видны как диффузные ядерные окрашивания, так и различные ядерные очаги. Ядерная локализация была подтверждена с использованием совместного окрашивания с DAPI. В соответствии с деятельностью СУМО по захвату Кмутаг-FL, модель локализации ядерного оружия напоминала окрашивание SUMO23.Совместное окрашивание анти-SUMO23 8A2 антителом подтвердило коа локализацию KmUTAG-FL с сигналом SUMO23. Это подтверждает эффективность KmUTAG-FL для обнаружения SUMO23 в клетках млекопитающих. Изолированные гонады от яйцеклеток, производящих взрослый гермафродит c.нематоды elegans были помечены антителами против СУМО. В соответствии с предыдущими докладами, антитела против СУМО первоначально локализованы в ядерной плазме поздних миотических ооцитов профазы. Затем он перераспределялся в центральный кольцевой комплекс парных омологов, когда ядерный конверт сломался и хромосомы примыкались к метафазной пластине.Параллельно с подготовкой гонады, помеченные kmUTAG-FL, выявили аналогичные закономерности. KmUTAG-FL перешла от маркировки нуклеоплазмы к концентрации на кольцевом комплексе, как яйцеклетки начали и завершили процесс распада ядерного конверта. Эти результаты подтверждают KmUTAG-FL в качестве полезного инструмента для анализа миоза и процессов, связанных с СУМО в c.elegans и, возможно, другие нематоды. При выполнении фиксации крайне важно использовать свежий параформальдегид и короткое время фиксации, чтобы сохранить СУМО в штатном состоянии, чтобы его можно было распознать в КмУТАГ. Поскольку третичная структура SUMO очень сохраняется, весьма вероятно, что варианты SUMO из дополнительных модельных и не моделных систем могут быть проанализированы с помощью реагента KmUTAG-FL.В настоящее время мы используем этот роман флуоресцентных SUMO-ловушки UTAG белка для изучения функции СУМО во время клеточного стресса. Наконец, обратите внимание, что все шаги с использованием фиксаторного параформальдегида должны выполняться в лабораторном защитном капюшоне, и этот реагент должен быть утилизирован должным образом.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identification of Plant Ice-binding Proteins Through Assessment of Ice-recrystallization Inhibition and Isolation Using Ice-affinity Purification

Идентификация растений ледово-связывающих белков путем оценки льда рекристаллизации ингибирования и выделение с помощью льда-аффинной очистки

Ice-binding proteins (IBPs) belong to a family of stress-induced proteins that are synthesized by certain organisms exposed to subzero temperatures. In ...

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.

Моющее бесплатно сверхскоростной воссоздание мембранных белков в липидных бислоев с помощью дополнительных заряженные Proteoliposomes Fusogenic.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers ...

Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

Обнаружение моющих средств чувствительных взаимодействия между мембранные белки

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

How to Quantify the Fraction of Photoactivated Fluorescent Proteins in Bulk and in Live Cells

Как определить долю флуоресцентных белков Photoactivated навалом и в живых клеток

Photoactivatable and -convertible fluorescent proteins (PA-FPs) have been used in fluorescence live-cell microscopy for analyzing the dynamics of cells ...

Fluorescent Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels

Люминесцентные серебряные пятная белков в полиакриламидных гелей

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide ...

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

Использование рекомбинантных Fusion белков в платформу Assay флуоресцентные протеазы и их выемка в гель

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...

Characterizing Cellular Proteins with In-cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins

Характеристика клеточных белков с в-клеточной быстрой фотохимической окисления белков

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting method used to characterize protein structure and interactions. ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Поперечное секционирование зрелого риса (Oryza sativa L.) Ядра для сканирующей электронной микроскопии с использованием наконечников пипеток в качестве поддержки иммобилизации

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Optimized Incorporation of Alkynyl Fatty Acid Analogs for the Detection of Fatty Acylated Proteins using Click Chemistry

Оптимизированное включение аналогов алкиниловых жирных кислот для обнаружения жирных ацилированных белков с помощью Click Chemistry

Fatty acylation, the covalent addition of saturated fatty acids to protein substrates, is important in regulating a myriad of cellular functions in ...

Production of Recombinant PRMT Proteins using the Baculovirus Expression Vector System

Производство рекомбинантных белков PRMT с использованием векторной системы экспрессии бакуловируса

Protein arginine methyltransferases (PRMTs) methylate arginine residues on a wide variety of proteins that play roles in numerous cellular processes. ...