Name: localization of sumo-modified proteins using fluorescent sumo-trapping proteins
Uploaded: 2019-04-27T15:00:00
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Nos gustaría agradecer a todos los miembros del laboratorio Kerscher por su apoyo, Nathalie Nguyen para la lectura crítica del manuscrito, y Lidia EPP para la secuenciación. Este trabajo ha sido apoyado por el fondo de comercialización de investigación de la Commonwealth MF16-034-LS a OK. El apoyo a la investigación para los estudiantes de W & M fue proporcionado por el fondo de investigación Bailey-Huston, y el Charles Center Honors becas a RY y CH.

1. detección de SUMO en células de cultivo de tejido fijo utilizando proteína de captura de SUMO KmUTAG-FL recombinante
<ol><li>Crecen las células de cultivo de tejido de elección en los resbalones redondos de 22 mm en placas TC de 6-Well hasta 70% – 80% confluentes. Realice los pasos 1.2 – 1.8 en la placa de 6-well.</li>
	<li>Lave brevemente las células con 1 mL de DPBS (solución salina amortiguada con fosfato de Dulbecco)</li>
	<li>Para la fijación, prepare una solución fresca de 4% de solución de paraf...

<ol>
	<li>Kerscher, O., Felberbaum, R., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+proteins+by+ubiquitin+and+ubiquitin-like+proteins.">Modification of proteins by ubiquitin and ubiquitin-like proteins.</a> Cell and Developmental Biology. 22, 159-180 (2006).</li><li>Kerscher, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> SUMOylation. , 1-11 (2016).</li><li>Hay, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO:+a+history+of+modification.">SUMO: a history of modification.</a> Molecular Cell. 18 (1), 1-12 (2005).</li><li>Fu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+SUMO-specific+protease+2+induces+mitochondria+mediated+neurodegeneration.">Disruption of SUMO-specific protease 2 induces mitochondria mediated neurodegeneration.</a> PLoS Genetics. 10 (10), e1004579-e1004579 (2014).</li><li>Zhang, H., Kuai, X., Ji, Z., Li, Z., Shi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Over-expression+of+small+ubiquitin-related+modifier-1+and+sumoylated+p53+in+colon+cancer.">Over-expression of small ubiquitin-related modifier-1 and sumoylated p53 in colon cancer.</a> Cell biochemistry and biophysics. 67 (3), 1081-1087 (2013).</li><li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO-specific+protease+1+promotes+prostate+cancer+progression+and+metastasis.">SUMO-specific protease 1 promotes prostate cancer progression and metastasis.</a> Oncogene. 32 (19), 2493-2498 (2013).</li><li>Karami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+SUMO-Protease+SENP7S+Regulates+&#946;-catenin+Signaling+and+Mammary+Epithelial+Cell+Transformation.">Novel SUMO-Protease SENP7S Regulates &#946;-catenin Signaling and Mammary Epithelial Cell Transformation.</a> Scientific Reports. 7 (1), 46477 (2017).</li><li>Pelisch, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+SUMO-Dependent+Protein+Network+Regulates+Chromosome+Congression+during+Oocyte+Meiosis.">A SUMO-Dependent Protein Network Regulates Chromosome Congression during Oocyte Meiosis.</a> Molecular Cell. 65 (1), 66-77 (2017).</li><li>Zhang, X. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO-2/3+modification+and+binding+regulate+the+association+of+CENP-E+with+kinetochores+and+progression+through+mitosis.">SUMO-2/3 modification and binding regulate the association of CENP-E with kinetochores and progression through mitosis.</a> Molecular Cell. 29 (6), 729-741 (2008).</li><li>Baker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducibility+crisis:+Blame+it+on+the+antibodies.">Reproducibility crisis: Blame it on the antibodies.</a> Nature News. 521 (7552), 274-276 (2015).</li><li>Wang, Z., Prelich, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quality+control+of+a+transcriptional+regulator+by+SUMO-targeted+degradation.">Quality control of a transcriptional regulator by SUMO-targeted degradation.</a> Molecular and Cellular Biology. 29 (7), 1694-1706 (2009).</li><li>Li, S. J., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+protease+required+for+cell-cycle+progression+in+yeast.">A new protease required for cell-cycle progression in yeast.</a> Nature. 398 (6724), 246-251 (1999).</li><li>Peek, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO+targeting+of+a+stress-tolerant+Ulp1+SUMO+protease.">SUMO targeting of a stress-tolerant Ulp1 SUMO protease.</a> PLoS ONE. 13 (1), e0191391 (2018).</li><li>Edgar, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+13+Blastomere+Culture+and+Analysis.">Chapter 13 Blastomere Culture and Analysis.</a> Methods in Cell Biology. 48, 303-321 (1995).</li><li>Pelisch, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+SUMO+modification+regulates+mitotic+chromosome+assembly+and+cell+cycle+progression+in+Caenorhabditis+elegans.">Dynamic SUMO modification regulates mitotic chromosome assembly and cell cycle progression in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Communications. 5 (1), 769 (2014).</li><li>Dillingham, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+single-stranded+DNA+binding+protein+as+a+probe+for+sensitive,+real-time+assays+of+helicase+activity.">Fluorescent single-stranded DNA binding protein as a probe for sensitive, real-time assays of helicase activity.</a> Biophysical Journal. 95 (7), 3330-3339 (2008).</li><li>Ruckman, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2'-Fluoropyrimidine+RNA-based+aptamers+to+the+165-amino+acid+form+of+vascular+endothelial+growth+factor+(VEGF165).+Inhibition+of+receptor+binding+and+VEGF-induced+vascular+permeability+through+interactions+requiring+the+exon+7-encoded+domain.">2'-Fluoropyrimidine RNA-based aptamers to the 165-amino acid form of vascular endothelial growth factor (VEGF165). Inhibition of receptor binding and VEGF-induced vascular permeability through interactions requiring the exon 7-encoded domain.</a> The Journal of Biological Chemistry. 273 (32), 20556-20567 (1998).</li><li>Hughes, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+specific+inhibitors+of+SUMO-1-+and+SUMO-2/3-mediated+protein-protein+interactions+using+Affimer+(Adhiron)+technology.">Generation of specific inhibitors of SUMO-1- and SUMO-2/3-mediated protein-protein interactions using Affimer (Adhiron) technology.</a> Science Signaling. 10 (505), eaaj2005 (2017).</li><li>Lopata, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affimer+proteins+for+F-actin:+novel+affinity+reagents+that+label+F-actin+in+live+and+fixed+cells.">Affimer proteins for F-actin: novel affinity reagents that label F-actin in live and fixed cells.</a> Scientific Reports. 8 (1), 6572 (2018).</li><li>Gilbreth, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoform-specific+monobody+inhibitors+of+small+ubiquitin-related+modifiers+engineered+using+structure-guided+library+design.">Isoform-specific monobody inhibitors of small ubiquitin-related modifiers engineered using structure-guided library design.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (19), 7751-7756 (2011).</li><li>Berndt, A., Wilkinson, K. A., Heimann, M. J., Bishop, P., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+characterization+of+the+properties+of+SUMO1-specific+monobodies.">In vivo characterization of the properties of SUMO1-specific monobodies.</a> Biochemical Journal. 456 (3), 385-395 (2013).</li></ol>

Aquí presentamos el uso de kmutag-FL, una proteína recombinante, para estudios funcionales de sumo en células de mamífero fijas y gónadas de nematodos disecado. KmUTAG-FL es un reactivo específico de pan-SUMO tolerante al estrés que reconoce y atrapa las proteínas conjugadas y las cadenas de SUMO nativas del SUMO. Dado que la estructura terciaria de SUMO está muy conservada, es muy probable que las variantes de SUMO de los sistemas adicionales de modelo y no modelo puedan analizarse con el reactivo kmUTAG-FL. Co...

El propósito de este método es facilitar el estudio y análisis de las proteínas conjugadas por el SUMO usando la proteína UTAG ( etiquetade dominioULP) recombinante de sumo-atrapante. Como se detalla a continuación, UTAG se puede utilizar en lugar de otros reactivos y enfoques para purificar, detectar y visualizar las proteínas de SUMO modificado. Dependiendo de las condiciones de crecimiento, las células pueden contener cientos o miles de proteínas que se modifican con las cadenas SUMO o SUMO (para revisión ver Kerscher et al. 20061 y kerscher 20162). Esto representa una dificultad considerable para los análisis funcionales de proteínas específicas de SUMO modificado, especialmente porque sólo una fracción de un objetivo de sumoyación en particular se modifica realmente3. Además de sus funciones en procesos celulares esenciales como la regulación transcripcional, la homeostasis proteica, la respuesta al estrés celular, y la remodelación de la cromatina durante la la mitosis y la meiosis; ahora se ha vuelto suficientemente claro que el sumo, las proteínas modificadas por el sumo y los componentes de la vía de sumo también tienen potencial como biomarcadores para patologías como el cáncer y los trastornos neurodegenerativos4,5,6 ,7. Esto subraya la necesidad de herramientas sólidas, fiables y fácilmente disponibles y enfoques innovadores para la detección y el análisis funcional de las proteínas de SUMO modificado en una variedad de células y muestras.
En muchos sistemas, los anticuerpos específicos de sumo son los reactivos de elección para la detección, el aislamiento y los análisis funcionales de las proteínas de sumo modificado8,9. Sin embargo, algunos anticuerpos específicos de SUMO disponibles comercialmente son caros, limitados en cantidad o disponibilidad, propensos a exhibir afinidades extremadamente variables y reactividad cruzada, y en algunos casos carecen de reproducibilidad10. Un enfoque alternativo es la expresión de SUMO con etiqueta epitópica en células y organismos transformados, pero vincular las etiquetas epítopos a SUMO puede reducir artificialmente su conjugación a los objetivos proteicos11. Además, los epítopos no son útiles cuando se evalúan las células o los tejidos no transformados.
Ulp1 es una proteasa SUMO conservada de S. cerevisiae que procesa el precursor de sumo y desumolates proteínas conjugadas de sumo12. Desarrollamos el reactivo de utag basado en la observación fortuítica de que una mutación de la cisteina cisteína (C580S) en Ulp1's sumo procesamiento ULP dcrear (Ud) no sólo previene el escote de sumo sino que también atrapa las proteínas conjugadas del sumo con altos avidez12. Para simplificar, nos hemos referido a este fragmento de Ulp1 (C580S) carboxy-terminal que atrapa el SUMO como UTAG (abreviatura de UD TAG). UTAG es una proteína de reventado de pan-SUMO recombinante que representa una alternativa útil a los anticuerpos anti-SUMO utilizados para el aislamiento y la detección de proteínas de SUMO modificado. Es importante destacar que reconoce específicamente el SUMO conjugada, doblado de forma nativa y no solo uno o varios epítopos en SUMO. Para mejorar tanto la estabilidad proteica como la fuerza de unión de SUMO de UTAG, generamos una variante de UTAG de la levadura tolerante al estrés Kluyveromyces marxianus (km). KmUTAG une estrechamente conjugados de SUMO con afinidad nanomolares13. Adicionalmente, kmUTAG es resistente a temperaturas elevadas (42 ° c), agentes reductores (5 mM TCEP-Tris (2-carboxietil) clorhidrato de fosfina), desnaturants (hasta 2 M de urea), agentes oxidantes (0,6% peróxido de hidrógeno), y detergentes no iónicos. Esta tolerancia al estrés es beneficiosa durante condiciones de purificación duras y tiempos de incubación prolongados, asegurando su estabilidad y la actividad de captura de SUMO. Sin embargo, no es de extrañar que la actividad de captura de SUMO de KmUTAG sea incompatible con los reactivos modificadores de la cisteína, los detergentes iónicos y los extractos proteicos completamente desnaturalizadas. La notable afinidad y propiedades de KmUTAG indican que este reactivo puede formar parte del repertorio estándar para el estudio de proteínas sumoiladas en múltiples especies.
Aquí proporcionamos un método simple para detectar proteínas de SUMO modificado en células de mamíferos y nematodos utilizando una proteína de fusión mCherry-KmUTAG fluorescente recombinante (kmUTAG-FL).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Well Cell Culture Plates</td>
			<td>Genesee Scientific/Olympus Plastics</td>
			<td>25-105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-545-003</td>
			<td>Used as a secondary antibody for mouse monoclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Gibco 14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dylight 488 conjugated AffiniPure Goat Anti-Moue IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-485-146</td>
			<td>Used as a secondary antibody for mouse monoclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Coverglass for Growth Cover Glasses</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12545101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLUORO-GEL II with DAPI</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>50-246-93)</td>
			<td>Mounting media in step 1.11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLUORO-GEL with DABCO</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>17985-02</td>
			<td>With DAPI added to 1 &#181;g/mL; mounting media in step 2.2.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine-HCl</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP3815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine-HCl</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>6000-43-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KmUTAG-fl</td>
			<td>Kerafast</td>
			<td></td>
			<td>KmUTAG reagents are available on Kerafast.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oneblock Western-CL blocking buffer</td>
			<td>Prometheus</td>
			<td>20-313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, Phosphate Buffered Saline, 10X Solution</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP3994</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNT2 cell line</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>95012613</td>
			<td>Normal prostate epithelium immortalized with SV40.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSPOT1</td>
			<td>(ChromoTek GmbH)</td>
			<td>ev-1</td>
			<td>https://www.chromotek.com/fileadmin/user_upload/pdfs/Datasheets/pSpot1_v1.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUMO 6F2</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>SUMO 6F2</td>
			<td>SUMO 6F2 was deposited to the DSHB by Pelisch, F. / Hay, R.T. (DSHB Hybridoma Product SUMO 6F2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUMO protease buffer [10x]</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>500 mM Tris-HCl, pH 8.0, 2% NP-40, 1.5 M NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUMO-2 Antibody 8A2</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>SUMO-2 8A2</td>
			<td>SUMO-2 8A2 was deposited to the DSHB by Matunis, M. (DSHB Hybridoma Product SUMO-2 8A2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP-HCL</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>51805-45-9</td>
			<td>Used as a reducing agent at a concentration of 5mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>Used for permeablization at 0.1% in DPBS/PBS(for worms)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

localization of sumo-modified proteins using fluorescent sumo-trapping proteins

Aquí presentamos un método novedoso para estudiar la sumoyación de las proteínas y su localización subcelular en las células de mamíferos y los nematodos ovocitos. Este método utiliza un fragmento de proteína de captura de SUMO modificado recombinante, kmUTAG, derivado de la proteasa de SUMO Ulp1 de la levadura en ciernes tolerante al estrés Kluyveromyces marxianus. Hemos adaptado las propiedades del kmUTAG con el fin de estudiar la sumoyación en una variedad de sistemas modelo sin el uso de anticuerpos. Para el estudio de SUMO, KmUTAG tiene varias ventajas en comparación con los enfoques basados en anticuerpos. Este reactivo de captura de SUMO tolerante al estrés se produce de forma recombinante, reconoce isoformas de SUMO nativos de muchas especies y, a diferencia de los anticuerpos disponibles comercialmente, muestra una afinidad reducida para el SUMO libre y no conjugada. Los resultados representativos que se muestran aquí incluyen la localización de los conjugados de sumo en las células de cultivo de tejidos de mamíferos y los nematodos ovocitos.

KmUTAG-FL es una proteína de captura de SUMO con etiquetas de mCherry recombinante. Para producir kmUTAG-FL, clonamos un mCherry-kmUTAG de codón optimizado en el plásmido de sobreexpresión bacteriana pSPOT1 (figura 1). Después de la inducción, la proteína kmUTAG-FL se purificó en Spot-TRAP, se elugió y se congeló hasta su uso posterior. Para garantizar la actividad de captura de SUMO de KmUTAG-FL, confirmamos la Unión a las perlas conjugadas con SU...

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Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

El SUMO es una proteína modificadora de ubiquitina, esencial y muy conservada. En este protocolo Describimos el uso de una proteína de captura de SUMO recombinante con tolerancia al estrés (kmUTAG) para visualizar conjugados de SUMO nativos, sin etiquetar y su localización en una variedad de tipos de células.

Localización de proteínas de SUMO modificado utilizando proteínas de atrapamiento de sumo fluorescente

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...

La importancia de este protocolo es el uso de una nueva proteína UTAG fluorescente que atrapa SUMO para la detección del modificador de proteína SUMO en varias células eucariotas. La principal ventaja de esta técnica es un protocolo sencillo para la detección libre de anticuerpos de SUMO en una variedad de células, incluyendo el cultivo de tejidos de mamíferos y gónadas de nematodos. SUMO desempeña un papel importante en el cáncer y los trastornos neurodegenerativos, y esto subraya la necesidad de herramientas robustas y confiables para la detección y el análisis funcional de proteínas modificadas por SUMO.Debido a que SUMO está altamente conservado, la proteína UTAG de captura suMO fluorescente se puede utilizar para etiquetar SUMO conjugado en muchos organismos diferentes. Este video demuestra su uso en células de mamíferos. Además, el texto completo describe su uso en ovocitos de nematodos.La demostración visual de esta técnica proporciona pistas críticas para el tratamiento de las células antes de la tinción y la detección de SUMO. Para empezar, el cultivo de células de cultivo de tejido de elección en la cubierta redonda de 22 milímetros se desliza en placas TC de seis pozos hasta 70 a 80% confluentes. Lave brevemente las células con un mililitro de DPBS.Para fijar las celdas, agregue dos mililitros de 4%PFA y DPBS frescos a cada pozo. Incubar las células durante 20 minutos a temperatura ambiente. Lave las células fijas tres veces durante cinco minutos en un mililitro de DPBS mientras se nutra la placa.Para permeabilizar las células, incubar durante 15 minutos con 1%Tritón X-100 en DPBS. Lave las células de nuevo, como antes. Incubar las células con 500 microlitros de 1 pH HCL de glicina molar 2 durante 10 segundos.A continuación, neutralice el pH inmediatamente con 500 microlitros de 10X SUMO Proteasa buffer, o SPB. Después de lavar las células como antes, retire los resbalones de la cubierta del pozo y colóquelos en una cámara de humedad. Para la tinción UTAG-FL solamente, mezcle un microgramo de UTAG-FL con 100 microlitros de 1X SPB que contengan cinco TCEP mililolares en un tubo.A continuación, pipetear la mezcla en las celdas de la cubierta y la incubar a temperatura ambiente durante una hora en la cámara de humedad. Para lavar los resbalones de la cubierta, pipetee 200 microlitros de DPBS en cada resbalón de cubierta y déjelo en su lugar durante 10 minutos. Repita el lavado dos veces más.Retire los resbalones de la cubierta del último lavado e invierta en un portaobjetos pre-limpiado con una gota de medio de montaje. Guarde las muestras durante la noche en un congelador celsius de 20 grados antes de verlos bajo el microscopio. Visualice las celdas utilizando los conjuntos de filtros adecuados para DAPI y Texas Red.Consulte el texto completo de un protocolo sobre cómo etiquetar las gónadas SUMO y nematodos fijos. Si bien el etiquetado de las células de los mamíferos es bastante sencillo, etiquetar los ovocitos nematodos requiere un entrenamiento previo en las disecciones gónadas. KmUTAG-FL incubado con células PMT2 fijas mostró una tinción nuclear distinta.Tanto la tinción nuclear difusa como los distintos focos nucleares eran visibles. La localización nuclear se confirmó utilizando la co-tinción con DAPI. De acuerdo con la actividad de captura SUMO de KmUTAG-FL, el patrón de localización nuclear recordaba a la tinción SUMO23.La comanteta con anticuerpo anti-SUMO23 8A2 confirmó la co-localización de KmUTAG-FL con la señal SUMO23. Esto valida la eficacia de KmUTAG-FL para detectar SUMO23 en células de mamíferos. Gónadas aisladas de hermafrodita adulta productora de ovocitos c.los nematodos de elegans fueron etiquetados con anticuerpos anti-SUMO. De acuerdo con informes anteriores, anticuerpos anti-SUMO inicialmente localizados en el plasmo nuclear de los oocitos de profosa miótica tardía. Luego se redistribuyó al complejo de anillos centrales de los homólogos emparejados a medida que la envolvente nuclear se rompía y los cromosomas se congresoban hacia la placa metafásica.En preparaciones paralelas, las gónadas etiquetadas con KmUTAG-FL revelaron patrones similares. KmUTAG-FL cambió de etiquetar el nucleoplasmo a concentrarse en el complejo de anillos a medida que los ovocitos comenzaron y completaron el proceso de descomposición de la envolvente nuclear. Estos resultados validan KmUTAG-FL como una herramienta útil para el análisis de la miosis y los procesos relacionados con SUMO en c.elegans y posiblemente otros nematodos. Al realizar la fijación, es fundamental utilizar paraformaldehído fresco y un corto tiempo de fijación para mantener suMO plegado de forma nativa para que pueda ser reconocido por el KmUTAG. Dado que la estructura terciaria de SUMO está altamente conservada, es muy probable que las variantes SUMO de sistemas adicionales de modelos y no modelos puedan ser analizadas con el reactivo KmUTAG-FL.Actualmente, estamos utilizando esta nueva proteína UTAG fluorescente que atrapa SUMO para estudiar la función de SUMO durante el estrés celular. Por último, tenga en cuenta que todos los pasos que utilizan el paraformaldehído fijado deben realizarse en una campana de seguridad de laboratorio y este reactivo debe eliminarse correctamente.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identification of Plant Ice-binding Proteins Through Assessment of Ice-recrystallization Inhibition and Isolation Using Ice-affinity Purification

Identificación de proteínas vegetales de hielo de unión a través de la evaluación de la inhibición de hielo-recristalización y Aislamiento Uso de purificación de hielo-afinidad

Ice-binding proteins (IBPs) belong to a family of stress-induced proteins that are synthesized by certain organisms exposed to subzero temperatures. In ...

Investigación

Bioquímica

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.

Libre de detergente ultra rápida reconstitución de proteínas de membrana en bicapas lipídicas soportadas utilizando fusogénicas complementarios cargados de Proteoliposomes.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers ...

Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

Detección de detergente-sensible a las interacciones entre proteínas de la membrana

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

How to Quantify the Fraction of Photoactivated Fluorescent Proteins in Bulk and in Live Cells

Cómo cuantificar la fracción de proteínas fluorescentes fotoactivado a granel y en células vivas

Photoactivatable and -convertible fluorescent proteins (PA-FPs) have been used in fluorescence live-cell microscopy for analyzing the dynamics of cells ...

Fluorescent Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels

Tinción fluorescente de plata de proteínas en geles de poliacrilamida

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide ...

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

Uso de proteínas de fusión recombinantes en una plataforma de ensayo fluorescente proteasa y su renaturalización en gel

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...

Characterizing Cellular Proteins with In-cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins

Caracterización de proteínas celulares con oxidación fotoquímica rápida en las células de proteínas

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting method used to characterize protein structure and interactions. ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Seccionamiento transversal de arroz maduro (Oryza sativa L.) Núcleos para imágenes de microscopía electrónica de barrido utilizando puntas de pipeta como soporte de inmovilización

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Optimized Incorporation of Alkynyl Fatty Acid Analogs for the Detection of Fatty Acylated Proteins using Click Chemistry

Incorporación optimizada de análogos de ácidos grasos alquilinos para la detección de proteínas aciladas grasas utilizando Click Chemistry

Fatty acylation, the covalent addition of saturated fatty acids to protein substrates, is important in regulating a myriad of cellular functions in ...

Production of Recombinant PRMT Proteins using the Baculovirus Expression Vector System

Producción De Proteínas Prmt Recombinantes Utilizando El Sistema De Vectores De Expresión De Baculovirus

Protein arginine methyltransferases (PRMTs) methylate arginine residues on a wide variety of proteins that play roles in numerous cellular processes. ...