Name: localization of sumo-modified proteins using fluorescent sumo-trapping proteins
Uploaded: 2019-04-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins at JoVE.com

Vi vill tacka alla medlemmar i Kerscher labbet för deras stöd, Nathalie Nguyen för kritisk läsning av manuskriptet, och Lidia EPP för sekvensering. Detta arbete har fått stöd av Samväldets forsknings kommersialiserings fond MF16-034-LS till OK. Forsknings stöd för W & M studenter tillhandahölls av Bailey-Huston Research Fund, och Charles Center Honors Fellowships till RY och CH.

1. sumodetektion i fasta vävnads odlings celler med rekombinant KmUTAG-FL SUMO-svällningsprotein
<ol><li>Odla vävnad kultur celler val på 22 mm runda täckglas i 6-well TC plattor tills 70%-80% konflytande. Utför steg 1.2 – 1.8 i 6-brunn plattan.</li>
	<li>Tvätta cellerna kort med 1 mL DPBS (Dulbecco ' s fosfatbuffrad saltlösning)</li>
	<li>För fixering, Bered en ny lösning av 4% paraformaldehyd (PFA) lösning (utspädd i DPBS). För att fixa celler, tillsätt 2 mL 4% PFA i DPBS till varje brunn. Inkubera ce...

<ol>
	<li>Kerscher, O., Felberbaum, R., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+proteins+by+ubiquitin+and+ubiquitin-like+proteins.">Modification of proteins by ubiquitin and ubiquitin-like proteins.</a> Cell and Developmental Biology. 22, 159-180 (2006).</li><li>Kerscher, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> SUMOylation. , 1-11 (2016).</li><li>Hay, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO:+a+history+of+modification.">SUMO: a history of modification.</a> Molecular Cell. 18 (1), 1-12 (2005).</li><li>Fu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+SUMO-specific+protease+2+induces+mitochondria+mediated+neurodegeneration.">Disruption of SUMO-specific protease 2 induces mitochondria mediated neurodegeneration.</a> PLoS Genetics. 10 (10), e1004579-e1004579 (2014).</li><li>Zhang, H., Kuai, X., Ji, Z., Li, Z., Shi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Over-expression+of+small+ubiquitin-related+modifier-1+and+sumoylated+p53+in+colon+cancer.">Over-expression of small ubiquitin-related modifier-1 and sumoylated p53 in colon cancer.</a> Cell biochemistry and biophysics. 67 (3), 1081-1087 (2013).</li><li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO-specific+protease+1+promotes+prostate+cancer+progression+and+metastasis.">SUMO-specific protease 1 promotes prostate cancer progression and metastasis.</a> Oncogene. 32 (19), 2493-2498 (2013).</li><li>Karami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+SUMO-Protease+SENP7S+Regulates+&#946;-catenin+Signaling+and+Mammary+Epithelial+Cell+Transformation.">Novel SUMO-Protease SENP7S Regulates &#946;-catenin Signaling and Mammary Epithelial Cell Transformation.</a> Scientific Reports. 7 (1), 46477 (2017).</li><li>Pelisch, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+SUMO-Dependent+Protein+Network+Regulates+Chromosome+Congression+during+Oocyte+Meiosis.">A SUMO-Dependent Protein Network Regulates Chromosome Congression during Oocyte Meiosis.</a> Molecular Cell. 65 (1), 66-77 (2017).</li><li>Zhang, X. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO-2/3+modification+and+binding+regulate+the+association+of+CENP-E+with+kinetochores+and+progression+through+mitosis.">SUMO-2/3 modification and binding regulate the association of CENP-E with kinetochores and progression through mitosis.</a> Molecular Cell. 29 (6), 729-741 (2008).</li><li>Baker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducibility+crisis:+Blame+it+on+the+antibodies.">Reproducibility crisis: Blame it on the antibodies.</a> Nature News. 521 (7552), 274-276 (2015).</li><li>Wang, Z., Prelich, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quality+control+of+a+transcriptional+regulator+by+SUMO-targeted+degradation.">Quality control of a transcriptional regulator by SUMO-targeted degradation.</a> Molecular and Cellular Biology. 29 (7), 1694-1706 (2009).</li><li>Li, S. J., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+protease+required+for+cell-cycle+progression+in+yeast.">A new protease required for cell-cycle progression in yeast.</a> Nature. 398 (6724), 246-251 (1999).</li><li>Peek, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO+targeting+of+a+stress-tolerant+Ulp1+SUMO+protease.">SUMO targeting of a stress-tolerant Ulp1 SUMO protease.</a> PLoS ONE. 13 (1), e0191391 (2018).</li><li>Edgar, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+13+Blastomere+Culture+and+Analysis.">Chapter 13 Blastomere Culture and Analysis.</a> Methods in Cell Biology. 48, 303-321 (1995).</li><li>Pelisch, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+SUMO+modification+regulates+mitotic+chromosome+assembly+and+cell+cycle+progression+in+Caenorhabditis+elegans.">Dynamic SUMO modification regulates mitotic chromosome assembly and cell cycle progression in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Communications. 5 (1), 769 (2014).</li><li>Dillingham, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+single-stranded+DNA+binding+protein+as+a+probe+for+sensitive,+real-time+assays+of+helicase+activity.">Fluorescent single-stranded DNA binding protein as a probe for sensitive, real-time assays of helicase activity.</a> Biophysical Journal. 95 (7), 3330-3339 (2008).</li><li>Ruckman, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2'-Fluoropyrimidine+RNA-based+aptamers+to+the+165-amino+acid+form+of+vascular+endothelial+growth+factor+(VEGF165).+Inhibition+of+receptor+binding+and+VEGF-induced+vascular+permeability+through+interactions+requiring+the+exon+7-encoded+domain.">2'-Fluoropyrimidine RNA-based aptamers to the 165-amino acid form of vascular endothelial growth factor (VEGF165). Inhibition of receptor binding and VEGF-induced vascular permeability through interactions requiring the exon 7-encoded domain.</a> The Journal of Biological Chemistry. 273 (32), 20556-20567 (1998).</li><li>Hughes, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+specific+inhibitors+of+SUMO-1-+and+SUMO-2/3-mediated+protein-protein+interactions+using+Affimer+(Adhiron)+technology.">Generation of specific inhibitors of SUMO-1- and SUMO-2/3-mediated protein-protein interactions using Affimer (Adhiron) technology.</a> Science Signaling. 10 (505), eaaj2005 (2017).</li><li>Lopata, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affimer+proteins+for+F-actin:+novel+affinity+reagents+that+label+F-actin+in+live+and+fixed+cells.">Affimer proteins for F-actin: novel affinity reagents that label F-actin in live and fixed cells.</a> Scientific Reports. 8 (1), 6572 (2018).</li><li>Gilbreth, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoform-specific+monobody+inhibitors+of+small+ubiquitin-related+modifiers+engineered+using+structure-guided+library+design.">Isoform-specific monobody inhibitors of small ubiquitin-related modifiers engineered using structure-guided library design.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (19), 7751-7756 (2011).</li><li>Berndt, A., Wilkinson, K. A., Heimann, M. J., Bishop, P., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+characterization+of+the+properties+of+SUMO1-specific+monobodies.">In vivo characterization of the properties of SUMO1-specific monobodies.</a> Biochemical Journal. 456 (3), 385-395 (2013).</li></ol>

Här introducerar vi användningen av kmUTAG-fl, ett rekombinant protein, för funktionella studier av SUMO i fasta däggdjurs celler och dissekerade tallvedsnematoden gonader. KmUTAG-fl är en stress-tolerant Pan-SUMO specifik reagens som känner igen och fällor infödda SUMO-konjugerade proteiner och SUMO kedjor. Eftersom SUMO ' s tertiär struktur är mycket bevarade är det mycket troligt att SUMO varianter från ytterligare modell och icke-modellsystem kan analyseras med kmUTAG-fl reagens. KmUTAG-fl kan utgöra en ...

Syftet med denna metod är att under lätta studier och analys av SUMO-konjugerade proteiner med hjälp av rekombinant SUMO-svällning UTAG (Ulp Domain tag) protein. Som beskrivs nedan kan UTAG användas i stället för andra reagenser och metoder för att rena, upptäcka och visualisera SUMO-modifierade proteiner. Beroende på tillväxt förhållanden, celler kan innehålla hundratals eller tusentals proteiner som modifieras med SUMO eller SUMO kedjor (för granskning se Kerscher et al. 20061 och kerscher 20162). Detta utgör en avsevärd svårighet för funktionella analyser av specifika SUMO-modifierade proteiner, särskilt eftersom endast en bråkdel av en viss sumoylation mål faktiskt ändras3. Förutom deras roller i viktiga cellulära processer såsom transkriptionell reglering, protein homeostas, reaktionen på cellulär stress, och kromatin remodeling under Mitosen och meiosis; Det har nu blivit tillräckligt tydligt att Sumo, Sumo-modifierade proteiner och Sumo-utbildningsavsnitt också har potential som bio markörer för sjukdomar som cancer och neurodegenerativa sjukdomar4,5,6 ,7. Detta understryker behovet av robusta, pålitliga och lättillgängliga verktyg och innovativa metoder för detektion och funktionell analys av SUMO-modifierade proteiner i en mängd olika celler och prover.
I många system är sumospecifika anti kroppar de reagenser som är val för detektion, isolering och funktionella analyser av Sumo-modifierade proteiner8,9. Vissa kommersiellt tillgängliga SUMO-specifika anti kroppar är dock dyra, begränsade i kvantitet eller tillgänglighet, benägna att uppvisa vilt variabla affiniteter och kors reaktivitet, och i vissa fall saknar reproducerbarhet10. En alternativ metod är uttrycket av epitop-taggade Sumo i transformerade celler och organismer, men länka epitop Taggar till Sumo kan artificiellt sänka sin konjugering till protein mål11. Dessutom är epitoper inte användbart när otransformerade celler eller vävnader utvärderas.
Ulp1 är en conserveras SUMO proteashämmare från S. cerevisiae att både bearbetar Sumo föregångaren och desumoylates Sumo-konjugerade proteiner12. Vi utvecklade utag reagens baserat på den serendipitous observation att en mutation av den katalytiska Cystein (C580S) i Ulp1's Sumo bearbetning Ulp domänen (UD) inte bara förhindrar Sumo klyvning men också fällor Sumo-konjugerade proteiner med hög aviditet12. För enkelhetens skull hänvisade vi till denna carboxy-Terminal SUMO-svällning Ulp1 (C580S) fragment som UTAG (förkortning för UD TAG). UTAG är ett rekombinant Pan-SUMO-svällningsprotein som utgör ett användbart alternativ till anti-SUMO-antikroppar som används för isolering och detektion av SUMO-modifierade proteiner. Viktigt är att det specifikt erkänner Native-vikas, konjugerad Sumo och inte bara en eller flera epitoper på Sumo. För att förbättra både protein stabilitet och SUMO bindande styrka UTAG, genererade vi en variant av UTAG från stress-toleranta jäst Kluyveromyces marxianus (km). Kmutag binder tätt Sumo-konjugat med HDAC vid nanomolära affinitet13. KmUTAG är dessutom resistent mot förhöjda temperaturer (42 ° c), Reduktions medel (5 mM TCEP-tris (2-carboxyeyl) fosfinhydroklorid), denatureringsmedel (upp till 2 M urea), oxidations medel (0,6% väteperoxid) och icke-joniska rengörings medel. Denna stress tålighet är fördelaktig under hårda renings förhållanden och förlängda inkubations tider, vilket säkerställer dess stabilitet och SUMO-svällningsaktivitet. Det är dock inte överraskande att Kmutags SUMO-svällningsaktivitet är oförenlig med Cystein-modifierande reagenser, joniska rengörings medel och helt denaturerade protein extrakt. Kmutags anmärknings värda affinitet och egenskaper tyder på att denna reagens kan bli en del av standardrepertoaren för studiet av sumoylerade proteiner i flera arter.
Här erbjuder vi en enkel metod för att detektera SUMO-modifierade proteiner i däggdjurs celler och nematoder med hjälp av ett rekombinant fluorescerande mCherry-KmUTAG fusions protein (kmUTAG-fl).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Well Cell Culture Plates</td>
			<td>Genesee Scientific/Olympus Plastics</td>
			<td>25-105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-545-003</td>
			<td>Used as a secondary antibody for mouse monoclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Gibco 14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dylight 488 conjugated AffiniPure Goat Anti-Moue IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-485-146</td>
			<td>Used as a secondary antibody for mouse monoclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Coverglass for Growth Cover Glasses</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12545101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLUORO-GEL II with DAPI</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>50-246-93)</td>
			<td>Mounting media in step 1.11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLUORO-GEL with DABCO</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>17985-02</td>
			<td>With DAPI added to 1 &#181;g/mL; mounting media in step 2.2.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine-HCl</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP3815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine-HCl</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>6000-43-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KmUTAG-fl</td>
			<td>Kerafast</td>
			<td></td>
			<td>KmUTAG reagents are available on Kerafast.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oneblock Western-CL blocking buffer</td>
			<td>Prometheus</td>
			<td>20-313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, Phosphate Buffered Saline, 10X Solution</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP3994</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNT2 cell line</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>95012613</td>
			<td>Normal prostate epithelium immortalized with SV40.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSPOT1</td>
			<td>(ChromoTek GmbH)</td>
			<td>ev-1</td>
			<td>https://www.chromotek.com/fileadmin/user_upload/pdfs/Datasheets/pSpot1_v1.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUMO 6F2</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>SUMO 6F2</td>
			<td>SUMO 6F2 was deposited to the DSHB by Pelisch, F. / Hay, R.T. (DSHB Hybridoma Product SUMO 6F2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUMO protease buffer [10x]</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>500 mM Tris-HCl, pH 8.0, 2% NP-40, 1.5 M NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUMO-2 Antibody 8A2</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>SUMO-2 8A2</td>
			<td>SUMO-2 8A2 was deposited to the DSHB by Matunis, M. (DSHB Hybridoma Product SUMO-2 8A2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP-HCL</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>51805-45-9</td>
			<td>Used as a reducing agent at a concentration of 5mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>Used for permeablization at 0.1% in DPBS/PBS(for worms)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

localization of sumo-modified proteins using fluorescent sumo-trapping proteins

Här presenterar vi en ny metod för att studera sumoylering av proteiner och deras sub-cellulär lokalisering i däggdjurs celler och tallvedsnematoden oocyter. Denna metod använder en rekombinant modifierad SUMO-svällning protein fragment, kmUTAG, som härrör från Ulp1 SUMO proteas av stress-toleranta spirande jäst Kluyveromyces marxianus. Vi har anpassat Kmutags egenskaper i syfte att studera sumoylering i en mängd olika modell system utan användning av anti kroppar. För studien av SUMO har KmUTAG flera fördelar jämfört med antikroppsbaserade metoder. Detta stress-toleranta SUMO-svällningsreagens produceras rekombinantly, det erkänner infödda SUMO ISO former från många arter, och till skillnad från kommersiellt tillgängliga anti kroppar det visar minskad affinitet för fri, okonjugerad SUMO. Representativa resultat som visas här inkluderar lokaliseringen av SUMO-konjugat i däggdjurs vävnads odlings celler och nematodeoocyter.

KmUTAG-fl är ett rekombinant, mCherry-märkt SUMO-svällningsprotein. För att producera kmUTAG-fl, klonade vi en Codon-optimerad mCherry-kmUTAG i pSPOT1 bakteriell överuttryck Plasmid (figur 1). Efter induktion renades kmUTAG-fl-proteinet på spot-TRAP, elueras och frystes fram till vidare användning. För att säkerställa SUMO-svällningsaktiviteten hos KmUTAG-fl bekräftade vi bindningen till SUMO1-konjugerade pärlor och utfällning av ett SUMO-CAT fu...

Watch this Scientific Journal Video about Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins at JoVE.com

Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

SUMO är ett viktigt och starkt bevarade, små ubiquitinliknande modifierande protein. I detta protokoll beskriver vi användningen av ett stress-tolerant rekombinant SUMO-svällningsprotein (kmUTAG) för att visualisera infödda, otaggade SUMO-konjugat och deras lokalisering i en mängd olika cell typer.

Lokalisering av SUMO-modifierade proteiner med fluorescerande Sumo-fångst proteiner

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...

Betydelsen av detta protokoll är användningen av en roman fluorescerande SUMO-fångstande UTAG protein för detektion av proteinmodifieraren SUMO i olika eukaryota celler. Den största fördelen med denna teknik är ett okomplicerat protokoll för den antikroppsfria detektionen av SUMO i en mängd olika celler, inklusive däggdjursvävnadskultur och nematodsnader. SUMO spelar viktiga roller i cancer och neurodegenerativa sjukdomar, och detta understryker behovet av robusta och tillförlitliga verktyg för detektion och funktionell analys av SUMO-modifierade proteiner.Eftersom SUMO är mycket bevarad, den fluorescerande SUMO-fångstande UTAG protein kan användas för att märka konjugerade SUMO i många olika organismer. Denna video visar dess användning i däggdjursceller. Dessutom beskriver den fullständiga texten dess användning i nematod oocyter.Den visuella demonstrationen av denna teknik ger kritiska tips för behandling av celler före färgning och SUMO upptäckt. Till att börja med växa vävnadskultur celler val på 22-millimeters runda locket glider i sex-väl TC plattor tills 70 till 80%konfluent. Tvätta cellerna kort med en milliliter av DPBS.För att fixa cellerna, tillsätt två milliliter färska 4%PFA och DPBS till varje brunn. Inkubera cellerna i 20 minuter i rumstemperatur. Tvätta de fasta cellerna tre gånger i fem minuter i en milliliter DPBS medan nötning plattan.För att permeabilisera cellerna, inkubera i 15 minuter med 1%Triton X-100 i DPBS. Tvätta cellerna igen, som förut. Inkubera cellerna med 500 mikroliter av 1 molar glycin HCL pH 2 i 10 sekunder.Därefter neutraliserar du pH-värdet omedelbart med 500 mikroliter av 10X SUMO Protease buffert, eller SPB. Efter tvätt av cellerna som tidigare, ta bort locket glider från brunnen och placera dem i en fuktighetskammare. Endast för UTAG-FL-färgning, blanda ett mikrogram UTAG-FL med 100 mikroliter på 1X SPB innehållande fem millimolar TCEP i ett rör.Sedan pipettera blandningen på cellerna på täckslien och inkubera i rumstemperatur i en timme i fuktighetskammaren. För att tvätta täcksliorna, pipettera 200 mikroliter av DPBS på varje täcksli och låt på plats vara på plats i 10 minuter. Upprepa tvätten ytterligare två gånger.Ta bort locket glider från den sista tvätten och invertera på en förrensad mikroskopi glida med en droppe monteringsmedium. Förvara proverna över natten i en 20 grader Celsius frys innan du tittar under mikroskopet. Visualisera cellerna med hjälp av lämpliga filteruppsättningar för DAPI och Texas Red.Vänligen se hela texten för ett protokoll om hur man märker SUMO och fasta nematod gonads. Medan märkning däggdjursceller är ganska enkelt, märkning nematod oocyter kräver tidigare utbildning i gonad dissektioner. KmUTAG-FL inkuberade med fasta PMT2 celler visade en distinkt nukleära färgning.Både diffusa nukleära färgning och distinkta nukleära högborgar var synliga. Kärn- lokalisering bekräftades genom att använda co-färgning med DAPI. Överensstämmer med SUMO fångstverksamhet Av KmUTAG-FL, var kärnlokalisering mönstret påminner om SUMO23 färgning.Co-färgning med anti-SUMO23 8A2 antikropp bekräftade samlokaliseringen av KmUTAG-FL med SUMO23 signalen. Detta validerar effekten av KmUTAG-FL för att detektera SUMO23 i däggdjursceller. Isolerade gonader från äggcellsproducerande adult hermafrodit c.elegans nematoder var märkt med anti-SUMO antikropp. Överensstämmer med tidigare rapporter, anti-SUMO antikropp initialt lokaliserade till den nukleära plasm av sena myotic prophase oocytes. Det omfördelas sedan till centralen ringa komplex av parade homologs som det kärn- kuvertet pankt besegrar, och kromosomerna som är kongress in mot metaphasen, pläterar.I parallella preparat, gonader märkta med KmUTAG-FL visade liknande mönster. KmUTAG-FL skiftade från märkning nukleoplasmen att koncentrera sig på ringen komplexa som äggceller började och avslutade processen med nukleära kuvert uppdelning. Dessa resultat validerar KmUTAG-FL som ett användbart verktyg för analys av myosis och SUMO-relaterade processer i c.elegans och eventuellt andra nematoder. Medan du utför fixering, är det viktigt att använda färsk paraformaldehyd och en kort fixeringstid för att hålla SUMO inbyggt vikt så att den kan kännas igen av KmUTAG. Eftersom SUMO:s tertiära struktur är mycket bevarad är det mycket troligt att SUMO-varianter från ytterligare modell- och icke-modellsystem kan analyseras med KmUTAG-FL-reagensen.För närvarande använder vi denna nya fluorescerande SUMO-fångstande UTAG protein för att studera funktionen av SUMO under cellulär stress. Slutligen, observera att alla steg med hjälp av fixativ paraformaldehyd ska utföras i en laboratoriesäkerhetshuv och detta reagens måste kasseras på rätt sätt.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identification of Plant Ice-binding Proteins Through Assessment of Ice-recrystallization Inhibition and Isolation Using Ice-affinity Purification

Identifiering av växtisbindande proteiner genom bedömning av iskristallisationshämning och isolering med användning av isaffinitetsrening

Ice-binding proteins (IBPs) belong to a family of stress-induced proteins that are synthesized by certain organisms exposed to subzero temperatures. In ...

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.

Tvättmedel-fri ultrasnabb beredning av membranproteiner i Lipid lipidmonolager använder Fusogenic kompletterande laddade Proteoliposomes.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers ...

Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

Påvisande av tvättmedel-känsliga samspelet mellan membranproteiner

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

How to Quantify the Fraction of Photoactivated Fluorescent Proteins in Bulk and in Live Cells

Hur att kvantifiera fraktionen av Photoactivated fluorescerande proteiner i Bulk och i levande celler

Photoactivatable and -convertible fluorescent proteins (PA-FPs) have been used in fluorescence live-cell microscopy for analyzing the dynamics of cells ...

Fluorescent Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels

Fluorescerande silverfärgning av proteiner i polyakrylamidgeler

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide ...

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

Användning av rekombinanta fusionsproteinerna i en fluorescerande proteas Assay plattform och deras i-gel utvinningsarbete

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...

Characterizing Cellular Proteins with In-cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins

Karakterisera cellulära proteiner med In-cell Snabb fotokemisk oxidation av proteiner

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting method used to characterize protein structure and interactions. ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Tvärgående sektionering av moget ris (Oryza sativa L.) Kärnor för skanning av elektronmikroskopiavbildning med pipettespetsar som immobiliseringsstöd

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Optimized Incorporation of Alkynyl Fatty Acid Analogs for the Detection of Fatty Acylated Proteins using Click Chemistry

Optimerad inkorporering av alkynylfettsyraanaloger för detektion av fettacylaterade proteiner med hjälp av klickkemi

Fatty acylation, the covalent addition of saturated fatty acids to protein substrates, is important in regulating a myriad of cellular functions in ...

Production of Recombinant PRMT Proteins using the Baculovirus Expression Vector System

Produktion av rekombinanta PRMT-proteiner med baculovirusuttrycksvektorsystemet

Protein arginine methyltransferases (PRMTs) methylate arginine residues on a wide variety of proteins that play roles in numerous cellular processes. ...