Name: localization of sumo-modified proteins using fluorescent sumo-trapping proteins
Uploaded: 2019-04-27T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins at JoVE.com

Biz onların destek için Kerscher laboratuar tüm üyelerine teşekkür etmek istiyorum, Nathalie Nguyen el yazması kritik okuma için, ve Lidia EPP sıralamayı için. Bu iş Commonwealth Research ticarileştirme Fonu MF16-034-LS OK tarafından desteklenmektedir. W & M öğrencileri için araştırma desteği, Bailey-Huston Araştırma Fonu ve Charles Center Honors Burslar tarafından RY ve CH 'e sağlandı.

1. rekombinant KmUTAG-FL SUMO bindirme proteini kullanarak sabit doku kültürü hücrelerinde SUMO tespiti
<ol><li>6-iyi TC plakaları 22 mm yuvarlak kapak fişi üzerinde seçim doku kültürü hücreleri Grow 70%-80% konfluent kadar. 6-kuyu plakasında 1,2 – 1.8 arasındaki adımları gerçekleştirin.</li>
	<li>1 mL DPBS (Dulbecco fosfat-tamponlu tuz) ile hücreleri kısaca yıkayın</li>
	<li>Sabitleme için,% 4 Paraformaldehyde (PFA) çözeltisi (DPBS 'de seyreltilmiş) yeni bir çözelti hazırlayın. Hücrele...

<ol>
	<li>Kerscher, O., Felberbaum, R., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+proteins+by+ubiquitin+and+ubiquitin-like+proteins.">Modification of proteins by ubiquitin and ubiquitin-like proteins.</a> Cell and Developmental Biology. 22, 159-180 (2006).</li><li>Kerscher, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> SUMOylation. , 1-11 (2016).</li><li>Hay, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO:+a+history+of+modification.">SUMO: a history of modification.</a> Molecular Cell. 18 (1), 1-12 (2005).</li><li>Fu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+SUMO-specific+protease+2+induces+mitochondria+mediated+neurodegeneration.">Disruption of SUMO-specific protease 2 induces mitochondria mediated neurodegeneration.</a> PLoS Genetics. 10 (10), e1004579-e1004579 (2014).</li><li>Zhang, H., Kuai, X., Ji, Z., Li, Z., Shi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Over-expression+of+small+ubiquitin-related+modifier-1+and+sumoylated+p53+in+colon+cancer.">Over-expression of small ubiquitin-related modifier-1 and sumoylated p53 in colon cancer.</a> Cell biochemistry and biophysics. 67 (3), 1081-1087 (2013).</li><li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO-specific+protease+1+promotes+prostate+cancer+progression+and+metastasis.">SUMO-specific protease 1 promotes prostate cancer progression and metastasis.</a> Oncogene. 32 (19), 2493-2498 (2013).</li><li>Karami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+SUMO-Protease+SENP7S+Regulates+&#946;-catenin+Signaling+and+Mammary+Epithelial+Cell+Transformation.">Novel SUMO-Protease SENP7S Regulates &#946;-catenin Signaling and Mammary Epithelial Cell Transformation.</a> Scientific Reports. 7 (1), 46477 (2017).</li><li>Pelisch, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+SUMO-Dependent+Protein+Network+Regulates+Chromosome+Congression+during+Oocyte+Meiosis.">A SUMO-Dependent Protein Network Regulates Chromosome Congression during Oocyte Meiosis.</a> Molecular Cell. 65 (1), 66-77 (2017).</li><li>Zhang, X. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO-2/3+modification+and+binding+regulate+the+association+of+CENP-E+with+kinetochores+and+progression+through+mitosis.">SUMO-2/3 modification and binding regulate the association of CENP-E with kinetochores and progression through mitosis.</a> Molecular Cell. 29 (6), 729-741 (2008).</li><li>Baker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducibility+crisis:+Blame+it+on+the+antibodies.">Reproducibility crisis: Blame it on the antibodies.</a> Nature News. 521 (7552), 274-276 (2015).</li><li>Wang, Z., Prelich, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quality+control+of+a+transcriptional+regulator+by+SUMO-targeted+degradation.">Quality control of a transcriptional regulator by SUMO-targeted degradation.</a> Molecular and Cellular Biology. 29 (7), 1694-1706 (2009).</li><li>Li, S. J., Hochstrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+protease+required+for+cell-cycle+progression+in+yeast.">A new protease required for cell-cycle progression in yeast.</a> Nature. 398 (6724), 246-251 (1999).</li><li>Peek, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO+targeting+of+a+stress-tolerant+Ulp1+SUMO+protease.">SUMO targeting of a stress-tolerant Ulp1 SUMO protease.</a> PLoS ONE. 13 (1), e0191391 (2018).</li><li>Edgar, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+13+Blastomere+Culture+and+Analysis.">Chapter 13 Blastomere Culture and Analysis.</a> Methods in Cell Biology. 48, 303-321 (1995).</li><li>Pelisch, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+SUMO+modification+regulates+mitotic+chromosome+assembly+and+cell+cycle+progression+in+Caenorhabditis+elegans.">Dynamic SUMO modification regulates mitotic chromosome assembly and cell cycle progression in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Communications. 5 (1), 769 (2014).</li><li>Dillingham, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+single-stranded+DNA+binding+protein+as+a+probe+for+sensitive,+real-time+assays+of+helicase+activity.">Fluorescent single-stranded DNA binding protein as a probe for sensitive, real-time assays of helicase activity.</a> Biophysical Journal. 95 (7), 3330-3339 (2008).</li><li>Ruckman, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2'-Fluoropyrimidine+RNA-based+aptamers+to+the+165-amino+acid+form+of+vascular+endothelial+growth+factor+(VEGF165).+Inhibition+of+receptor+binding+and+VEGF-induced+vascular+permeability+through+interactions+requiring+the+exon+7-encoded+domain.">2'-Fluoropyrimidine RNA-based aptamers to the 165-amino acid form of vascular endothelial growth factor (VEGF165). Inhibition of receptor binding and VEGF-induced vascular permeability through interactions requiring the exon 7-encoded domain.</a> The Journal of Biological Chemistry. 273 (32), 20556-20567 (1998).</li><li>Hughes, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+specific+inhibitors+of+SUMO-1-+and+SUMO-2/3-mediated+protein-protein+interactions+using+Affimer+(Adhiron)+technology.">Generation of specific inhibitors of SUMO-1- and SUMO-2/3-mediated protein-protein interactions using Affimer (Adhiron) technology.</a> Science Signaling. 10 (505), eaaj2005 (2017).</li><li>Lopata, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affimer+proteins+for+F-actin:+novel+affinity+reagents+that+label+F-actin+in+live+and+fixed+cells.">Affimer proteins for F-actin: novel affinity reagents that label F-actin in live and fixed cells.</a> Scientific Reports. 8 (1), 6572 (2018).</li><li>Gilbreth, R. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isoform-specific+monobody+inhibitors+of+small+ubiquitin-related+modifiers+engineered+using+structure-guided+library+design.">Isoform-specific monobody inhibitors of small ubiquitin-related modifiers engineered using structure-guided library design.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (19), 7751-7756 (2011).</li><li>Berndt, A., Wilkinson, K. A., Heimann, M. J., Bishop, P., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+characterization+of+the+properties+of+SUMO1-specific+monobodies.">In vivo characterization of the properties of SUMO1-specific monobodies.</a> Biochemical Journal. 456 (3), 385-395 (2013).</li></ol>

Burada kmutag-fl kullanımı, Rekombinant protein, sabit memelinin hücrelerinde Sumo fonksiyonel çalışmalar ve disseke nematod gonads için tanıtmak. KmUTAG-fl bir stres toleranslı Pan-SUMO özel reakajdır tanır ve yerel SUMO konjuti proteinleri ve SUMO zincirleri yakalar. SUMO 'nun üçüncül yapısı son derece iyi bir şekilde saklanmış olduğundan, ek model ve model olmayan sistemlerin SUMO türevleri kmUTAG-fl reakajıyla analiz edilebilir. Bu nedenle, KmUTAG-fl geleneksel antikor boyama protokolleri içi...

Bu yöntemin amacı, rekombinant SUMO-bindirme UTAG (ULP Domain Tag) proteini kullanarak Sumo-konjueli proteinlerin çalışma ve analizini kolaylaştırmaktır. Aşağıda ayrıntılı olarak, UTAG diğer reaktifler ve yaklaşımlar arındırmak, algılamak ve SUMO-modifiye proteinleri görselleştirmek yerine kullanılabilir. Büyüme koşullarına bağlı olarak, hücreler, SUMO veya SUMO zincirleri ile değiştirilmiş yüzlerce veya binlerce protein içerebilir (gözden geçirmek için bkz: Kerscher ve al. 20061 ve kerscher 20162). Bu özel SUMO-modifiye proteinlerin fonksiyonel analizleri için önemli bir zorluk temsil eder, özellikle bir sumoylation hedef sadece bir kısmı aslında değiştirilmiş beri3. Transkripsiyon düzenlemesi, protein homeostaz, hücresel stres tepkisi ve mitoz ve Meiosis sırasında kromatin remodeling gibi temel hücresel süreçlerde rollerine ek olarak; Şimdi, sumo, sumo-modifiye proteinlerin ve sumo yolu bileşenlerinin kanser ve nörodejeneratif bozukluklar gibi patolojiler için biyolojik olarak potansiyeline sahip olduğu yeterince açık hale gelmiştir4,5,6 ,7. Bu, çeşitli hücreler ve örneklerde SUMO-değiştirilmiş proteinlerin algılanması ve işlevsel analizi için sağlam, güvenilir ve kolaylıkla kullanılabilen araçlara ve yenilikçi yaklaşımlara ihtiyaç duydukları altını çiziyor.
Birçok sistemde, sumo spesifik antikorlar, sumo modifiye proteinlerin algılama, yalıtım ve fonksiyonel analizleri için tercih edilen reaktifler8,9. Ancak, bazı piyasadaki Sumo özgü antikorlar pahalı, miktar veya kullanılabilirlik sınırlı, çılgınca değişken benzeşimleri ve çapraz-reaktivite sergiler eğilimli, ve bazı durumlarda eksikliği tekrarlanabilirlik10. Bir alternatif yaklaşım, dönüştürülmüş hücreler ve organizmalarda epitopu etiketli Sumo ifadesidir, fakat epitopu etiketlerini Sumo 'ya bağlamak, konjugasyonu protein hedefleri11' e yapay olarak düşürebilir. Ayrıca, dönüştürülmüş hücreler veya dokularda değerlendirildiğinde epiterler yararlı değildir.
Ulp1, hem SUMO öncüleri hem de SUMO-konjuli proteinlerin12' sini işleyen S. cerevisiae 'den kullanılan bir sumo proteaz. Biz serendipitous gözlem dayalı UTAG reaktif geliştirilen katalitik sistein bir mutasyon (C580S) içinde Ulp1's SUMO işleme ULP domain (UD) sadece Sumo yarık önler ama aynı zamanda tuzaklar Sumo-konjuge proteinleri yüksek avidite12. Basitlik için, bu karboky-Terminal SUMO-bindirme Ulp1 (C580S) parçası UTAG (UD TAG için kısa) olarak adlandırılır. UTAG, SUMO-modifiye proteinlerin yalıtımı ve tespiti için kullanılan anti-SUMO antikorları için yararlı bir alternatif gösteren rekombinant Pan-SUMO bindirme proteindir. Önemlisi, özellikle yerel-katlanmış, konjuge Sumo ve sadece bir veya birkaç epitopları Sumo tanır. Hem protein istikrar ve UTAG SUMO bağlama gücü geliştirmek için, biz stres toleranslı Maya Kluyveromyces marxianus (km) utag bir varyantı oluşturdu. KmUTAG, SUMO-conjugates ' i nanomolar yakınlık13ile sıkıca bağlar. Ayrıca, kmutag yüksek sıcaklıklara (42 °c), azaltıcı maddeler (5 mm tcep-Tris (2-karbokoksit) phosphine hidroklorür), denatüranlar (en fazla 2 M Urea), oksitleyici maddeler (0,6% hidrojen peroksitler) ve Non-İyonik deterjanlar dayanıklıdır. Bu stres toleransı, sert arıtma durumu ve uzun süreli kuluçak süreleri sırasında yararlıdır, istikrar ve SUMO bindirme etkinliğini sağlayarak. Ancak, KmUTAG 'ın SUMO bindirme aktivitesi, sistein değiştiren reaktifler, iyonik deterjanlar ve tam denatüre protein özler ile uyumsuzdur. KmUTAG 'ın olağanüstü yakınlık ve özellikleri, bu reaktif, birden fazla türün sumoylated proteinlerin çalışması için standart repertuar bir parçası haline gelebilir gösterir.
Burada bir rekombinant floresan mCherry-KmUTAG Fusion protein (kmUTAG-FL) kullanarak memeliler hücrelerinde ve nematdes içinde SUMO-modifiye proteinleri algılamak için basit bir yöntem sunuyoruz.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>16% Paraformaldehyde (formaldehyde) aqueous solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Well Cell Culture Plates</td>
			<td>Genesee Scientific/Olympus Plastics</td>
			<td>25-105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-545-003</td>
			<td>Used as a secondary antibody for mouse monoclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Gibco 14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dylight 488 conjugated AffiniPure Goat Anti-Moue IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-485-146</td>
			<td>Used as a secondary antibody for mouse monoclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Coverglass for Growth Cover Glasses</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12545101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLUORO-GEL II with DAPI</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>50-246-93)</td>
			<td>Mounting media in step 1.11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLUORO-GEL with DABCO</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>17985-02</td>
			<td>With DAPI added to 1 &#181;g/mL; mounting media in step 2.2.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine-HCl</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP3815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine-HCl</td>
			<td>ACROS Organics</td>
			<td>6000-43-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KmUTAG-fl</td>
			<td>Kerafast</td>
			<td></td>
			<td>KmUTAG reagents are available on Kerafast.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oneblock Western-CL blocking buffer</td>
			<td>Prometheus</td>
			<td>20-313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, Phosphate Buffered Saline, 10X Solution</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP3994</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNT2 cell line</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>95012613</td>
			<td>Normal prostate epithelium immortalized with SV40.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSPOT1</td>
			<td>(ChromoTek GmbH)</td>
			<td>ev-1</td>
			<td>https://www.chromotek.com/fileadmin/user_upload/pdfs/Datasheets/pSpot1_v1.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUMO 6F2</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>SUMO 6F2</td>
			<td>SUMO 6F2 was deposited to the DSHB by Pelisch, F. / Hay, R.T. (DSHB Hybridoma Product SUMO 6F2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUMO protease buffer [10x]</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>500 mM Tris-HCl, pH 8.0, 2% NP-40, 1.5 M NaCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUMO-2 Antibody 8A2</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>SUMO-2 8A2</td>
			<td>SUMO-2 8A2 was deposited to the DSHB by Matunis, M. (DSHB Hybridoma Product SUMO-2 8A2)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP-HCL</td>
			<td>GoldBio</td>
			<td>51805-45-9</td>
			<td>Used as a reducing agent at a concentration of 5mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>Used for permeablization at 0.1% in DPBS/PBS(for worms)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

localization of sumo-modified proteins using fluorescent sumo-trapping proteins

Burada proteinlerin sumoylation ve memelide hücreler ve Nematot oositlerde alt hücresel lokalizasyonu incelemek için bir yeni yöntem sunuyoruz. Bu yöntem, rekombinant değiştirilmiş bir SUMO-bindirme protein parçası, kmUTAG, stres toleranslı tomurcuklanan Maya Kluyveromyces marxianusUlp1 Sumo proteaz türetilir kullanır. Biz antikorlar kullanmadan çeşitli model sistemlerinde sumoylation okumak amacıyla kmUTAG özelliklerini adapte ettik. SUMO çalışması için, KmUTAG antikor tabanlı yaklaşımlar ile karşılaştırıldığında çeşitli avantajları vardır. Bu stres toleranslı Sumo-bindirme reaktif rekombinantly üretilir, birçok türün yerel Sumo izoformlarının tanır, ve ticari olarak mevcut antikorlar aksine ücretsiz, bilirubinin Sumo için azaltılmış yakınlık gösterir. Burada gösterilen temsili sonuçlar, memeli doku kültürü hücrelerinde ve Nematot oositlerde SUMO konjugatın lokalizasyonunu içerir.

KmUTAG-fl bir rekombinant, mCherry Tagged SUMO-bindirme protein. Kmutag-fl üretmek için, pSPOT1 bakteriyel ekspresyonu Plasmid içine bir kodon optimize MCherry-kmutag klonlanmış (Şekil 1). İndüksiyon sonrası, kmUTAG-fl proteini spot-TRAP üzerinde temizlenmesi, eluted, ve daha fazla kullanım kadar dondurulmuş. KmUTAG-fl SUMO bindirme etkinliğini sağlamak için, biz SUMO1-konjugated boncuklar ve bir SUMO-CAT Fusion protein (veri gösterilmez, anca...

Watch this Scientific Journal Video about Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins at JoVE.com

Localization of SUMO-modified Proteins Using Fluorescent Sumo-trapping Proteins

SUMO temel ve son derece uyumlu, küçük Ubiquitin-gibi değiştirici protein. Bu protokolde biz bir stres toleranslı rekombinant SUMO-bindirme proteini (kmUTAG) yerel, etiketlenmemiş SUMO konjugleri ve çeşitli hücre türlerinde lokalizasyonu görselleştirmek için kullanımını tarif ediyoruz.

Floresan Sumo-bindirme proteinleri kullanarak SUMO-modifiye proteinlerin lokalizasyonu

Here we are presenting a novel method to study the sumoylation of proteins and their sub-cellular localization in mammalian cells and nematode oocytes. ...

Bu protokolün önemi çeşitli ökaryotik hücrelerde protein değiştirici SUMO tespiti için yeni bir floresan SUMO-yakalama UTAG proteinkullanımıdır. Bu tekniğin en büyük avantajı, memeli doku kültürü ve nematod gonadları da dahil olmak üzere çeşitli hücrelerde SUMO'nun antikorsuz olarak algılanması için basit bir protokoldür. SUMO kanser ve nörodejeneratif bozukluklarda önemli roller oynar ve bu da SUMO modifiye edilmiş proteinlerin saptanması ve fonksiyonel analizi için sağlam ve güvenilir araçlara duyulan ihtiyacın altını çizer.SUMO çok iyi korunduğundan, floresan SUMO yakalama UTAG proteini birçok farklı organizmada konjuge SUMO'yu etiketlemek için kullanılabilir. Bu video memeli hücrelerinde kullanımını göstermektedir. Buna ek olarak, tam metin nematod oositler kullanımını açıklar.Bu tekniğin görsel gösterimi, boyama ve SUMO tespiti nden önce hücrelerin tedavisi için kritik ipuçları sağlar. Başlamak için, 22 milimetrelik yuvarlak kapak üzerinde tercih doku kültürü hücreleri büyümek kadar altı iyi TC plakaları içinde fişleri 70-80% confluent. Hücreleri bir mililitre DPBS ile kısa bir süre yıkayın.Hücreleri düzeltmek için, her kuyuya iki mililitre taze %4 PFA ve DPBS ekleyin. Hücreleri oda sıcaklığında 20 dakika kuluçkaya yatırın. Sabit hücreleri bir mililitre DPBS'de beş dakika boyunca üç kez yıkayın ve tabağı somunlayın.Hücreleri permeabilize etmek için, DPBS%1 Triton X-100 ile 15 dakika kuluçkaya yatırın. Hücreleri eskisi gibi tekrar yıkayın. Hücreleri 10 saniye boyunca 1 molar glisin HCL pH 2 500 mikrolitre ile kuluçkaya yatırın.Daha sonra 10X SUMO Proteaz tampon 500 mikrolitre ile hemen pH nötralize, veya SPB. Hücreleri eskisi gibi yıkadıktan sonra kapak fişlerini kuyudan çıkarın ve nem odasına yerleştirin. Sadece UTAG-FL boyama için, bir tüpte beş milimolar TCEP içeren 1X SPB 100 mikrolitre ile UTAG-FL bir mikrogram karıştırın.Daha sonra, pipet kapağı kayma hücreleri üzerine karışımı ve nem odasında bir saat oda sıcaklığında kuluçka. Kapak fişlerini yıkamak için, pipet 200 mikrolitre DPBS her kapak üzerinde kayma ve yerinde 10 dakika bekletin. Yıkamayı iki kez daha tekrarlayın.Kapak fişlerini son yıkamadan çıkarın ve bir damla montaj ortamıyla önceden temizlenmiş bir mikroskopi slaytına ters çevirin. Örnekleri mikroskop altında görüntülemeden önce bir gecede 20 derece lik bir dondurucuda saklayın. DAPI ve Texas Red için uygun filtre kümelerini kullanarak hücreleri görselleştirin.Sumo ve sabit nematod gonadları nasıl etiketlenir konusunda bir protokol için tam metne bakın. Memeli hücrelerini etiketleme oldukça basit iken, nematod oositetiketleme gonad diseksiyonları önceden eğitim gerektirir. KmUTAG-FL sabit PMT2 hücreleri ile kuluçka belirgin bir nükleer boyama gösterdi.Hem yaygın nükleer boyama hem de farklı nükleer odaklar görülüyordu. Nükleer lokalizasyon DAPI ile birlikte boyama kullanılarak doğrulandı. KmUTAG-FL'nin SUMO yakalama aktivitesi ile tutarlı olarak, nükleer lokalizasyon deseni SUMO23 boyamasını andırıyordu.Anti-SUMO23 8A2 antikor ile birlikte boyama SUMO23 sinyali ile KmUTAG-FL'nin birlikte lokalizasyonunu doğruladı. Bu memeli hücrelerinde SUMO23 tespit kmUTAG-FL etkinliğini doğrular. Yumurta üreten yetişkin hermafrodit c izole gonadlar.elegans nematodlar anti-SUMO antikor ile etiketlendi. Önceki raporlarla tutarlı olarak, anti-SUMO antikor başlangıçta geç miyotik profaze oositlerin nükleer plazmına lokalize. Daha sonra nükleer zarf bozuldu ve kromozomlar metafaz plaka doğru kongre olarak eşleştirilmiş homologlar merkezi halka kompleksi yeniden dağıtıldı.Paralel preparatlarda KmUTAG-FL etiketli gondlar da benzer desenler ortaya koymuştur. KmUTAG-FL, nükleoplazm etiketlemeden, yumurtalar nükleer zarf arıza işlemini başlatıp tamamladığı için halka kompleksine konsantre olmaya geçti. Bu sonuçlar KmUTAG-FL'yi c'deki miyozis ve SUMO ile ilgili süreçlerin analizinde yararlı bir araç olarak doğrular.elegans ve muhtemelen diğer nematodlar. Fiksasyon yaparken, taze paraformaldehit ve KmUTAG tarafından tanınabilir böylece sumo doğal katlanmış tutmak için kısa bir fiksasyon süresi kullanmak önemlidir. SUMO'nun üçüncül yapısı son derece korunduğundan, ek model ve model olmayan sistemlerden SUMO varyantlarının KmUTAG-FL reaktifi ile analiz edilmesi çok olasıdır.Şu anda, hücresel stres sırasında SUMO işlevini incelemek için bu yeni floresan SUMO-yakalama UTAG protein kullanıyoruz. Son olarak, fiksatif paraformaldehit kullanan tüm adımların bir laboratuvar güvenlik başlığında yapılması ve bu reaktifin düzgün bir şekilde atılması gerektiğini lütfen unutmayın.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Identification of Plant Ice-binding Proteins Through Assessment of Ice-recrystallization Inhibition and Isolation Using Ice-affinity Purification

Bitki Buz yakınlık Arıtma kullanma Buz yeniden kristalleşme İnhibisyon ve İzolasyonu Değerlendirilmesi sayesinde Proteinler Buz bağlayıcı tanımlanması

Ice-binding proteins (IBPs) belong to a family of stress-induced proteins that are synthesized by certain organisms exposed to subzero temperatures. In ...

Detergent-free Ultrafast Reconstitution of Membrane Proteins into Lipid Bilayers Using Fusogenic Complementary-charged Proteoliposomes.

Deterjan-Alerjik membran proteinlerinin Ultrafast sulandırma tamamlayıcı-Proteoliposomes ücret Fusogenic kullanarak Lipid Bilayers içine.

Detergents are indispensable for delivery of membrane proteins into 30-100 nm small unilamellar vesicles, while more complex, larger model lipid bilayers ...

Detection of Detergent-sensitive Interactions Between Membrane Proteins

Membran proteinlerinin Hofstede deterjan duyarlı tespiti

Our ability to explore protein-protein interactions is the key to understanding regulatory connections in the cell. However, detection of protein-protein ...

How to Quantify the Fraction of Photoactivated Fluorescent Proteins in Bulk and in Live Cells

Nasıl Photoactivated floresan proteinler toplu olarak ve canlı hücrelerdeki kısmını ölçmek için

Photoactivatable and -convertible fluorescent proteins (PA-FPs) have been used in fluorescence live-cell microscopy for analyzing the dynamics of cells ...

Fluorescent Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels

Floresan gümüş Polyacrylamide jeller proteinlerin boyama

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide ...

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

Rekombinant füzyon protein flüoresan proteaz tahlil Platform ve onların jel Renaturation kullanımı

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...

Characterizing Cellular Proteins with In-cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins

Hücre İçi Hızlı Fotokimyasal Oksidasyon ile Hücresel Proteinlerin Karakterizasyonu

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting method used to characterize protein structure and interactions. ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Olgun Pirincin Enine Kesiti (Oryza sativa L.) Hareketsizleştirme Desteği Olarak Pipet İpuçlarını Kullanarak Elektron Mikroskopi Görüntülemesini Taramak için Çekirdekler

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Optimized Incorporation of Alkynyl Fatty Acid Analogs for the Detection of Fatty Acylated Proteins using Click Chemistry

Click Kimya Kullanarak Yağ Asillenmiş Proteinlerin Tespiti için Alkinil Yağ Asidi Analoglarının Optimize Edilmiş Birleştirilmesi

Fatty acylation, the covalent addition of saturated fatty acids to protein substrates, is important in regulating a myriad of cellular functions in ...

Production of Recombinant PRMT Proteins using the Baculovirus Expression Vector System

Baculovirüs Ekspresyon Vektör Sistemi Kullanılarak Rekombinant PRMT Proteinlerinin Üretimi

Protein arginine methyltransferases (PRMTs) methylate arginine residues on a wide variety of proteins that play roles in numerous cellular processes. ...