Forståelse af det fysiske grundlag for protein selvsamling i celler er begrænset af mangel på passende værktøjer. De nuværende metoder lider af lav følsomhed, indirekte udlæsninger, begrænset gennemløb og/eller opløsning på befolkningsniveau. I modsætning hertil registrerer og kvantificerer vores analyse tilbøjeligheden af et protein til selvsamling in vivo med en følsom, enkelt celle, høj gennemlæsning uanset protein lokalisering eller opløselighed.
Når først forsøger analysen, at få billedet konvertering højre kan kræve nogle empiriske test for at opnå optimale betingelser for at opnå en god udlæsning på tværs af hele pladen. Analysens følsomhed kan også blive kompromitteret, hvis cytometeret ikke har separate detektionsfiltre til FRET- og acceptorsignalerne. Demonstration af proceduren med mig vil være Andrew Box, lab manager af cytometri kerne.
For at forberede en gær kultur for DAmFRET, for hver forespørgsel protein, inokulere de transformerede gær kolonier i tre eksemplarer i 200 mikroliter af en passende ikke-inducerende vækstmedium i individuelle brønde af en 96 godt runde bund kultur plade. Inkuber gærcellerne med omrystning med en 1,5 millimeter bane ved 1, 200 rotationer i minuttet ved 30 grader Celsius i 16 timer. Ved slutningen af inkubationen sedimenteres gærcellerne ved centrifugering, og supernatanterne fjernes ved kraftig inversion.
Der tilsættes 200 mikroliter af et passende induktionsmedium, og cellerne returneres til rystekubvampen i yderligere 12 timer. Ved slutningen af inkubationen, sediment gærcellerne ved centrifugering og kraftig inversion, derefter tilføje 200 mikroliter af frisk induktion medium. Derefter inkuberes cellerne med omrystning i yderligere fire timer for at reducere auto-fluorescens.
For at foto konvertere prøverne, placere pladen uden dækslet under en ultraviolet lampe udstyret med en 320 til 500 nanometer filter og en stråle kollimator placeret 45 centimeter over pladen. Tænd lampen for at foto konvertere cellerne i 25 minutter med omrystning. For DAmFRET dataindsamling, indlæse foto konverterede celler på en billeddannelse flow cytometer med ikke-colinear 488 og 561 nanometer lasere og gate fire enkelt uopbygget celler ved høj cirkularitet og et lille celleområde.
Derefter indsamles data for to til fem gange 10 til de fire enkelte celler pr. prøve i en fluorescens positiv port. I slutningen af analysen skal du bruge en ikke-foto konverteret mEos3.1 prøve til det rene donorsignal og monomeriske DsRed to for det rene acceptorsignal til at indstille kompensationen. For mere følsomhed skal du sikre dig, at FRET-detektorkanalen også betragtes som spillover-målet i analyseprogrammet.
Beregn Parameteren AmFRET som forholdet mellem det samlede FRET-signal divideret med det samlede FRET-acceptorsignal. AmFRET-profilerne af gærceller, der udtrykker fluorescerende protein alene, udviser ubetydelige AmFRET, mens gærceller, der udtrykker sig som stabile homooligomer smeltet til fluorescerende protein, udviser ensartede positive AmFRET-værdier. Billeder af celler erhvervet af billeddannelse flow cytometri afslører en diffus fluorescens i alle kanaler.
Konfokal mikroskopi af Z stakke til flere felter af celler viser en ensartet fordeling af fluorescens i hele cytosol af hver celle uden påviselige puncta. Gærceller, der udtrykker fluorophore alene eller fluorophore plus den mutante form af et humant inflammasome protein udviser ubetydelig AmFRET over hele koncentrationsområdet, hvilket indikerer en manglende evne til selv interagere. I modsætning hertil viser det vilde type inflammasome protein en DAmFRET profil med en ubetydelig AmFRET population og en høj AmFRET population.
Bemærk, at det vilde type inflammasome protein modstår selvsamling selv ved høje koncentrationer med proteinet skifte til selvsamlede form i kun en brøkdel af cellerne. Dette er en klar indikation af eksistensen af en nucleation barriere for selv-forsamling. Som bekræftet ved fluorescensbilleddannelse repræsenterer disse populationer celler, der indeholder henholdsvis opløseligt protein eller for det meste selvsamlet protein.
Faktisk bekræfter DAmFRET tidligere strukturelle data, at punkt mutant i den inflammasome forstyrrer nukleation på tværs af koncentrationer, der kan opnås ved dette udtryk system. Bemærk, at proteinudtryksprofiler i pattedyrceller, der mangler Caspase-1-udtryk, ligner dem, der observeres i gærceller. Det vigtigste skridt at huske er fotokonverteringen.
Andre vigtige trin omfatter indsamling af et tilstrækkeligt antal hændelser, der ikke er mættet for fluorescenssignal og få kompensationen korrekt. Opfølgning af analysen med passende biokemi, rationel mutagenese og strukturelle biologi tilgange kan bidrage til fuldt ud at belyse mekanismen i selv-forsamling.
