Inzicht in de fysieke basis van eiwit zelfassemblage in cellen wordt beperkt door gebrek aan geschikte instrumenten. De huidige methoden hebben last van lage gevoeligheid, indirecte uitlezingen, beperkte doorvoer en/of populatieniveauresolutie. In tegenstelling, onze test detecteert en kwantificeert de neiging van een eiwit voor zelfassemblage in vivo met een gevoelige, eencellige, hoge doorvoer uitlezing, ongeacht eiwitlokalisatie of oplosbaarheid.
Wanneer u voor het eerst de test probeert, kan het verkrijgen van de fotoconversie goed vereisen dat sommige empirische tests worden getest om optimale omstandigheden te verkrijgen voor het bereiken van een goede uitlezing over de hele plaat. De gevoeligheid van de test kan ook worden aangetast als de cytometer geen afzonderlijke detectiefilters voor de FRET- en acceptorsignalen heeft. Het aantonen van de procedure met mij zal Andrew Box zijn, de lab manager van de cytometrie kern.
Om een gistcultuur voor DAmFRET voor te bereiden, inent in voor elk queryeiwit, de getransformeerde gistkolonies in drievoud in 200 microliter van een geschikt niet-inducerende groeimedium in individuele putten van een 96 goed ronde bodemcultuurplaat. Incubeer de gistcellen met schudden met een baan van 1,5 millimeter bij 1, 200 rotaties per minuut bij 30 graden Celsius gedurende 16 uur. Aan het einde van de incubatie, sediment de gistcellen door centrifugatie en verwijder de supernatants door krachtige inversie.
Voeg 200 microliters van een geschikt inductiemedium toe en breng de cellen nog 12 uur terug naar de schuddende couveuse. Aan het einde van de incubatie, sediment de gistcellen door centrifugatie en krachtige inversie, voeg dan 200 microliters van verse inductie medium. Dan incubeer de cellen met schudden voor een extra vier uur om auto-fluorescentie te verminderen.
Om de monsters foto's, plaats de plaat zonder de cover onder een ultraviolet lamp uitgerust met een 320 tot 500 nanometer filter en een balk collimator gepositioneerd 45 centimeter boven de plaat. Zet de lamp aan om de cellen 25 minuten met schudden om te zetten. Voor het verzamelen van DAmFRET-gegevens laadt u de omgezette cellen van de foto op een beeldvormingsstroomcytometer met niet-colinear 488- en 561 nanometerlasers en poort vier enkele ongebuddeerde cellen door hoge circulariteit en een klein celgebied.
Verzamel vervolgens gegevens voor twee tot vijf keer 10 tot de vier enkele cellen per monster binnen een fluorescentie positieve poort. Gebruik aan het einde van de analyse een niet-omgezette mEos3.1-monster voor het zuivere donorsignaal en monomeere DsRed twee voor het zuivere acceptorsignaal om de compensatie in te stellen. Voor meer gevoeligheid, ervoor te zorgen dat de FRET detector kanaal wordt ook beschouwd als de spillover doel in het analyseprogramma.
Bereken de parameter AmFRET als de verhouding van het totale FRET-signaal gedeeld door het totale FRET-acceptorsignaal. De AmFRET profielen van gistcellen uitdrukken fluorescerende eiwitten alleen vertonen verwaarloosbare AmFRET, terwijl gistcellen uitdrukken als stabiele homooligomer gesmolten tot de fluorescerende eiwit tonen uniforme positieve AmFRET waarden. Beelden van de cellen verworven door beeldvorming stroom cytometrie onthullen een diffuse fluorescentie in alle kanalen.
Confocale microscopie van Z-stapels voor meerdere cellenvelden vertoont een uniforme verdeling van de fluorescentie over de cytosol van elke cel zonder detecteerbare puncta. Gistcellen die alleen de fluorofofof de fluorofofoër plus de gemuteerde vorm van een menselijk ontvlammend eiwit uitdrukken vertonen verwaarloosbare AmFRET over het gehele concentratiebereik, wat wijst op een onvermogen om zelf te interageren. In tegenstelling, het wilde type ontstekingsmiddel toont een DAmFRET profiel met een verwaarloosbare AmFRET populatie en een hoge AmFRET populatie.
Merk op dat het wilde type ontstekingsremmende eiwit bestand is tegen zelfassemblage, zelfs bij hoge concentraties met het eiwit overschakelen naar de zelf geassembleerde vorm in slechts een fractie van de cellen. Dit is een duidelijke indicatie van het bestaan van een nucleatiebarrière voor zelfassemblage. Zoals bevestigd door fluorescentie beeldvorming, deze populaties vertegenwoordigen cellen die ofwel oplosbaar eiwit bevatten alleen of meestal zelfgeassembleerde eiwitten respectievelijk.
DAmFRET bevestigt inderdaad eerdere structurele gegevens dat het punt mutant in het ontstekingsmiddel de nucleatie verstoort over de concentraties die door dit expressiesysteem kunnen worden bereikt. Merk op dat eiwit expressie profielen in zoogdiercellen die Caspase-1 expressie gebrek lijken op die waargenomen in gistcellen. De belangrijkste stap om te onthouden is de foto conversie.
Andere cruciale stappen zijn het verzamelen van een voldoende aantal gebeurtenissen die niet verzadigd zijn voor fluorescentiesignaal en het correct krijgen van de compensatie. Het opvolgen van de test met de juiste biochemie, rationele mutagenese en structurele biologie benaderingen kan helpen om volledig te verduidelijken het mechanisme van de zelfassemblage.