Das Verständnis der physikalischen Grundlagen der Protein-Selbstmontage in Zellen wird durch den Mangel an geeigneten Werkzeugen eingeschränkt. Aktuelle Methoden leiden unter geringer Empfindlichkeit, indirekten Auslesungen, begrenztem Durchsatz und/oder Auflösung auf Bevölkerungsebene. Im Gegensatz dazu erkennt und quantifiziert unser Assay die Neigung eines Proteins zur Selbstmontage in vivo mit einer empfindlichen, einzelligen, hochdurchsatzreichen Auslesung unabhängig von Proteinlokalisierung oder Löslichkeit.
Wenn Sie den Test zum ersten Mal ausprobieren, kann es einige empirische Tests erfordern, um optimale Bedingungen für eine gute Auslesung über die gesamte Platte zu erhalten. Die Empfindlichkeit des Assays könnte auch beeinträchtigt werden, wenn das Zytometer keine separaten Detektionsfilter für die FRET- und Akzeptorsignale hat. Das Verfahren wird mit mir demonstriert, Andrew Box, der Laborleiter des Zytometrie-Kerns.
Um eine Hefekultur für DAmFRET vorzubereiten, impfen Sie für jedes Abfrageprotein die transformierten Hefekolonien in Dreifache in 200 Mikrolitern eines geeigneten, nicht induzierenden Wachstumsmediums in einzelnen Brunnen einer 96 gut runden Bodenkulturplatte. Inkubieren Sie die Hefezellen mit Schütteln mit einer Umlaufbahn von 1,5 Millimetern bei 1,200 Umdrehungen pro Minute bei 30 Grad Celsius für 16 Stunden. Am Ende der Inkubation die Hefezellen durch Zentrifugation sedimentieren und die Überstandmittel durch gewaltsame Umkehrung entfernen.
Fügen Sie 200 Mikroliter eines geeigneten Induktionsmediums hinzu und geben Sie die Zellen für weitere 12 Stunden in den Schüttelinkubator zurück. Am Ende der Inkubation die Hefezellen durch Zentrifugation und kraftvolle Inversion sedimentieren und dann 200 Mikroliter frisches Induktionsmedium hinzufügen. Dann inkubieren Sie die Zellen mit Schütteln für weitere vier Stunden, um die Autofluoreszenz zu reduzieren.
Um die Proben zu fotografieren, legen Sie die Platte ohne Abdeckung unter eine UV-Lampe, die mit einem 320 bis 500 Nanometer Filter und einem 45 Zentimeter über der Platte positionierten Strahlkollimator ausgestattet ist. Schalten Sie die Lampe ein, um die Zellen 25 Minuten lang mit Schütteln zu fotografieren. Für die DAmFRET-Datenerfassung laden Sie die fotokonvertierten Zellen auf ein bildgebendes Durchflusszytometer mit nicht kolinearen 488- und 561-Nanometer-Lasern und vier einzelne, unbesungene Zellen durch hohe Kreisförmigkeit und eine kleine Zellfläche.
Dann sammeln Sie Daten für zwei bis fünf mal 10 zu den vier einzelzellen pro Probe innerhalb eines fluoreszenzpositiven Gates. Verwenden Sie am Ende der Analyse eine nicht-photokonvertierte mEos3.1-Probe für das reine Spendersignal und monomere DsRed zwei für das reine Akzeptorsignal, um die Kompensation einzustellen. Um mehr Empfindlichkeit zu erreichen, stellen Sie sicher, dass der FRET-Detektorkanal auch als Spillover-Ziel im Analyseprogramm betrachtet wird.
Berechnen Sie den AmFRET-Parameter als Verhältnis des gesamten FRET-Signals dividiert durch das gesamte FRET-Akzeptorsignal. Die AmFRET-Profile von Hefezellen, die allein fluoreszierendes Protein exdrücken, weisen vernachlässigbares AmFRET auf, während Hefezellen, die als stabiles Homooligomer exfusioniert werden, mit dem fluoreszierenden Protein verschmolzen sind, einheitliche positive AmFRET-Werte aufweisen. Bilder der Zellen, die durch bildgebende Durchflusszytometrie erfasst werden, zeigen eine diffuse Fluoreszenz in allen Kanälen.
Die konfokale Mikroskopie von Z-Stacks für mehrere Zellfelder zeigt eine gleichmäßige Verteilung der Fluoreszenz im Zytosol jeder Zelle ohne nachweisbare Punktias. Hefezellen, die das Fluorophor allein oder das Fluorophor sowie die mutierte Form eines menschlichen Entzündungsproteins exemitzent, weisen über den gesamten Konzentrationsbereich vernachlässigbares AmFRET auf, was auf eine Unfähigkeit zur Selbstinteraktion hindeutet. Im Gegensatz dazu zeigt das Wildtyp-Inflammasomenprotein ein DAmFRET-Profil mit einer vernachlässigbaren AmFRET-Population und einer hohen AmFRET-Population.
Beachten Sie, dass das wildartige inflammasome Protein selbst bei hohen Konzentrationen der Selbstmontage widersteht, wobei das Protein in nur einem Bruchteil der Zellen in die selbstzusammengesetzte Form wechselt. Dies ist ein klarer Hinweis auf das Vorhandensein einer Keimbarriere für die Selbstmontage. Wie durch Fluoreszenz-Bildgebung bestätigt, stellen diese Populationen Zellen dar, die entweder nur lösliches Protein oder meist selbst zusammengesetztes Protein enthalten.
Tatsächlich bestätigt DAmFRET frühere Strukturdaten, dass der Punkt mutiert im Entzündungsmittel die Keimbildung über die durch dieses Expressionssystem erreichbaren Konzentrationen stört. Beachten Sie, dass Proteinexpressionsprofile in Säugetierzellen, denen Caspase-1-Expression fehlt, denen ähneln, die in Hefezellen beobachtet werden. Der wichtigste Schritt, den Sie sich merken sollten, ist die Fotokonvertierung.
Weitere wichtige Schritte sind das Sammeln einer ausreichenden Anzahl von Ereignissen, die nicht für Fluoreszenzsignale gesättigt sind, und das Korrektwerden der Kompensation. Im Anschluss an den Test mit entsprechender Biochemie können rationale Mutagenese und strukturbiologische Ansätze dazu beitragen, den Mechanismus der Selbstmontage vollständig aufzuklären.
