कोशिकाओं में प्रोटीन आत्म-असेंबली के भौतिक आधार को समझना उचित उपकरणों की कमी से सीमित है। वर्तमान तरीके कम संवेदनशीलता, अप्रत्यक्ष readouts, सीमित थ्रूपुट, और/या जनसंख्या स्तर संकल्प से पीड़ित हैं । इसके विपरीत, हमारी परख एक संवेदनशील, एकल कोशिका, प्रोटीन स्थानीयकरण या घुलनशीलता के बावजूद उच्च थ्रूपुट रीडआउट के साथ वीवो में आत्म-असेंबली के लिए प्रोटीन की प्रवृत्ति का पता लगाती है और मात्रा देती है।
जब पहली बार परख की कोशिश कर रहा है, फोटो रूपांतरण सही हो रही है पूरी थाली में एक अच्छा readout प्राप्त करने के लिए इष्टतम शर्तों को प्राप्त करने के लिए कुछ अनुभवजन्य परीक्षण की आवश्यकता हो सकती है । परख की संवेदनशीलता से भी समझौता किया जा सकता है यदि साइटोमीटर में FRET और स्वीकारकर्ता संकेतों के लिए अलग से पहचान फिल्टर नहीं है। मेरे साथ प्रक्रिया का प्रदर्शन एंड्रयू बॉक्स, साइटोमेट्री कोर के प्रयोगशाला प्रबंधक होगा ।
DAmFRET के लिए एक खमीर संस्कृति तैयार करने के लिए, हर क्वेरी प्रोटीन के लिए, एक 96 अच्छी तरह से गोल नीचे संस्कृति प्लेट के व्यक्तिगत कुओं में एक उपयुक्त गैर-उत्प्रेरण विकास माध्यम के 200 माइक्रोलीटर में बदली हुई खमीर उपनिवेशों को टीका लगाते हैं। 1.5 मिलीमीटर कक्षा में 1.5 मिलीमीटर कक्षा के साथ 1.5 मिलीमीटर कक्षा के साथ खमीर कोशिकाओं को इनक्यूबेट, 200 प्रति मिनट 16 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर घूर्णन। इनक्यूबेशन के अंत में, अपकेंद्रित्र द्वारा खमीर कोशिकाओं तलछट और सशक्त उलटा द्वारा supernatants हटा दें ।
एक उपयुक्त प्रेरण माध्यम के 200 माइक्रोलीटर जोड़ें और कोशिकाओं को एक और 12 घंटे के लिए मिलाते हुए इनक्यूबेटर में वापस करें। इनक्यूबेशन के अंत में, अपकेंद्री और सशक्त उलटफेर द्वारा खमीर कोशिकाओं तलछट, तो ताजा प्रेरण माध्यम के २०० माइक्रोलीटर जोड़ें । फिर ऑटो फ्लोरेसेंस को कम करने के लिए अतिरिक्त चार घंटे तक मिलाते हुए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
नमूनों को बदलने के लिए, प्लेट को 320 से 500 नैनोमीटर फिल्टर और प्लेट के ऊपर 45 सेंटीमीटर तैनात बीम कोलिमेटर के साथ लगे पराबैंगनी दीपक के नीचे कवर के बिना प्लेट रखें। दीपक को फोटो में बदलने के लिए चालू करें कोशिकाओं को मिलाते हुए 25 मिनट के लिए परिवर्तित करें। DAmFRET डेटा संग्रह के लिए, फोटो परिवर्तित कोशिकाओं को गैर-कॉलिनियर 488 और 561 नैनोमीटर लेजर और उच्च परिपत्रता और एक छोटे सेल क्षेत्र द्वारा गेट चार एकल अनबुडेड कोशिकाओं के साथ इमेजिंग फ्लो साइटोमीटर पर लोड करें।
फिर फ्लोरेसेंस पॉजिटिव गेट के भीतर प्रति सैंपल चार सिंगल सेल्स को दो से पांच गुना 10 के लिए डेटा इकट्ठा करें । विश्लेषण के अंत में, मुआवजे को निर्धारित करने के लिए शुद्ध स्वीकार्य संकेत के लिए शुद्ध दाता संकेत और मोनोमेरिक डीएसड्रेड दो के लिए एक गैर-फोटो परिवर्तित mEos3.1 नमूने का उपयोग करें। अधिक संवेदनशीलता के लिए, यह सुनिश्चित करें कि FRET डिटेक्टर चैनल को विश्लेषण कार्यक्रम में स्पिलओवर लक्ष्य के रूप में भी माना जाता है।
कुल FRET स्वीकारकर्ता संकेत द्वारा विभाजित कुल FRET संकेत के अनुपात के रूप में AmFRET पैरामीटर की गणना करें। अकेले फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करने वाली खमीर कोशिकाओं के AmFRET प्रोफाइल नगण्य AmFRET प्रदर्शित करते हैं, जबकि खमीर कोशिकाओं को फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए जुड़े स्थिर होमोलिगोमर के रूप में व्यक्त एक समान सकारात्मक AmFRET मूल्यों का प्रदर्शन । इमेजिंग फ्लो साइटोमेट्री द्वारा प्राप्त कोशिकाओं की छवियां सभी चैनलों में एक फैलावित फ्लोरेसेंस प्रकट करती हैं।
कोशिकाओं के कई क्षेत्रों के लिए जेड स्टैक की कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी प्रत्येक कोशिका के साइटोसोल में फ्लोरेसेंस का एक समान वितरण दिखाती है जिसमें कोई पता लगाने योग्य विराम के साथ नहीं है। खमीर कोशिकाओं अकेले फ्लोरोफोर या फ्लोरोफोर व्यक्त प्लस एक मानव भड़काऊ प्रोटीन के उत्परिवर्ती रूप पूरी एकाग्रता रेंज पर नगण्य AmFRET प्रदर्शन स्वयं के लिए एक असमर्थता का संकेत बातचीत । इसके विपरीत, जंगली प्रकार के सूजन प्रोटीन एक नगण्य AmFRET आबादी और एक उच्च AmFRET आबादी के साथ एक DAmFRET प्रोफ़ाइल को दर्शाता है ।
ध्यान दें कि जंगली प्रकार के सूजन प्रोटीन कोशिकाओं के केवल एक अंश में स्वयं-इकट्ठे रूप में स्विच करने वाले प्रोटीन के साथ उच्च सांद्रता पर भी आत्म-असेंबली का विरोध करता है। यह आत्म-असेंबली के लिए नाभिक बाधा के अस्तित्व का स्पष्ट संकेत है। फ्लोरेसेंस इमेजिंग द्वारा पुष्टि की गई, ये आबादी उन कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करती है जिनमें क्रमशः केवल घुलनशील प्रोटीन या ज्यादातर स्वयं-इकट्ठा प्रोटीन होता है।
दरअसल, DAmFRET पूर्व संरचनात्मक डेटा की पुष्टि करता है कि ज्वलनशील में उत्परिवर्ती बिंदु इस अभिव्यक्ति प्रणाली द्वारा प्राप्त सांद्रता में नाभिक को बाधित करता है। ध्यान दें कि स्तनधारी कोशिकाओं में प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रोफाइल जिनमें कैस्पास-1 अभिव्यक्ति की कमी होती है, खमीर कोशिकाओं में देखे गए लोगों के समान होते हैं। याद रखने के लिए सबसे महत्वपूर्ण कदम फोटो रूपांतरण है।
अन्य महत्वपूर्ण कदमों में पर्याप्त संख्या में ऐसी घटनाओं को एकत्र करना शामिल है जो फ्लोरेसेंस सिग्नल के लिए संतृप्त नहीं हैं और मुआवजा सही प्राप्त कर रहे हैं । उपयुक्त जैव रसायन के साथ परख के बाद, तर्कसंगत म्यूटेनेसिस और संरचनात्मक जीव विज्ञान दृष्टिकोण आत्म-असेंबली के तंत्र को पूरी तरह से स्पष्ट करने में मदद कर सकते हैं।