細胞内のタンパク質自己集合の物理的基礎を理解することは、適切なツールの欠如によって制限されます。現在の方法は、感度の低さ、間接読み出し、スループットの制限、および/または母集団レベルの解像度に苦しんでいます。対照的に、当社のアッセイは、タンパク質の局在化や溶解度に関係なく、感受性、単一細胞、高スループット読み出しを用いて生体内での自己集合性のタンパク質の傾向を検出し、定量化します。
最初にアッセイを試す際に、写真変換を正しく行うには、プレート全体で良好な読み出しを達成するための最適な条件を得るために、いくつかの経験的なテストが必要な場合があります。サイトメーターにFRET信号とアクセクサシグナル用の個別の検出フィルタがない場合、アッセイの感度も損なわれる可能性があります。私と一緒に手順を実証するのは、サイトメトリーコアのラボマネージャーであるアンドリュー・ボックスです。
DAmFRET用の酵母培養を調製するために、すべてのクエリタンパク質について、96ウェルラウンドボトム培養プレートの個々のウェルに適切な非誘導成長培地の200マイクロリットルの三重に変換された酵母コロニーを接種する。1.5ミリメートルの軌道で揺れる酵母細胞を1.5ミリメートルの軌道で、摂氏30度で毎分200回転で16時間インキュベートします。インキュベーションの終了時に、遠心分離により酵母細胞を沈降させ、強引な反転によって上清を除去する。
適切な誘導媒体の200マイクロリットルを加え、さらに12時間、細胞を振るインキュベーターに戻します。インキュベーションの終わりに、遠心分離および強引な反転によって酵母細胞を沈下し、次に200マイクロリットルの新鮮な誘導培地を加える。次に、細胞をさらに4時間振ってインキュベートし、自動蛍光を軽減します。
サンプルを写真変換するには、320~500ナノメートルのフィルターを取り付けた紫外線ランプの下にカバーを入れずにプレートを置き、プレートの上に45センチメートル配置されたビームコリメーターを配置します。ランプをオンにして、揺れで25分間セルを変換します。DAmFRETデータ収集の場合、写真変換された細胞を非共線488および561ナノメートルレーザーでイメージングフローサイトメーターにロードし、高い円形度と小さな細胞領域によって4つの単一の未成細胞をゲートします。
次に、蛍光陽性ゲート内のサンプル当たり4個の単一細胞に対して2〜5倍の10倍のデータを収集します。分析の最後に、純粋なドナー信号に非写真変換mEos3.1サンプルを使用し、純粋なアクセクサシグナルにモノマーDsRed 2を使用して補償を設定します。より高い感度を確保するために、FRET検出器チャネルが解析プログラムの波及ターゲットとしても考慮されるようにしてください。
合計 FRET シグナルを FRET アクソクターシグナルで割った合計 FRET 信号の比率として、AmFRET パラメータを計算します。蛍光タンパク質を発現する酵母細胞のAmFRETプロファイルは、単独でごくわずかのアムフレを示し、安定なホモオリゴマーとして発現する酵母細胞は蛍光タンパク質に融合し、均一な正のAmFRET値を示す。細胞測定のイメージングによって得られた細胞の画像は、すべてのチャネルで拡散蛍光を明らかにします。
細胞の複数のフィールドのためのZスタックの共焦点顕微鏡は、検出可能なパンクタのない各細胞の細胞質全体の蛍光の均一な分布を示す。フルオロフォア単独またはフルオロフォアを発現する酵母細胞は、ヒトの炎症タンパク質の変異型を加えたもので、全濃度範囲にわたって僅かなAmFRETを示し、自己相互作用できないことを示す。対照的に、野生型の炎症タンパク質は、1つの無視できるAmFRET集団と1つの高いAmFRET集団を有するDAmFRETプロファイルを示す。
なお、野生型の炎症タンパク質は、細胞のほんの一部で自己集合型に切り替えて高濃度でも自己集合に抵抗する。これは、自己集合に対する核形成バリアの存在を明確に示す指標である。蛍光イメージングによって確認されたように、これらの集団は、可溶性タンパク質のみを含む細胞、または主に自己集合タンパク質をそれぞれ含む細胞を表す。
実際、DAmFRETは、インフラマソーム内の点突然変異が、この発現系によって達成可能な濃度にわたって核形成を破壊するという以前の構造データを裏付ける。なお、Caspase-1発現を欠く哺乳動物細胞におけるタンパク質発現プロファイルは、酵母細胞で観察されるものと類似している。覚えておかなす最も重要なステップは、写真変換です。
その他の重要なステップには、蛍光シグナルに対して飽和していない十分な数のイベントを収集し、補償を正しく取得することも含まれます。適切な生化学、合理的な変異生成および構造生物学のアプローチでアッセイをフォローアップすることは、自己集合のメカニズムを完全に解明するのに役立ちます。
