세포에서 단백질 자체 조립의 물리적 기초를 이해하는 것은 적절한 도구의 부족에 의해 제한됩니다. 현재 방법은 낮은 민감도, 간접 판독, 제한된 처리량 및/또는 인구 수준 해결로 인해 어려움을 겪습니다. 대조적으로, 우리의 분석은 단백질 국소화 또는 용해도에 관계없이 민감한, 단하나 세포, 높은 처리량 판독을 가진 생체 내 자기 조립을 위한 단백질의 성향을 검출하고 정량화합니다.
먼저 분석서를 시도할 때 사진 변환을 올바르게 수행하려면 전체 플레이트에서 좋은 판독을 달성하기 위한 최적의 조건을 얻기 위해 일부 경험적 테스트가 필요할 수 있습니다. 세포계에 FRET 및 수용자 신호에 대한 별도의 검출 필터가 없는 경우에도 분석의 감도가 손상될 수 있습니다. 나와 함께 절차를 시연하는 것은 앤드류 박스, 세포 측정 코어의 실험실 관리자가 될 것입니다.
DAmFRET에 대한 효모 문화를 준비하기 위해, 모든 쿼리 단백질에 대해, 96 개의 잘 둥근 바닥 배양 플레이트의 개별 우물에서 적절한 비 유도 성장 배지의 200 마이크로 리터에서 삼중으로 변형 된 효모 콜로니를 접종한다. 효모 세포를 1.5밀리미터 궤도에서 1.5밀리미터 궤도로 흔들어 16시간 동안 섭씨 30도에서 분당 200회 회전한다. 인큐베이션의 끝에서, 원심분리에 의해 효모 세포를 퇴적시키고 강력한 반전에 의해 초월제를 제거한다.
적절한 유도 배지의 200 마이크로리터를 추가하고 세포를 흔들리는 인큐베이터로 12시간 동안 되돌려 보입니다. 인큐베이션의 끝에서, 원심 분리 및 강력한 반전에 의해 효모 세포를 퇴적, 다음 신선한 유도 매체의 200 마이크로 리터를 추가. 그런 다음 자동 형광을 줄이기 위해 추가로 4 시간 동안 흔들어 세포를 배양합니다.
샘플을 변환하려면 320~500나노미터 필터가 장착된 자외선 램프 아래에 덮개없이 플레이트를 놓고 플레이트 위에 45cm 의 빔 콜리메이터가 배치됩니다. 램프를 켜서 사진으로 셀을 흔들어 25분 동안 변환합니다. DAmFRET 데이터 수집의 경우, 사진 변환된 세포를 비선형 488 및 561 나노미터 레이저로 이미징 흐름 사이토미터에 적재하고 높은 원형 및 작은 세포 면적에 의해 4개의 단일 비신진 세포를 게이트로 로드합니다.
그런 다음 형광 양성 게이트 내에서 샘플 당 4 개의 단일 세포에 2 ~ 5 회 10 에 대한 데이터를 수집합니다. 분석의 끝에서, 순수한 기증자 신호 및 단황 DsRed 2에 대한 비 사진 변환 mEos3.1 샘플을 사용하여 순수한 수용자 신호에 대한 보상을 설정합니다. 보다 민감도를 높이기 위해 FRET 검출기 채널도 분석 프로그램의 유출 대상으로 간주되도록 합니다.
총 FRET 동의어 신호로 나눈 총 FRET 신호의 비율로 AmFRET 매개 변수를 계산합니다. 형광 단백질을 단독으로 표현하는 효모 세포의 AmFRET 프로파일은 무시할 수 있는 AmFRET를 나타내며, 효모 세포는 형광 단백질에 융합된 안정적인 호모올리고머로 표현되는 동안 균일한 양성 AmFRET 값을 나타낸다. 이미징 흐름 세포측정에 의해 획득한 세포의 이미지는 모든 채널에서 확산된 형광을 드러낸다.
세포의 다중 필드에 대한 Z 스택의 공초점 현미경 검사는 검출 가능한 말장난이없는 각 세포의 사이토솔 을 통해 형광의 균일 한 분포를 나타낸다. 불소경 단독 또는 형광을 발현하는 효모 세포는 인간 인플루마솜 단백질의 돌연변이 형태와 자가 상호 작용할 수 없음을 나타내는 전체 농도 범위에 걸쳐 무시할 수 있는 AmFRET를 나타낸다. 대조적으로, 야생 모형 인염증성 단백질은 1개의 무시할 수 있는 AmFRET 인구 및 1개의 높은 AmFRET 인구와 DAmFRET 단면도를 보여줍니다.
야생형 인플루마좀 단백질은 고농도에서도 자체 조립에 저항하며, 단백질은 세포의 극히 일부에 불과한 자체 조립 형태로 전환한다. 이것은 자기 조립에 핵 장벽의 존재의 명확한 표시입니다. 형광 화상 진찰에 의해 확인된 바와 같이, 이 인구는 수용성 단백질만 또는 주로 자기 조립한 단백질을 포함하는 세포를 각각 나타냅니다.
실제로, DAmFRET는 인화성의 점 돌연변이가 이 발현 시스템에 의해 달성 가능한 농도에 걸쳐 핵화를 방해하는 이전 구조 데이터를 확증합니다. Caspase-1 발현이 부족한 포유류 세포에서 단백질 발현 프로파일은 효모 세포에서 관찰된 것과 유사합니다. 기억해야 할 가장 중요한 단계는 사진 변환입니다.
다른 중요한 단계에는 형광 신호에 대해 포화되지 않은 충분한 수의 이벤트를 수집하고 보상을 올바르게 얻는 것이 포함됩니다. 적절한 생화학, 합리적 돌연변이 발생 및 구조 생물학 접근법으로 분석법을 따라면 자가 조립 메커니즘을 완전히 해명하는 데 도움이 될 수 있습니다.
