Forstå det fysiske grunnlaget for protein selvmontering i celler er begrenset av mangel på passende verktøy. Nåværende metoder lider av lav følsomhet, indirekte avlesninger, begrenset gjennomstrømning og/eller befolkningsnivåoppløsning. I motsetning oppdager og kvantifiserer analysen vår tilbøyeligheten til et protein for selvmontering in vivo med en følsom, enkeltcelle, høy gjennomstrømningavlesning uavhengig av protein lokalisering eller løselighet.
Når du først prøver analysen, kan det å få bildet konvertering riktig kreve noen empiriske tester for å oppnå optimale forhold for å oppnå en god avlesning over hele platen. Følsomheten til analysen kan også bli kompromittert hvis cytometeret ikke har separate deteksjonsfiltre for FRET- og acceptorsignalene. Å demonstrere prosedyren med meg vil være Andrew Box, laboratoriesjefen for cytometrikjernen.
For å forberede en gjærkultur for DAmFRET, for hvert spørringsprotein, inokulerer de forvandlede gjærkoloniene i triplikate i 200 mikroliter av et passende ikke-induserende vekstmedium i individuelle brønner av en 96 godt rund bunnkulturplate. Inkuber gjærcellene med risting med en 1,5 millimeter bane ved 1200 rotasjoner per minutt ved 30 grader Celsius i 16 timer. På slutten av inkubasjonen sediment gjærcellene ved sentrifugering og fjern supernativa ved kraftig inversjon.
Tilsett 200 mikroliter av et passende induksjonsmedium og returner cellene til risting inkubatoren i ytterligere 12 timer. På slutten av inkubasjonen sediment gjærcellene ved sentrifugering og kraftig inversjon, og tilsett deretter 200 mikroliter med frisk induksjonsmedium. Deretter inkubere cellene med risting i ytterligere fire timer for å redusere automatisk fluorescens.
For å bildekonvertere prøvene, plasser platen uten dekselet under en ultrafiolett lampe utstyrt med et 320 til 500 nanometer filter og en strålekolmator plassert 45 centimeter over platen. Slå på lampen for å konvertere cellene i 25 minutter med risting. For DAmFRET datainnsamling, laster du de konverterte cellene på et bildestrømscytometer med ikke-colinear 488 og 561 nanometer lasere og gate fire enkle ubuddede celler ved høy sirkulæritet og et lite celleområde.
Deretter samler du inn data for to til fem ganger 10 til de fire enkeltcellene per prøve i en fluorescenspositiv port. På slutten av analysen, bruk en ikke-foto konvertert mEos3.1 prøve for ren donor signal og monomeric DsRed to for ren acceptor signal for å sette kompensasjonen. For mer følsomhet, sørg for at FRET detektorkanalen også betraktes som sølmål i analyseprogrammet.
Beregn AmFRET-parameteren som forholdet mellom det totale FRET-signalet delt på det totale FRET-akseptorsignalet. AmFRET-profilene til gjærceller som uttrykker fluorescerende protein alene viser ubetydelig AmFRET, mens gjærceller som uttrykker seg som stabil homooligomer smeltet sammen til det fluorescerende proteinet, viser ensartede positive AmFRET-verdier. Bilder av cellene som er anskaffet av bildestrømcytometri avslører en diffus fluorescens i alle kanalene.
Konfokal mikroskopi av Z-stabler for flere felt av celler viser en jevn fordeling av fluorescensen gjennom cytosolen til hver celle uten påviselig punktpunkt. Gjærceller som uttrykker fluorofor alene eller fluorofor pluss den muterte formen av et humant inflammasomt protein, viser ubetydelig AmFRET over hele konsentrasjonsområdet som indikerer manglende evne til selvinteragering. I motsetning viser det ville inflammasome proteinet en DAmFRET-profil med en ubetydelig AmFRET-populasjon og en høy AmFRET-populasjon.
Legg merke til at den ville typen inflammasomt protein motstår selvmontering selv ved høye konsentrasjoner med proteinet som bytter til den selvmonterte formen i bare en brøkdel av cellene. Dette er en klar indikasjon på eksistensen av en kjernebarriere mot selvmontering. Som bekreftet av fluorescensavbildning representerer disse populasjonene celler som inneholder henholdsvis løselig protein eller for det meste selvmontert protein.
Faktisk bekrefter DAmFRET tidligere strukturelle data at poengmutanten i inflammasome forstyrrer kjerner på tvers av konsentrasjonene som oppnås av dette uttrykkssystemet. Legg merke til at proteinuttrykkprofiler i pattedyrceller som mangler Caspase-1-uttrykk, ligner de som observeres i gjærceller. Det viktigste trinnet å huske er bildekonverteringen.
Andre viktige tiltak inkluderer å samle inn et tilstrekkelig antall hendelser som ikke er mettet for fluorescenssignal og få kompensasjonen riktig. Oppfølging av analysen med passende biokjemi, rasjonell mutagenese og strukturell biologi tilnærminger kan bidra til å fullt ut belyse mekanismen for selvmontering.