Att förstå den fysiska grunden för protein självmontering i celler begränsas av brist på lämpliga verktyg. Nuvarande metoder lider av låg känslighet, indirekta avläsningar, begränsad dataflöde och/eller upplösning på populationsnivå. Däremot upptäcker och kvantifierar vår analys benägenheten hos ett protein för självmontering in vivo med en känslig, enda cell, hög genomströmning avläsning oberoende av protein lokalisering eller löslighet.
När första försöker analysen, att få fotokonvertering rätt kan kräva vissa empiriska tester för att få optimala förutsättningar för att uppnå en bra avläsning över hela plattan. Analysens känslighet kan också äventyras om cytometern inte har separata detektionsfilter för FRET- och acceptorsignalerna. Demonstrerar proceduren med mig blir Andrew Box, laboratoriechefen för cytometrikärnan.
För att förbereda en jästkultur för DAmFRET, för varje frågeprotein, inokulera de transformerade jästkolonierna i tre exemplar i 200 mikroliter av ett lämpligt icke-inducerande tillväxtmedium i enskilda brunnar av en 96 väl rund bottenkulturplatta. Inkubera jästcellerna med skakning med en 1,5 millimeters omloppsbana vid 1, 200 rotationer per minut vid 30 grader Celsius i 16 timmar. Vid slutet av inkuberingen sedimenterar jästcellerna genom centrifugering och avlägsnar supernatanterna genom kraftfull inversion.
Tillsätt 200 mikroliter av ett lämpligt induktionsmedium och återför cellerna till skakinkubatorn i ytterligare 12 timmar. Vid slutet av inkuberingen, sediment jästcellerna genom centrifugering och kraftfull inversion, tillsätt sedan 200 mikroliter av färskt induktionsmedium. Sedan inkubera cellerna med skakningar i ytterligare fyra timmar för att minska auto-fluorescens.
För att foto konvertera proverna, placera plattan utan locket under en ultraviolett lampa försedd med en 320 till 500 nanometer filter och en balk kollimator placerad 45 centimeter ovanför plattan. Slå på lampan för att foto konvertera cellerna i 25 minuter med skakning. För DAmFRET datainsamling, ladda foto konverterade celler på en bildframställning flöde cytometer med icke-colinear 488 och 561 nanometer lasrar och gate fyra enda unbudded celler av hög cirkuläritet och en liten cell område.
Samla sedan in data för två till fem gånger 10 till de fyra enstaka cellerna per prov inom en fluorescenspositiv grind. I slutet av analysen, använd ett icke foto konverterade mEos3.1 prov för ren givaren signal och monomerisk DSRed två för ren acceptor signalen att ställa in ersättningen. För mer känslighet, se till att FRET-detektorkanalen också betraktas som spridningsmålet i analysprogrammet.
Beräkna AmFRET-parametern som förhållandet mellan den totala FRET-signalen dividerat med den totala FRET-acceptorsignalen. AmFRET-profilerna av jästceller som uttrycker fluorescerande protein ensamt uppvisar försumbar AmFRET medan jästceller som uttrycker som stabil homooligomer smält till fluorescerande protein uppvisar enhetliga positiva AmFRET-värden. Bilder av de celler som förvärvats av imaging flöde cytometri avslöjar en diffus fluorescens i alla kanaler.
Confocal mikroskopi av Z stackar för flera fält av celler visar en enhetlig fördelning av fluorescensen i hela cytosol i varje cell utan detekterbara puncta. Jästceller som uttrycker fluoroforeen ensam eller fluorophoreen plus den muterade formen av en humant inflammasome protein uppvisar försumbar AmFRET över hela koncentrationsintervallet som indikerar en oförmåga att själv interagera. Däremot visar den vilda typen inflammasome protein en DAmFRET profil med en försumbar AmFRET population och en hög AmFRET population.
Observera att den vilda typen inflammasome protein motstår självmontering även vid höga koncentrationer med proteinet byta till självmonterad form i endast en bråkdel av cellerna. Detta är en tydlig indikation på förekomsten av en kärnbildning barriär för självmontering. Som bekräftas av fluorescensavbildning, dessa populationer representerar celler som innehåller antingen lösligt protein endast eller mestadels självmonterade protein respektive.
DAmFRET bekräftar faktiskt tidigare strukturella data att den punktmutant i inflammasome stör kärnbildning över de koncentrationer som uppnås genom detta uttryckssystem. Observera att proteinuttrycksprofiler i däggdjursceller som saknar Caspase-1-uttryck liknar de som observerats i jästceller. Det viktigaste steget att komma ihåg är fotokonverteringen.
Andra avgörande steg är att samla in ett tillräckligt antal händelser som inte är mättade för fluorescenssignal och att få ersättningen korrekt. Att följa upp analysen med lämplig biokemi, rationell mutagenes och strukturella biologi metoder kan bidra till att helt klarlägga mekanismen för självmontering.