Name: determining bile duct density in the mouse liver
Uploaded: 2019-04-30T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determining Bile Duct Density in the Mouse Liver at JoVE.com

يقر المؤلفون بالدعم المقدم من المعاهد الوطنية للصحة (R01 GM084135 وR01 DK109982)، وجائزة تجريبية/جدوى من مركز تكساس الطبي لأمراض الجهاز الهضمي تحت معهد الصحة الوطنية P30 DK56338، وجائزة مسرّع متلازمة ألاجيل من المؤسسة الطبية.

تم إيواء جميع الحيوانات في منشأة حيوانية حاجزة في كلية بايلور للطب وفقاً للمبادئ التوجيهية للجنة رعاية الحيوانات واستخدامها المؤسسية وبموجب بروتوكولات الحيوانات المعتمدة.
1. مجموعة من أنسجة الكبد الماوس
<ol><li>
إعداد الماوس لحصاد الكبد
	<ol>
<li>قتل الفأر باستخدام الأ...

<ol>
	<li>Zong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling+controls+liver+development+by+regulating+biliary+differentiation.">Notch signaling controls liver development by regulating biliary differentiation.</a> Development. 136 (10), 1727-1739 (2009).</li><li>Clotman, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+liver+cell+fate+decision+by+a+gradient+of+TGF&#946;+signaling+modulated+by+Onecut+transcription+factors.">Control of liver cell fate decision by a gradient of TGF&#946; signaling modulated by Onecut transcription factors.</a> Genes &amp; Development. 19 (16), 1849-1854 (2005).</li><li>Karpen, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+the+etiologies+and+management+of+neonatal+cholestasis.">Update on the etiologies and management of neonatal cholestasis.</a> Clin Perinatol. 29 (1), 159-180 (2002).</li><li>Roskams, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nomenclature+of+the+finer+branches+of+the+biliary+tree:+canals,+ductules,+and+ductular+reactions+in+human+livers.">Nomenclature of the finer branches of the biliary tree: canals, ductules, and ductular reactions in human livers.</a> Hepatology. 39 (6), 1739-1745 (2004).</li><li>Oda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+human+Jagged1+gene+are+responsible+for+Alagille+syndrome.">Mutations in the human Jagged1 gene are responsible for Alagille syndrome.</a> Nature Genetics. 16 (3), 235 (1997).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alagille+syndrome+is+caused+by+mutations+in+human+Jagged1,+which+encodes+a+ligand+for+Notch1.">Alagille syndrome is caused by mutations in human Jagged1, which encodes a ligand for Notch1.</a> Nature Genetics. 16 (3), 243 (1997).</li><li>Xue, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+lethality+and+vascular+defects+in+mice+lacking+the+Notch+ligand+Jagged1.">Embryonic lethality and vascular defects in mice lacking the Notch ligand Jagged1.</a> Human Molecular Genetics. 8 (5), 723-730 (1999).</li><li>Thakurdas, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jagged1+heterozygosity+in+mice+results+in+a+congenital+cholangiopathy+which+is+reversed+by+concomitant+deletion+of+one+copy+of+Poglut1+(Rumi).">Jagged1 heterozygosity in mice results in a congenital cholangiopathy which is reversed by concomitant deletion of one copy of Poglut1 (Rumi).</a> Hepatology. 63 (2), 550-565 (2016).</li><li>Hadchouel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paucity+of+interlobular+bile+ducts.">Paucity of interlobular bile ducts.</a> Seminars in Diagnostic Pathology. 9 (1), 24-30 (1992).</li><li>Emerick, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+of+Alagille+syndrome+in+92+patients:+frequency+and+relation+to+prognosis.">Features of Alagille syndrome in 92 patients: frequency and relation to prognosis.</a> Hepatology. 29 (3), 822-829 (1999).</li><li>Poncy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factors+SOX4+and+SOX9+cooperatively+control+development+of+bile+ducts.">Transcription factors SOX4 and SOX9 cooperatively control development of bile ducts.</a> Dev Biol. 404 (2), 136-148 (2015).</li><li>Hofmann, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jagged1+in+the+portal+vein+mesenchyme+regulates+intrahepatic+bile+duct+development:+insights+into+Alagille+syndrome.">Jagged1 in the portal vein mesenchyme regulates intrahepatic bile duct development: insights into Alagille syndrome.</a> Development. 137 (23), 4061-4072 (2010).</li><li>McCright, B., Lozier, J., Gridley, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+of+Alagille+syndrome:+Notch2+as+a+genetic+modifier+of+Jag1+haploinsufficiency.">A mouse model of Alagille syndrome: Notch2 as a genetic modifier of Jag1 haploinsufficiency.</a> Development. 129 (4), 1075-1082 (2002).</li><li>Andersson, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Model+of+Alagille+Syndrome+and+Mechanisms+of+Jagged1+Missense+Mutations.">Mouse Model of Alagille Syndrome and Mechanisms of Jagged1 Missense Mutations.</a> Gastroenterology. 154 (4), 1080-1095 (2018).</li><li>Loomes, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bile+duct+proliferation+in+liver-specific+Jag1+conditional+knockout+mice:+effects+of+gene+dosage.">Bile duct proliferation in liver-specific Jag1 conditional knockout mice: effects of gene dosage.</a> Hepatology. 45 (2), 323-330 (2007).</li><li>Brulet, P., Babinet, C., Kemler, R., Jacob, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies+against+trophectoderm-specific+markers+during+mouse+blastocyst+formation.">Monoclonal antibodies against trophectoderm-specific markers during mouse blastocyst formation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (7), 4113-4117 (1980).</li><li>Skalli, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+monoclonal+antibody+against+alpha-smooth+muscle+actin:+a+new+probe+for+smooth+muscle+differentiation.">A monoclonal antibody against alpha-smooth muscle actin: a new probe for smooth muscle differentiation.</a> J Cell Biol. 103 (6 Pt 2), 2787-2796 (1986).</li><li>Kamath, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+longitudinal+study+to+identify+laboratory+predictors+of+liver+disease+outcome+in+Alagille+syndrome.">A longitudinal study to identify laboratory predictors of liver disease outcome in Alagille syndrome.</a> Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 50 (5), 526 (2010).</li><li>Mouzaki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+life+predictive+markers+of+liver+disease+outcome+in+an+International,+Multicentre+Cohort+of+children+with+Alagille+syndrome.">Early life predictive markers of liver disease outcome in an International, Multicentre Cohort of children with Alagille syndrome.</a> Liver International. 36 (5), 755-760 (2016).</li><li>Shiojiri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+differentiation+of+bile+ducts+in+the+mammalian+liver.">Development and differentiation of bile ducts in the mammalian liver.</a> Microsc Res Tech. 39 (4), 328-335 (1997).</li><li>Crawford, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+intrahepatic+biliary+tree.">Development of the intrahepatic biliary tree.</a> Semin Liver Dis. 22 (3), 213-226 (2002).</li><li>Kaneko, K., Kamimoto, K., Miyajima, A., Itoh, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+remodeling+of+the+biliary+architecture+underlies+liver+homeostasis.">Adaptive remodeling of the biliary architecture underlies liver homeostasis.</a> Hepatology. 61 (6), 2056-2066 (2015).</li><li>Schaub, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+formation+of+the+biliary+system+by+TGFbeta-mediated+hepatocyte+transdifferentiation.">De novo formation of the biliary system by TGFbeta-mediated hepatocyte transdifferentiation.</a> Nature. 557 (7704), 247-251 (2018).</li><li>Sparks, E. E., Huppert, K. A., Brown, M. A., Washington, M. K., Huppert, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling+regulates+formation+of+the+three-dimensional+architecture+of+intrahepatic+bile+ducts+in+mice.">Notch signaling regulates formation of the three-dimensional architecture of intrahepatic bile ducts in mice.</a> Hepatology. 51 (4), 1391-1400 (2010).</li><li>Tanimizu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrahepatic+bile+ducts+are+developed+through+formation+of+homogeneous+continuous+luminal+network+and+its+dynamic+rearrangement+in+mice.">Intrahepatic bile ducts are developed through formation of homogeneous continuous luminal network and its dynamic rearrangement in mice.</a> Hepatology. 64 (1), 175-188 (2016).</li><li>Walter, T. J., Sparks, E. E., Huppert, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-dimensional+resin+casting+and+imaging+of+mouse+portal+vein+or+intrahepatic+bile+duct+system.">3-dimensional resin casting and imaging of mouse portal vein or intrahepatic bile duct system.</a> J Vis Exp. (68), e4272 (2012).</li><li>Popper, H., Kent, G., Stein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ductular+cell+reaction+in+the+liver+in+hepatic+injury.">Ductular cell reaction in the liver in hepatic injury.</a> J Mt Sinai Hosp N Y. 24 (5), 551-556 (1957).</li><li>Yimlamai, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippo+pathway+activity+influences+liver+cell+fate.">Hippo pathway activity influences liver cell fate.</a> Cell. 157 (6), 1324-1338 (2014).</li></ol>

تحليل تطوير BD وإصلاح في الفئران هو أداة هامة في دراسة مسببات الأمراض وآلية الاضطرابات الصدغية. وبالإضافة إلى ذلك، فإن تطوير علاجات جديدة يعتمد جزئيا ً على إنشاء نمط ظاهري قابل للاستنساخ ويفضل أن يكون قابلاً للقياس الكمي. النمط الظاهري الحالي في نماذج الماوس عادة ما ينطوي على كيمياء المصل?...

الشجرة الصفراوية هي جزء حاسم من كبد الثدييات، مما يسمح بمرور الصفراء من خلايا الكبد إلى الأمعاء. تتشكل القنوات الصفراوية داخل الكبد (BDs) من قبل الخلايا الأقنية الصفراوية، والتي تميز عن الخلايا الكبدية ثنائية القدرة من خلال الشق وTGFβ إشارة1،2. المواصفات المناسبة والالتزام من الخلايا الصفراوية وتجميعها في BDs ناضجة حاسمة لتطوير شجرة الصفراوية داخل الكبد. كما ينمو الكبد أثناء النمو أو عند تجديد الجهاز، يحتاج النظام الصفراوية لتطوير على طول الكبد لضمان الصرف الصفراويالسليم. وعلاوة على ذلك، فإن عددا من الأمراض المتلازمية وغير المتلازمية تؤدي إلى ندرة الـ BDs intrahepatic3. بالإضافة إلى ذلك، يؤدي عدد من أمراض الكبد الحادة والمزمنة إلى ما يسمى بردود الفعل القنواتية في الكبد، والتي تعرف بأنها وجود عدد كبير من الخلايا التي تعبر عن علامات الصفراوية ولكنها لا تنشأ بالضرورة من الخلايا الصفراوية أو الشكل براءة اختراعBDs 4. في اضطراب متعدد الأنظمة متلازمة ألاجيل (ALGS)، haploinsufficiency من ligand الشق jagged1 (JAG1) يؤدي إلى تشكيل BD الفقراء وركود صفراوي5،6. وقد أثبت مختبرنا مؤخرًا أن خط الماوس Jag1 heterozygousالذي تم إنشاؤه سابقًا هو نموذج حيواني لندرة BD في ALGS8. في هذا النموذج الماوس من ALGS، الخلايا الأقنية لا تزال موجودة. ومع ذلك، فإنها تفشل في الالتزام بالاندماج في ناضجة، وبراءات الاختراع BDs8. ولذلك، فإن تحليل الكبد في نموذج من ندرة BD يتطلب أكثر من وجود واضح أو غياب الخلايا الأقنية. من المهم تقييم درجة وجود الـ BDs الناضجة في الكبد بدقة.
في علم الأمراض التشريحية ، هناك طرق كمية مقبولة لتقييم ما إذا كان هناك ندرة BD9. على سبيل المثال، الدراسات على ALGS في المرضى البشر غالبا ما تحدد درجة BD إلى نسبة الوريد المدخل (PV) عن طريق تحليل ما لا يقل عن 10 أوعية المدخل لكل خزعة الكبد9،10. تحليل شكل والحضور العام أو عدم وجود BDs براءات الاختراع، جنبا إلى جنب مع كيمياء المصل، يمكن أن توفر معلومات قيمة عن تطوير BD في الفئران11،12،13. ومع ذلك، يمكن أن تفقد الفئران عددا كبيرا من BDs مع زيادة متواضعة فقط في مستوى البيليروبين المصل8. وبناء على ذلك، فإن الطريقة الكمية التي تقيّم عدد الـ BDs الموجودة لكل PV يمكن أن توفر مقياساً مباشراً أكثر لدرجة ندرة BD في الفئران. في تقرير صدر مؤخرا، قمنا بتحديد عدد BDs لكل PV عبر جميع فصوص الكبد وأبلغنا عن انخفاض كبير في نسبة BD إلى PV في Jag1 +/– الحيوانات8. خلال تحليلنا، لاحظنا أنه على الرغم من التباين الكبير في درجة الاستجابة الالتهابية وردود الفعل القنواتية، فإن نسبة BD إلى PV لا تظهر الكثير من التباين8. وعلاوة على ذلك، فإن التحديد الكمي لنسبة BD إلى PV سمح لنا بإثبات أن إزالة نسخة واحدة من جين جليكوسيلترانسفيراز Poglut1 في Jag1+/– يمكن للالحيوانات أن تحسن بشكل كبير من ندرة BD8. في خلفية Jag1+/+ ، يؤدي فقدان Poglut1 المشروط في خلايا العضلات الملساء الوعائية إلى زيادة تدريجية في أعداد BD، وهو أمر متواضع (20-30٪) في P7 ولكن يصبح بارزا في البالغين8. مرة أخرى، سمحت لنا هذه التقنية لإظهار أنه حتى في P7، فإن الزيادة في كثافة BD في هذه الحيوانات كبيرة إحصائيا. وتجدر الإشارة إلى أن زيادة كثافة BD في هذا النمط الجيني في أربعة أشهر من العمر تم التحقق من صحتها من خلال تحليل الراتنج المدلى بها أيضا. 8 هذه الملاحظات وغيرها من التقارير التي تقيس كثافة BD في مختلف نماذج الماوس ALGS14،15 دفعتنا إلى دمج هذه الطريقة في استراتيجيتنا الشاملة لتحليل العيوب الصفراوية في مختلف المتحولين والفئران المعدلة وراثيا.
هنا، ونحن بالتفصيل تقنية واضحة التي يمكن استخدامها لدراسة درجة ندرة BD في نماذج الماوس من أمراض الكبد (الشكل1). في هذه الطريقة، يتم استخدام التلطيخ المشترك مع علامات الخلايا الصفراوية سيتوكيراتين (CK) 8 و CK19 (فيما بعد CK واسعة الطيف، wsCK) لتصور BDs والخلايا الأقنية غير المدمجة في كبد الماوس. يتم إضافة جسم مضاد ضد أكتين العضلات ألفا الملساء (αSMA) إلى تلطيخ لعلامات السفن. التحليل المنهجي لنسبة BD إلى PV في قسم يغطي جميع فصوص الكبد يضمن تحليل عدد كبير من PVs لكل النمط الجيني. وبما أن أسلوبنا يعتمد على قياس الـ BDs وPVs في الصور ذات الأبعاد الـ 2، فإنه ليس مناسبًا لدراسة آثار طفرة معينة على البنية ثلاثية الأبعاد للشجرة الصفراوية أو سلامة القنوات الصفراوية الصغيرة. ومع ذلك، فإنه يوفر استراتيجية بسيطة وموضوعية للمحققين لتقييم التطور الصفراوية في الماوس.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Isothesia (Isoflurane)</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>11695-6776-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccator</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td>16-800-552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% PFA</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL tube</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>339653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td>Decon Laboratories</td>
			<td>2401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% Ethanol</td>
			<td>Decon Laboratories</td>
			<td>2801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol</td>
			<td>Decon Laboratories</td>
			<td>2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoChoice</td>
			<td>VWR Life Sciences</td>
			<td>H103-4L</td>
			<td>clearing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnisette Tissue Cassette</td>
			<td>Fisher HealthCare</td>
			<td>15-197-710E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macrosette</td>
			<td>Simport</td>
			<td>M512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraplast X-TRA</td>
			<td>McCormick Scientific</td>
			<td>39503002</td>
			<td>Parrafin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Mold</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>62528-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Microm</td>
			<td>HM 325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C8H10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Based Antigen Retrieval</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-3301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure Cooker</td>
			<td>Instant Pot</td>
			<td>Lux Mini</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Pap Pen</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyoxyethylene 20 Sorbitan Monolaurate (Tween-20)</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>X251-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octyl Phenol Ethoxylate (Triton-X-100)</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>X198-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CK8</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>TROMA-I</td>
			<td>Antibody Registry ID AB531826</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CK19</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>TROMA-III</td>
			<td>Antibody Registry ID AB2133570</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-&#945;SMA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A2547, Clone 1A4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rat-Alexa488</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A21208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse-Cy5</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>715-175-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22x50 micro cover glass</td>
			<td>VWR Life Sciences</td>
			<td>48393 059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMI6000 B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimtech Science</td>
			<td>05511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td>Antifade Mounting Medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determining bile duct density in the mouse liver

يستخدم الماوس على نطاق واسع ككائن حي نموذجي لدراسة الأمراض الصفراوية. لتقييم تطور ووظيفة النظام الصفراوية، يتم استخدام تقنيات مختلفة، بما في ذلك كيمياء المصل، والتحليل النسيجي، وتلطيخ المناعة لعلامات محددة. على الرغم من أن هذه التقنيات يمكن أن توفر معلومات هامة حول النظام الصفراوية، فإنها في كثير من الأحيان لا تقدم صورة كاملة من العيوب التنموية القناة الصفراوية (BD) في جميع أنحاء الكبد كله. ويرجع ذلك جزئيا إلى القدرة القوية لكبد الفأر على استنزاف الصفراء حتى في الحيوانات التي لديها ضعف كبير في التنمية الصفراوية. هنا نقدم طريقة بسيطة لحساب متوسط عدد BDs المرتبطة بكل الوريد المدخل (PV) في أقسام تغطي جميع فصوص الفئران متحولة / المعدلة وراثيا. في هذه الطريقة، يتم تركيب الكبد وتقسيمها بطريقة نمطية لتسهيل المقارنة بين مختلف الأنماط الجينية والظروف التجريبية. يتم تحديد BDs عن طريق الفحص المجهري الخفيف للخلايا الصفراوية الملطخة بالسيتوكيراتين، ثم يتم عدها وتقسيمها على العدد الإجمالي للمركبات الكهربائية الموجودة في قسم الكبد. على سبيل المثال، نبين كيف يمكن لهذه الطريقة أن تميز بوضوح بين الفئران البرية ونموذج الماوس لمتلازمة ألاجيل. الطريقة المعروضة هنا لا يمكن أن تحل محل التقنيات التي تصور بنية ثلاثية الأبعاد للشجرة الصفراوية. ومع ذلك، فإنه يوفر وسيلة سهلة ومباشرة لتقييم كمي تطوير BD ودرجة تشكيل رد الفعل القنواتي في الفئران.

قمنا بتوثيق العيوب الصفراوية في Jag1+/- الحيوانات، نموذج الماوس من ALGS8. لتحديد نسبة BD إلى PV، قمنا بقسم كبد الماوس P30 وشاركفي تلوينها لCK8 و CK19 (wsCK) جنبا إلى جنب مع علامة الأوعية الدموية αSMA. ثم قمنا بتصوير جميع أجهزة الدفع الرباعي في كل فصوص من فصوص الكبد. كما هو ...

Watch this Scientific Journal Video about Determining Bile Duct Density in the Mouse Liver at JoVE.com

Determining Bile Duct Density in the Mouse Liver

نقدم طريقة بسيطة وحساسة إلى حد ما لتحديد كمية دقيقة من كثافة القناة الصفراوية في كبد الماوس. ويمكن أن تساعد هذه الطريقة في تحديد آثار المعدلات الوراثية والبيئية وفعالية العلاجات المحتملة في نماذج الماوس من الأمراض الصفراوية.

تحديد كثافة القناة الصفراوية في كبد الفأر

Mouse is broadly used as a model organism to study biliary diseases. To evaluate the development and function of the biliary system, various techniques ...

هذا البروتوكول يتيح للمحقق لتحديد حجم القناة الصفراوية التنمية في نماذج الماوس من أمراض الكبد. كما أنه يسمح لتقييم آثار المعدلات الوراثية على تطوير القناة الصفراوية. وميزة هذه التقنية هي أنها طريقة واضحة وحساسة وكمية للتقييم المباشر لتطور القناة الصفراوية.للبدء ، مع الجلد المشدود من قبل ملقط ، واستخدام مقص صغير لجعل شق عرضية ما يقرب من شبر واحد تحت القفص الصدري من الماوس القتل الرحيم. كشف كامل سطح البطن من الكبد. استخدم مقص صغير لقطع بعناية من خلال الأربطة التي تربط الكبد بالأعضاء الأخرى في البطن.ثم، قطع من خلال القناة الصفراوية المشتركة لفصل الكبد من الأمعاء. التمسك المرارة وإزالة الكبد بعناية. ضعه على الفور في أنبوب 50 ملليلتر ملأ ثلاثة أرباع مع 4٪ شبهformaldehyde.لإصلاح أنسجة الكبد، احتضانه في 4٪ PFA في أربع درجات مئوية لمدة 48 ساعة. بعد سلسلة من الإيثانول يغسل، وغسل الكبد مع وكيل المقاصة ثلاث مرات لمدة 30 دقيقة لكل درجة حرارة الغرفة. للبدء في التضمين ، قم بغسل كاسيت الأنسجة في قالب من الأنسجة ثلاث مرات لمدة 30 دقيقة في شمع البارافين المُحمّى مسبقًا إلى 60 درجة مئوية.ثم، ملء قالب الأنسجة مع الشمع البارافين إلى ارتفاع ثلاثة أرباع والاحتفاظ بها على كتلة التدفئة في 60 درجة مئوية. وضع الكبد في القالب مع الجانب البطني التي تواجه. بعد إزالة بعناية القالب من كتلة التدفئة، ووضع الجزء العلوي من كاسيت على القالب.أعلى قبالة مع البارافين السائل الساخن والسماح لها لتبرد إلى درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها. بعد إزالة كتلة الكبد من القالب ، استخدم ميكروتوم لبدء التقسيم من خلال الجانب الظهري السطحي للكبد ، مما يجعل خمسة أقسام ميكرومتر. تحقق من الأقسام السطحية تحت مجهر تشريح لضمان عدم القص أو طي المقاطع.لمعالجة الشرائح للكيمياء المناعية، حدد شريحة واحدة لكل نمط جيني لتحليلها وغسلها لمدة 15 دقيقة في إكسيلين، 100٪ الإيثانول، 95٪ الإيثانول وأخيرا، 70٪ الإيثانول. بعد غسل الشريحة في الماء المتأين، غمرها في محلول استرجاع مستضد عالي درجة الانسداد قائم على تريس. ثم، تسخينه تحت الضغط في طنجرة الضغط لمدة ثلاث دقائق في 10 جنيه لكل بوصة مربعة.بعد السماح للشريحة باردة لدرجة حرارة الغرفة، استخدم القلم PAP لتحديد المقاطع على الشريحة. بعد الغسيل مع برنامج تلفزيوني توين، كتلة أقسام الأنسجة عن طريق إضافة 100 ميكرولترات من محلول حجب لكل قسم واحتضان مغطاة في أربع درجات مئوية لمدة ساعة واحدة. تطبيق 100 ميكرولترات من محلول الأجسام المضادة المخففة التي تحتوي على جميع الأجسام المضادة الأساسية الثلاثة إلى كل قسم واحتضانها عند أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها.بعد غسل الشرائح، إضافة 100 ميكرولترات من حل الأجسام المضادة الثانوية التي تحتوي على كل من الأجسام المضادة الثانوية واحتضان لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. وأخيراً، تطبيق متوسطة التركيب و coverlip على الشرائح. استخدم مجهر الفلورسنت لالتقاط صور 20x في 1x تقريبًا لكل قسم.تأكد من أن كل الوريد المدخل عبر الكبد هو صورة. إنشاء جدول بيانات مع الأعمدة التالية: رقم الحيوان/العينة، رقم الصورة، عدد من عروق المدخل وعدد القنوات الصفراوية. تحديد وتسجيل عدد الأوردة المدخلية لكل صورة لكل صورة.ثم، تحديد القنوات الصفراوية براءات الاختراع في كل صورة، من خلال وجود cholangiocytes المحيطة التجويف تعريف. وينبغي أن تكون هذه الهياكل متميزة وفصلها من قبل mesenchyme من الخلايا الأخرى واسعة الطيف السيتوكيراتين إيجابية. أحد التحديات الرئيسية لهذه التقنية هو في تحديد القنوات الصفراوية براءات الاختراع.تحديد ما هو قناة براءات الاختراع يتطلب تحليلا لشكل القناة والخلايا المحيطة تجويف. عد كل قناة براءة اختراع القناة الصفراوية ومكان في نفس العمود كرقم الصورة وكرر لكل صورة الوريد المدخل. وأخيراً، حساب مجموع جميع الأوردة المدخلة وجميع القنوات الصفراوية في عينة الكبد وحساب القناة الصفراوية إلى نسبة الوريد المدخل لعينة الكبد.تم تقسيم كبد الماوس P30 وشارك في تلطيخ لCK8 و CK19 جنبا إلى جنب مع علامة الأوعية الدموية، ألفا-SMA، لتحديد نسبة BD إلى PV. عندما يتم تصوير جميع الأوردة المدخلة في كل فص كبد ، تم تعريف الأوردة المدخلية بأنها الأوعية الملطخة ألفا -SMA التي تحتوي على تلطيخ السيتوكيراتين الواسع النطاق المجاور. وكانت هياكل وصمة ألفا SMA دون السيتوكيراتين واسعة الطيف الأوردة المركزية التي تم استبعادها من التحليل.قنوات براءات الاختراع لديها لومن واضح المعالم التي تحيط بها واسعة الطيف السيتوكيراتين إيجابية cholangioctyes وعادة ما تكون منفصلة عن القنوات القريبة أو cholangiocytes بواسطة mesenchyme. لا تحسب الخلايا الإيجابية السيتوكيراتين واسعة الطيف التي ليس لها لومن محددة، نحو العدد الإجمالي للقناة الصفراوية. قسم الكبد من من النوع البري يظهر الوريد بوابة المرتبطة قناة براءات الاختراع بالكامل جنبا إلى جنب مع العديد من الخلايا غير المدمجة.قسم الكبد التمثيلي من غير هتروزيجوس JAG1 يظهر لا توجد قنوات الصفراوية براءات الاختراع موجودة حول الأوردة المدخلة الثلاثة. جميع الخلايا السيتوكيراتين إيجابية واسعة الطيف هنا غير مدمجة، وبالتالي، لا ينبغي أن تحسب. تحليل نسبة BD إلى PV لثلاثة من نوع البرية وثلاثة الحيوانات غير متغايرة JAG1 يبين كيف يمكن تمييزها بسهولة بين النوعين الجينيين على أساس عدد القنوات الصفراوية.من المهم تقييم جميع الأوعية المدخلة لالقنوات الصفراوية. انها حاسمة خاصة لتحديد كثافة القناة الصفراوية إذا كان هناك تقلب فينوتيبيك عبر الكبد. وقد استخدمت هذه التقنية لتحديد القامع الجيني للنمط الظاهري الصفراوية في نموذج الماوس من هيلغاسون.ولذلك، قد يكون من المفيد في تقييم طرق العلاج من النماذج الحيوانية من مرض الصفراوية.

determining-bile-duct-density-in-the-mouse-liver

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Stimulation of Notch Signaling in Mouse Osteoclast Precursors

Notch signaling is a key component of multiple physiological and pathological processes. The nature of Notch signaling, however, makes in vitro investigation of its varying and sometimes contradictory roles a challenge. As a component of direct cell-cell communication with both receptors and ligands bound to the plasma membrane, Notch signaling cannot be activated in vitro by simple addition of ligands to culture media, as is possible with many other signaling pathways. Instead, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state. 
Variations in methods of Notch signaling activation can lead to different outcomes in cultured cells. In osteoclast precursors, in particular, differences in methods of Notch stimulation and osteoclast precursor culture and differentiation have led to disagreement over whether Notch signaling is a positive or negative regulator of osteoclast differentiation. While closer comparisons of osteoclast differentiation under different Notch stimulation conditions in vitro and genetic models have largely resolved the controversy regarding Notch signaling and osteoclasts, standardized methods of continuous and temporary stimulation of Notch signaling in cultured cells could prevent such discrepancies in the future.
This protocol describes two methods for stimulating Notch signaling specifically in cultured mouse osteoclast precursors, though these methods should be applicable to any adherent cell type with minor adjustments. The first method produces continuous stimulation of Notch signaling and involves immobilizing Notch ligand to a tissue culture surface prior to the seeding of cells. The second, which uses Notch ligand bound to agarose beads allows for temporary stimulation of Notch signaling in cells that are already adhered to a culture surface. This protocol also includes methods for detecting Notch activation in osteoclast precursors as well as representative transcriptional markers of Notch signaling activation.

Notch signaling is a form of cellular communication that relies upon direct contact between cells. To properly induce Notch signaling in vitro, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state. This protocol describes methods for in vitro stimulation of Notch signaling in mouse osteoclast precursors.

تحفيز اشارة الشق في ماوس تآكل العظام Osteoclast السلائف

Notch signaling is a key component of multiple physiological and pathological processes. The nature of Notch signaling, however, makes in vitro ...

Histological Analyses of Acute Alcoholic Liver Injury in Zebrafish

Alcoholic Liver Disease (ALD) refers to damage to the liver due to acute or chronic alcohol abuse. It is among the leading causes of alcohol-related morbidity and mortality and affects more than 2 million people in the United States. A better understanding of the cellular and molecular mechanisms underlying alcohol-induced liver injury is crucial for developing effective treatment for ALD. Zebrafish larvae exhibit hepatic steatosis and fibrogenesis after just 24 h of exposure to 2% ethanol, making them useful for the study of acute alcoholic liver injury. This work describes the procedure for acute ethanol treatment in zebrafish larvae and shows that it causes steatosis and swelling of the hepatic blood vessels. A detailed protocol for Hematoxylin and Eosin (H&#38;E) staining that is optimized for the histological analysis of the zebrafish larval liver, is also described. H&#38;E staining has several unique advantages over immunofluorescence, as it marks all liver cells and extracellular components simultaneously and can readily detect hepatic injury, such as steatosis and fibrosis. Given the increasing usage of zebrafish in modeling toxin and virus-induced liver injury, as well as inherited liver diseases, this protocol serves as a reference for the histological analyses performed in all these studies.

This protocol describes histological analyses of the livers from zebrafish larvae that have been treated with 2% ethanol for 24 h. Such acute ethanol treatment results in hepatic steatosis and swelling of the hepatic vasculature.

التحاليل النسيجية لإصابات الكبد الكحولية الحادة في الزرد

Alcoholic Liver Disease (ALD) refers to damage to the liver due to acute or chronic alcohol abuse. It is among the leading causes of alcohol-related ...

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

14 day-old mouse ovarian tissue and preantral follicles isolated from same-aged mice were incubated in a simulated microgravity culture system. We quantitatively assessed follicle survival, measured follicle and oocyte diameters, and examined ultrastructure of the oocytes produced from the system. We observed decreased follicle survival, downregulation of expressions of proliferating cell nuclear antigen and growth differentiation factor 9, as indicators for the development of granulosa cells and oocytes, respectively, and oocyte ultrastructural abnormalities under the simulated microgravity condition. The simulated microgravity experimental setup needs to be optimized to provide a model for investigation of the mechanisms involved in the oocyte/follicle in vitro development.

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

A highly promising technique to generate tissue constructs without using matrix is to culture cells in a simulated microgravity condition. Using a rotary culture system, we examined ovarian follicle growth and oocyte maturation in terms of follicle survival, morphology, growth, and oocyte function under the simulated microgravity condition.

في المختبر نمو بصيلات بريانترال الماوس تحت ظروف محاكاة الجاذبية الصغرية

14 day-old mouse ovarian tissue and preantral follicles isolated from same-aged mice were incubated in a simulated microgravity culture system. We ...

Quantifying Branching Density in Rat Mammary Gland Whole-mounts Using the Sholl Analysis Method

An increasing number of studies are utilizing the rodent mammary gland as an endpoint for assessing the developmental toxicity of a chemical exposure. The effects these exposures have on mammary gland development are typically evaluated using either basic dimensional measurements or by scoring morphological characteristics. However, the broad range of methods for interpreting developmental changes could lead to inconsistent translations across laboratories. A common method of assessment is needed so that proper interpretations can be formed from data being compared across studies. The present study describes the application of the Sholl analysis method to quantify mammary gland branching characteristics. The Sholl method was originally developed for use in quantifying neuronal dendritic patterns. By using ImageJ, an open-source image analysis software package, and a plugin developed for this analysis, the mammary gland branching density and the complexity of a mammary gland from a peripubertal female rat were determined. The methods described here will enable the use of the Sholl analysis as an effective tool for quantifying an important characteristic of mammary gland development.

Mammary gland development in the rodent has typically been evaluated using descriptive assessments or by measuring basic physical attributes. Branching density is an indicator of mammary development that is difficult to quantify objectively. This protocol describes a reliable method for the quantitative assessment of mammary gland branching characteristics.

كوانتينغينغ المتفرعة الكثافة في الجرذ الغدة الثديية كله يتصاعد باستخدام طريقة تحليل شول

An increasing number of studies are utilizing the rodent mammary gland as an endpoint for assessing the developmental toxicity of a chemical exposure. The ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

تصوير لايف من ماوس الثانوي باليت فيوجن

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

تشريح وتلطيخ إيممونوفلوريسسينت للفطر الجسم وعلم الخلايا العصبية في أدمغة البالغين melanogaster المورفولوجية

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

A Novel Use of Three-dimensional High-frequency Ultrasonography for Early Pregnancy Characterization in the Mouse

High-frequency ultrasonography (HFUS) is a common method to non-invasively monitor the real-time development of the human fetus in utero. The mouse is routinely used as an in vivo model to study embryo implantation and pregnancy progression. Unfortunately, such murine studies require pregnancy interruption to enable follow-up phenotypic analysis. To address this issue, we used three-dimensional (3-D) reconstruction of HFUS imaging data for early detection and characterization of murine embryo implantation sites and their individual developmental progression in utero. Combining HFUS imaging with 3-D reconstruction and modeling, we were able to accurately quantify embryo implantation site number as well as monitor developmental progression in pregnant C57BL6J/129S mice from 5.5 days post coitus (d.p.c.) through to 9.5 d.p.c. with the use of a transducer. Measurements included: number, location, and volume of implantation sites as well as inter-implantation site spacing; embryo viability was assessed by cardiac activity monitoring. In the immediate post-implantation period (5.5 to 8.5 d.p.c.), 3-D reconstruction of the gravid uterus in both mesh and solid overlay format enabled visual representation of the developing pregnancies within each uterine horn. As genetically engineered mice continue to be used to characterize female reproductive phenotypes derived from uterine dysfunction, this method offers a new approach to detect, quantify, and characterize early implantation events in vivo. This novel use of 3-D HFUS imaging demonstrates the ability to successfully detect, visualize, and characterize embryo-implantation sites during early murine pregnancy in a non-invasive manner. The technology offers a significant improvement over current methods, which rely on the interruption of pregnancies for gross tissue and histopathologic characterization. Here we use a video and text format to describe how to successfully perform ultrasounds of early murine pregnancy to generate reliable and reproducible data with reconstruction of the uterine form in mesh and solid 3-D images.

Mice are widely used to study gestational biology. However, pregnancy termination is required for such studies which precludes longitudinal investigations and necessitates the use of large numbers of animals. Therefore, we describe a non-invasive technique of high-frequency ultrasonography for early detection and monitoring of post-implantation events in the pregnant mouse.

استخدام الموجات فوق الصوتية عالية التردد ثلاثي الأبعاد رواية لتوصيف الحمل المبكر في الماوس

High-frequency ultrasonography (HFUS) is a common method to non-invasively monitor the real-time development of the human fetus in utero. The mouse is ...

A Familial Hypercholesterolemia Human Liver Chimeric Mouse Model Using Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocytes

Familial hypercholesterolemia (FH) is mostly caused by low-density lipoprotein receptor (LDLR) mutations and results in an increased risk of early-onset cardiovascular disease due to marked elevation of LDL cholesterol (LDL-C) in blood. Statins are the first line of lipid-lowering drugs for treating FH and other types of hypercholesterolemia, but new approaches are emerging, in particular PCSK9 antibodies, which are now being tested in clinical trials. To explore novel therapeutic approaches for FH, either new drugs or new formulations, we need appropriate in vivo models. However, differences in the lipid metabolic profiles compared to humans are a key problem of the available animal models of FH. To address this issue, we have generated a human liver chimeric mouse model using FH induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived hepatocytes (iHeps). We used Ldlr-/-/Rag2-/-/Il2rg-/- (LRG) mice to avoid immune rejection of transplanted human cells and to assess the effect of LDLR-deficient iHeps in an LDLR null background. Transplanted FH iHeps could repopulate 5-10% of the LRG mouse liver based on human albumin staining. Moreover, the engrafted iHeps responded to lipid-lowering drugs and recapitulated clinical observations of increased efficacy of PCSK9 antibodies compared to statins. Our human liver chimeric model could thus be useful for preclinical testing of new therapies to FH. Using the same protocol, similar human liver chimeric mice for other FH genetic variants, or mutations corresponding to other inherited liver diseases, may also be generated.

Here, we present a protocol to generate a human liver chimeric mouse model of familial hypercholesterolemia using human induced pluripotent stem cell-derived hepatocytes. This is a valuable model for testing new therapies for hypercholesterolemia.

طراز ماوس تشيميريك كبد البشري الكوليستيرول أسرية باستخدام خلايا الكبد المستمدة من الخلايا الجذعية المستحثة Pluripotent

Familial hypercholesterolemia (FH) is mostly caused by low-density lipoprotein receptor (LDLR) mutations and results in an increased risk of early-onset ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is the formation of the transient organizers, the node and notochordal plate, from cells that have passed through the primitive streak. The proper formation of these signaling centers is essential for the development of the body plan and techniques to visualize them are of high interest to mouse developmental biologists. The node and notochordal plate lie on the ventral surface of gastrulating mouse embryos around embryonic day (E) 7.5 of development. The node is a cup-shaped structure whose cells possess a single slender cilium each. The proper subcellular localization and rotation of the cilia in the node pit determines left-right asymmetry. The notochordal plate cells also possess single cilia albeit shorter than those of the node cells. The notochordal plate forms the notochord which acts as an important signaling organizer for somitogenesis and neural patterning. Because the cells of the node and notochordal plate are transiently present on the surface and possess cilia, they can be visualized using scanning electron microscopy (SEM). Among other techniques used to visualize these structures at the cellular level is whole mount immunofluorescence (WMIF) using the antibodies against the proteins that are highly expressed in the node and notochordal plate. In this report, we describe our optimized protocols to perform SEM and WMIF of the node and notochordal plate in developing mouse embryos to help in the assessment of tissue shape and cellular organization in wild-type and gastrulation mutant embryos.

The node and notochordal plate are transient signaling organizers in developing mouse embryos that can be visualized using several techniques. Here, we describe in detail how to perform two of the techniques to study their structure and morphogenesis: 1) scanning electron microscopy (SEM); and 2) whole mount immunofluorescence (WMIF).

تصور بالعقدة ولوحة نوتوتشوردال في جاسترولاتينج الأجنة الماوس باستخدام الميكروسكوب الإلكتروني المسح وكله جبل الفلورة

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts

Cholangiopathies, which affect extrahepatic bile ducts (EHBDs), include biliary atresia, primary sclerosing cholangitis, and cholangiocarcinoma. They have no effective therapeutic options. Tools to study EHBD are very limited. Our purpose was to develop an organ-specific, versatile, adult stem cell-derived, preclinical cholangiocyte model that can be easily generated from wild type and genetically engineered mice. Thus, we report on the novel technique of developing an EHBD organoid (EHBDO) culture system from adult mouse EHBDs. The model is cost-efficient, able to be readily analyzed, and has multiple downstream applications. Specifically, we describe the methodology of mouse EHBD isolation and single cell dissociation, organoid culture initiation, propagation, and long-term maintenance and storage. This manuscript also describes EHBDO processing for immunohistochemistry, fluorescent microscopy, and mRNA abundance quantitation by real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR). This protocol has significant advantages in addition to producing EHBD-specific organoids. The use of a conditioned medium from L-WRN cells significantly reduces the cost of this model. The use of mouse EHBDs provides almost unlimited tissue for culture generation, unlike human tissue. Generated mouse EHBDOs contain a pure population of epithelial cells with markers of endodermal progenitor and differentiated biliary cells. Cultured organoids maintain homogenous morphology through multiple passages and can be recovered after a long-term storage period in liquid nitrogen. The model allows for the study of biliary progenitor cell proliferation, can be manipulated pharmacologically, and may be generated from genetically engineered mice. Future studies are needed to optimize culture conditions in order to increase plating efficiency, evaluate functional cell maturity, and direct cell differentiation. Development of co-culture models and a more biologically neutral extracellular matrix are also desirable.

This protocol describes the production of a mouse extrahepatic bile duct 3-dimensional organoid system. These biliary organoids can be maintained in culture to study cholangiocyte biology. Biliary organoids express markers of both progenitor and biliary cells and are composed of polarized epithelial cells.

جيل أورجانويدس من القنوات الصفراوية اكستراهيباتيك الماوس

Cholangiopathies, which affect extrahepatic bile ducts (EHBDs), include biliary atresia, primary sclerosing cholangitis, and cholangiocarcinoma. They have ...