Name: determining bile duct density in the mouse liver
Uploaded: 2019-04-30T14:45:00
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Les auteurs reconnaissent le soutien des National Institutes of Health (NIH) (R01 GM084135 et R01 DK109982), un Prix pilote/faisabilité du Texas Medical Center Digestive Disease Center sous NIH P30 DK56338, et un Alagille Syndrome Accelerator Award de La Fondation Médicale.

Tous les animaux ont été logés dans un établissement pour animaux de barrière au Baylor College of Medicine selon les lignes directrices du Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux et en vertu de protocoles approuvés pour les animaux.
1. Collection de tissu de foie de souris
<ol><li>
Préparation de la souris pour la récolte du foie
	<ol>
<li>Euthanasier la souris à l'aide d'isoflurane.</li>
		<li>Effectuer la dislocation cervicale de la souris po...

<ol>
	<li>Zong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling+controls+liver+development+by+regulating+biliary+differentiation.">Notch signaling controls liver development by regulating biliary differentiation.</a> Development. 136 (10), 1727-1739 (2009).</li><li>Clotman, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+liver+cell+fate+decision+by+a+gradient+of+TGF&#946;+signaling+modulated+by+Onecut+transcription+factors.">Control of liver cell fate decision by a gradient of TGF&#946; signaling modulated by Onecut transcription factors.</a> Genes &amp; Development. 19 (16), 1849-1854 (2005).</li><li>Karpen, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+the+etiologies+and+management+of+neonatal+cholestasis.">Update on the etiologies and management of neonatal cholestasis.</a> Clin Perinatol. 29 (1), 159-180 (2002).</li><li>Roskams, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nomenclature+of+the+finer+branches+of+the+biliary+tree:+canals,+ductules,+and+ductular+reactions+in+human+livers.">Nomenclature of the finer branches of the biliary tree: canals, ductules, and ductular reactions in human livers.</a> Hepatology. 39 (6), 1739-1745 (2004).</li><li>Oda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+human+Jagged1+gene+are+responsible+for+Alagille+syndrome.">Mutations in the human Jagged1 gene are responsible for Alagille syndrome.</a> Nature Genetics. 16 (3), 235 (1997).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alagille+syndrome+is+caused+by+mutations+in+human+Jagged1,+which+encodes+a+ligand+for+Notch1.">Alagille syndrome is caused by mutations in human Jagged1, which encodes a ligand for Notch1.</a> Nature Genetics. 16 (3), 243 (1997).</li><li>Xue, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+lethality+and+vascular+defects+in+mice+lacking+the+Notch+ligand+Jagged1.">Embryonic lethality and vascular defects in mice lacking the Notch ligand Jagged1.</a> Human Molecular Genetics. 8 (5), 723-730 (1999).</li><li>Thakurdas, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jagged1+heterozygosity+in+mice+results+in+a+congenital+cholangiopathy+which+is+reversed+by+concomitant+deletion+of+one+copy+of+Poglut1+(Rumi).">Jagged1 heterozygosity in mice results in a congenital cholangiopathy which is reversed by concomitant deletion of one copy of Poglut1 (Rumi).</a> Hepatology. 63 (2), 550-565 (2016).</li><li>Hadchouel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paucity+of+interlobular+bile+ducts.">Paucity of interlobular bile ducts.</a> Seminars in Diagnostic Pathology. 9 (1), 24-30 (1992).</li><li>Emerick, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+of+Alagille+syndrome+in+92+patients:+frequency+and+relation+to+prognosis.">Features of Alagille syndrome in 92 patients: frequency and relation to prognosis.</a> Hepatology. 29 (3), 822-829 (1999).</li><li>Poncy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factors+SOX4+and+SOX9+cooperatively+control+development+of+bile+ducts.">Transcription factors SOX4 and SOX9 cooperatively control development of bile ducts.</a> Dev Biol. 404 (2), 136-148 (2015).</li><li>Hofmann, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jagged1+in+the+portal+vein+mesenchyme+regulates+intrahepatic+bile+duct+development:+insights+into+Alagille+syndrome.">Jagged1 in the portal vein mesenchyme regulates intrahepatic bile duct development: insights into Alagille syndrome.</a> Development. 137 (23), 4061-4072 (2010).</li><li>McCright, B., Lozier, J., Gridley, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+of+Alagille+syndrome:+Notch2+as+a+genetic+modifier+of+Jag1+haploinsufficiency.">A mouse model of Alagille syndrome: Notch2 as a genetic modifier of Jag1 haploinsufficiency.</a> Development. 129 (4), 1075-1082 (2002).</li><li>Andersson, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Model+of+Alagille+Syndrome+and+Mechanisms+of+Jagged1+Missense+Mutations.">Mouse Model of Alagille Syndrome and Mechanisms of Jagged1 Missense Mutations.</a> Gastroenterology. 154 (4), 1080-1095 (2018).</li><li>Loomes, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bile+duct+proliferation+in+liver-specific+Jag1+conditional+knockout+mice:+effects+of+gene+dosage.">Bile duct proliferation in liver-specific Jag1 conditional knockout mice: effects of gene dosage.</a> Hepatology. 45 (2), 323-330 (2007).</li><li>Brulet, P., Babinet, C., Kemler, R., Jacob, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies+against+trophectoderm-specific+markers+during+mouse+blastocyst+formation.">Monoclonal antibodies against trophectoderm-specific markers during mouse blastocyst formation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (7), 4113-4117 (1980).</li><li>Skalli, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+monoclonal+antibody+against+alpha-smooth+muscle+actin:+a+new+probe+for+smooth+muscle+differentiation.">A monoclonal antibody against alpha-smooth muscle actin: a new probe for smooth muscle differentiation.</a> J Cell Biol. 103 (6 Pt 2), 2787-2796 (1986).</li><li>Kamath, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+longitudinal+study+to+identify+laboratory+predictors+of+liver+disease+outcome+in+Alagille+syndrome.">A longitudinal study to identify laboratory predictors of liver disease outcome in Alagille syndrome.</a> Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 50 (5), 526 (2010).</li><li>Mouzaki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+life+predictive+markers+of+liver+disease+outcome+in+an+International,+Multicentre+Cohort+of+children+with+Alagille+syndrome.">Early life predictive markers of liver disease outcome in an International, Multicentre Cohort of children with Alagille syndrome.</a> Liver International. 36 (5), 755-760 (2016).</li><li>Shiojiri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+differentiation+of+bile+ducts+in+the+mammalian+liver.">Development and differentiation of bile ducts in the mammalian liver.</a> Microsc Res Tech. 39 (4), 328-335 (1997).</li><li>Crawford, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+intrahepatic+biliary+tree.">Development of the intrahepatic biliary tree.</a> Semin Liver Dis. 22 (3), 213-226 (2002).</li><li>Kaneko, K., Kamimoto, K., Miyajima, A., Itoh, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+remodeling+of+the+biliary+architecture+underlies+liver+homeostasis.">Adaptive remodeling of the biliary architecture underlies liver homeostasis.</a> Hepatology. 61 (6), 2056-2066 (2015).</li><li>Schaub, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+formation+of+the+biliary+system+by+TGFbeta-mediated+hepatocyte+transdifferentiation.">De novo formation of the biliary system by TGFbeta-mediated hepatocyte transdifferentiation.</a> Nature. 557 (7704), 247-251 (2018).</li><li>Sparks, E. E., Huppert, K. A., Brown, M. A., Washington, M. K., Huppert, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling+regulates+formation+of+the+three-dimensional+architecture+of+intrahepatic+bile+ducts+in+mice.">Notch signaling regulates formation of the three-dimensional architecture of intrahepatic bile ducts in mice.</a> Hepatology. 51 (4), 1391-1400 (2010).</li><li>Tanimizu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrahepatic+bile+ducts+are+developed+through+formation+of+homogeneous+continuous+luminal+network+and+its+dynamic+rearrangement+in+mice.">Intrahepatic bile ducts are developed through formation of homogeneous continuous luminal network and its dynamic rearrangement in mice.</a> Hepatology. 64 (1), 175-188 (2016).</li><li>Walter, T. J., Sparks, E. E., Huppert, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-dimensional+resin+casting+and+imaging+of+mouse+portal+vein+or+intrahepatic+bile+duct+system.">3-dimensional resin casting and imaging of mouse portal vein or intrahepatic bile duct system.</a> J Vis Exp. (68), e4272 (2012).</li><li>Popper, H., Kent, G., Stein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ductular+cell+reaction+in+the+liver+in+hepatic+injury.">Ductular cell reaction in the liver in hepatic injury.</a> J Mt Sinai Hosp N Y. 24 (5), 551-556 (1957).</li><li>Yimlamai, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippo+pathway+activity+influences+liver+cell+fate.">Hippo pathway activity influences liver cell fate.</a> Cell. 157 (6), 1324-1338 (2014).</li></ol>

L'analyse du développement et de la réparation de BD chez les souris est un outil important en étudiant la pathogénie et le mécanisme des désordres cholestatic. En outre, le développement de nouvelles thérapies dépend en partie de l'établissement d'un phénotype reproductible et de préférence quantifiable. Le phénotypage actuel dans les modèles de souris implique habituellement la chimie de sérum, l'histologie de foie et l'immunostaining pour des marqueurs spécifiques de cellules-type. Bien que ces techni...

L'arbre biliaire est une partie critique du foie des mammifères, permettant le passage de la bile des hépatocytes dans l'intestin. Les canaux biliaires intrahépatiques (BD) sont formés par des cholangiocytes, qui se différencient des hépatoblastes bipotentiels par Notch et TGFMD signalant1,2. La spécification et l'engagement appropriés des cholangiocytes et de leur assemblage dans les BD mûrs sont essentiels pour le développement de l'arbre biliaire intrahépatique. Comme le foie se développe pendant le développement ou lors de la régénération des organes, le système biliaire doit se développer le long du foie pour assurer un drainage biliaire approprié. En outre, un certain nombre de maladies syndromicmiques et non-syndromamiques ont comme conséquence le manque de BDs intrahépatiques3. En outre, un certain nombre de maladies hépatiques aigues et chroniques donnent lieu à des réactions dites canalulaires dans le foie, qui sont définies comme la présence d'un nombre important de cellules qui expriment des marqueurs biliaires, mais ne proviennent pas nécessairement de cellules biliaires ou de la forme brevet BDs4. Dans le désordre multisystème syndrome d'Alagille (ALGS), haploinsufficiency de la ligand de Notch degged1 (JAG1) a comme conséquence la formation pauvre de BD et la cholestasis5,6. Notre laboratoire a récemment démontré qu'une ligne de souris Heterozygous Jag1 déjà générée7 est un modèle animal de paucité BD dans ALGS8. Dans ce modèle de souris d'ALGS, les cholangiocytes sont toujours présents. Cependant, ils ne s'engagent pas à l'incorporation dans les BD de brevet mûrs8. Par conséquent, l'analyse du foie dans un modèle de manque de BD exige plus que la présence apparente ou l'absence des cholangiocytes. Il est important d'évaluer avec précision la mesure dans laquelle les BD matures sont présents dans le foie.
Dans la pathologie anatomique, il existe des méthodes quantitatives acceptées pour évaluer si le manque de BD existe9. Par exemple, les études sur l'ALGS chez les patients humains quantifient souvent le rapport BD à veine portail (PV) en analysant au moins 10 vaisseaux portailpar biopsie du foie9,10. L'analyse de la forme et de la présence globale ou de l'absence de BD de brevet, combinée avec la chimie de sérum, peut fournir l'information valable au sujet du développement de BD chez les souris11,12,13. Cependant, les souris peuvent perdre un nombre significatif de BD avec seulement une augmentation modeste du niveaudebilirubine de sérum 8. En conséquence, une méthode quantitative qui évalue le nombre de BD présents par PV peut fournir une mesure plus directe du degré de manque de BD chez les souris. Dans un rapport récent, nous avons quantifié le nombre de BD par PV sur tous les lobes dufoie et signalé une diminution significative du rapport BD/PV chez les animaux Jag1MD/8 . Au cours de notre analyse, nous avons remarqué que, malgré la variation significative du degré de réponse inflammatoire et des réactions ductulaires, le rapport BD/PV ne montre pas beaucoup de variabilité8. De plus, la quantification du ratio BD/PV nous a permis de démontrer que la suppression d'une copie du gène de glycosyltransferase Poglut1 chez les animaux Jag1MD/MD peut améliorer considérablement leur paucity BD8. Dans un contexte Jag1/ MD, la perte conditionnelle de Poglut1 dans les cellules musculaires lisses vasculaires entraîne une augmentation progressive du nombre de BD, qui est modeste (20-30%) à P7, mais devient important chez les adultes8. Encore une fois, cette technique nous a permis de montrer que même à P7, l'augmentation de la densité de BD chez ces animaux est statistiquement significative. Il convient de noter que l'augmentation de la densité de BD dans ce génotype à l'âge de quatre mois a été validée par l'analyse de fonte de résine aussi bien. 8 Ces observations et d'autres rapports qui ont mesuré la densité de BD dans différents modèles de souris d'ALGS14,15 nous ont incités à incorporer cette méthode dans notre stratégie globale pour analyser des défauts biliaires dans divers mutants et les souris transgéniques.
Ici, nous détaillons une technique simple qui peut être utilisée pour examiner le degré de manque de BD dans les modèles murins de maladie du foie (Figure 1). Dans cette méthode, la co-coloration avec des marqueurs de cholangiocyte cytokatin (CK) 8 et CK19 (ci-après à large spectre CK, wsCK) est employée pour visualiser BDs et cholangiocytes non incorporés dans le foie de souris. Un anticorps contre l'actine musculaire alpha-lisse est ajouté à la coloration pour étiqueter les vaisseaux. L'analyse systématique du rapport BD/PV dans une section couvrant tous les lobes du foie garantit qu'un grand nombre de PV sont analysés pour chaque génotype. Étant donné que notre méthode repose sur la quantification des BD et des PV en images 2D, elle n'est pas adaptée pour étudier les effets d'une mutation donnée sur la structure 3D de l'arbre biliaire ou l'intégrité des petits conduits biliaires. Néanmoins, il fournit une stratégie simple et objective pour les chercheurs d'évaluer le développement biliaire chez la souris.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Isothesia (Isoflurane)</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>11695-6776-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccator</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td>16-800-552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% PFA</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL tube</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>339653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td>Decon Laboratories</td>
			<td>2401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% Ethanol</td>
			<td>Decon Laboratories</td>
			<td>2801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol</td>
			<td>Decon Laboratories</td>
			<td>2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoChoice</td>
			<td>VWR Life Sciences</td>
			<td>H103-4L</td>
			<td>clearing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnisette Tissue Cassette</td>
			<td>Fisher HealthCare</td>
			<td>15-197-710E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macrosette</td>
			<td>Simport</td>
			<td>M512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraplast X-TRA</td>
			<td>McCormick Scientific</td>
			<td>39503002</td>
			<td>Parrafin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Mold</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>62528-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Microm</td>
			<td>HM 325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C8H10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Based Antigen Retrieval</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-3301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure Cooker</td>
			<td>Instant Pot</td>
			<td>Lux Mini</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Pap Pen</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyoxyethylene 20 Sorbitan Monolaurate (Tween-20)</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>X251-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octyl Phenol Ethoxylate (Triton-X-100)</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>X198-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CK8</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>TROMA-I</td>
			<td>Antibody Registry ID AB531826</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CK19</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>TROMA-III</td>
			<td>Antibody Registry ID AB2133570</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-&#945;SMA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A2547, Clone 1A4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rat-Alexa488</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A21208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse-Cy5</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>715-175-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22x50 micro cover glass</td>
			<td>VWR Life Sciences</td>
			<td>48393 059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMI6000 B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimtech Science</td>
			<td>05511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td>Antifade Mounting Medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determining bile duct density in the mouse liver

La souris est largement utilisée comme organisme modèle pour étudier les maladies biliaires. Pour évaluer le développement et la fonction du système biliaire, diverses techniques sont utilisées, y compris la chimie du sérum, l'analyse histologique et l'immunostaining pour des marqueurs spécifiques. Bien que ces techniques puissent fournir des informations importantes sur le système biliaire, elles ne présentent souvent pas une image complète des défauts développementaux du canal biliaire (BD) sur l'ensemble du foie. Cela est dû en partie à la capacité robuste du foie de souris à drainer la bile, même chez les animaux ayant une déficience significative dans le développement biliaire. Ici, nous présentons une méthode simple pour calculer le nombre moyen de BD associés à chaque veine de portail (PV) dans les sections couvrant tous les lobes des souris mutantes/transgéniques. Dans cette méthode, les foies sont montés et sectionnés d'une manière stéréotypée pour faciliter la comparaison entre divers génotypes et conditions expérimentales. Les BD sont identifiés par microscopie légère des cholangiocytes teintés de cytokératine, puis comptés et divisés par le nombre total de PV présents dans la section de foie. À titre d'exemple, nous montrons comment cette méthode peut clairement distinguer entre les souris de type sauvage et un modèle de souris du syndrome d'Alagille. La méthode présentée ici ne peut se substituer aux techniques qui visualisent la structure tridimensionnelle de l'arbre biliaire. Cependant, il offre un moyen facile et direct d'évaluer quantitativement le développement de la BD et le degré de formation de réaction ductulaire chez la souris.

Nous avons précédemment documenté des défauts biliaires chez les animaux Jag1MD/ , un modèle de souris d'ALGS8. Pour déterminer le rapport BD/PV, nous avons sectionné les foies de souris P30 et les avons tachés pour CK8 et CK19 (wsCK) avec le marqueur vasculaire 'SMA. Nous avons ensuite photographié tous les PV dans chacun des lobes du foie. Comme le montre la figure 2A, nous avons défini les PV comme des navires tac...

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Determining Bile Duct Density in the Mouse Liver

Nous présentons une méthode assez simple et sensible pour la quantification précise de la densité de conduit biliaire dans le foie de souris. Cette méthode peut aider à déterminer les effets des modificateurs génétiques et environnementaux et l'efficacité des thérapies potentielles dans les modèles murins des maladies biliaires.

Détermination de la densité de duct biliaire dans le foie de souris

Mouse is broadly used as a model organism to study biliary diseases. To evaluate the development and function of the biliary system, various techniques ...

Ce protocole permet à l’investigateur de quantifier le développement des canaux biliaires dans les modèles muraux de maladie hépatique. Il permet également d’évaluer les effets des modificateurs génétiques sur le développement des canaux biliaires. L’avantage de cette technique est qu’il s’agit d’une méthode simple, sensible et quantitative pour l’évaluation directe du développement des canaux biliaires.Pour commencer, avec la peau tendue par des forceps, utilisez de petits ciseaux pour faire une incision transversale d’environ un pouce sous la cage thoracique d’une souris euthanasié. Exposer toute la surface ventrale du foie. Utilisez de petits ciseaux pour couper soigneusement les ligaments reliant le foie aux autres organes de l’abdomen.Ensuite, couper à travers le canal biliaire commun pour détacher le foie de l’intestin. Accrochez-vous à la vésicule biliaire et retirez soigneusement le foie. Placez-le immédiatement dans un tube de 50 millilitres rempli des trois quarts avec 4% de paraformaldéhyde.Pour fixer le tissu hépatique, l’incuber en 4%PFA à quatre degrés Celsius pendant 48 heures. Après une série de lavages à l’éthanol, laver le foie avec un agent de compensation trois fois pendant 30 minutes chacun à température ambiante. Pour commencer à intégrer, laver une cassette de tissu dans un moule de tissu trois fois pendant 30 minutes dans de la cire de paraffine préchauffée à 60 degrés Celsius.Ensuite, remplissez le moule de tissu avec de la cire de paraffine à la hauteur des trois quarts et gardez-le sur un bloc chauffant à 60 degrés Celsius. Placez le foie dans le moule avec le côté ventral face vers le haut. Après avoir soigneusement enlevé le moule du bloc chauffant, placez le dessus de la cassette sur le moule.Garnir de paraffine liquide chaude et laisser refroidir à température ambiante pendant la nuit. Après avoir enlevé le bloc hépatique du moule, utilisez une microtome pour commencer à sectionner à travers le côté dorsal superficiel du foie, faisant cinq sections de micromètre. Vérifiez les sections superficielles sous un microscope de dissection pour vous assurer que les sections ne sont pas cisaillées ou pliées.Pour traiter les diapositives pour l’immunohistochimie, sélectionnez une diapositive par génotype à analyser et lavez-la pendant 15 minutes en xylène, 100 % d’éthanol, 95 % d’éthanol et enfin 70 % d’éthanol. Après avoir lavé la lame dans l’eau ionisée, immerger dans la solution de récupération d’antigènes à pH élevé à base de Tris. Ensuite, chauffez-le sous pression dans un autocuiseur pendant trois minutes à 10 livres par pouce carré.Après avoir laissé refroidir la glissade à température ambiante, utilisez un stylo PAP pour décrire les sections de la glissière. Après le lavage avec PBS Tween, bloquer les sections tissulaires en ajoutant 100 microlitres de solution de blocage par section et d’incubation couverte à quatre degrés Celsius pendant une heure. Appliquer 100 microlitres de la solution d’anticorps dilué contenant les trois anticorps primaires à chaque section et les incuber à quatre degrés Celsius pendant la nuit.Après avoir lavé les toboggans, ajouter 100 microlitres de la solution d’anticorps secondaire contenant à la fois des anticorps secondaires et incuber pendant une heure à température ambiante. Enfin, appliquez un support de montage et un coverslip sur les diapositives. Utilisez un microscope fluorescent pour prendre des images 20x à 1x zoom de chaque section.Assurez-vous que chaque veine portail à travers le foie est image. Créez une feuille de calcul avec les colonnes suivantes : numéro animal/échantillon, numéro d’image, nombre de veines portail et nombre de canaux biliaires. Identifiez et enregistrez le nombre de veines portail par image pour chaque image.Ensuite, identifiez les canaux biliaires brevetés dans chaque image, par la présence de cholangiocytes entourant un lumen définissable. Ces structures doivent être distinctes et séparées par le mésenchyme d’autres cellules cytokératine-positives à large spectre. L’un des principaux défis de cette technique est d’identifier les canaux biliaires brevetés.Pour déterminer ce qu’est un conduit breveté, il faut analyser la forme du conduit et les cellules entourant le lumen. Comptez chaque canal biliaire breveté et placez-le dans la même colonne que le numéro d’image et répétez pour chaque image de veine de portail. Enfin, calculez la somme de toutes les veines portails et de tous les canaux biliaires de l’échantillon de foie et calculez le rapport canal/veine portail pour l’échantillon de foie.Les foies de souris P30 ont été sectionnés et co-tachés pour CK8 et CK19 avec le marqueur vasculaire, alpha-SMA, pour déterminer le rapport BD/PV. Lorsque toutes les veines portails de chaque lobe hépatique sont photographiées, les veines portails ont été définies comme des vaisseaux tachés alpha-SMA qui ont des taches de cytokératine à large spectre adjacentes. Les structures de tache d’alpha-SMA sans cytokeratin à large spectre étaient des veines centrales qui ont été exclues de l’analyse.Les conduits brevetés ont un lumen clairement définissable qui est entouré de cholangioctyes cytokératine-positifs à large spectre et sont généralement séparés des conduits ou cholangiocytes voisins par le mésenchyme. Les cellules cytokératine-positives à large spectre qui n’ont pas de lumen définissable ne sont pas comptées pour le nombre total de canaux biliaires. La section hépatique d’un animal de type sauvage montre une veine portail associée à un conduit entièrement breveté ainsi que plusieurs cellules non incorporées.La section hépatique représentative d’un animal hétérozygote JAG1 ne montre aucun canal biliaire breveté autour des trois veines portails. Toutes les cellules cytokeratine-positives à large spectre ici ne sont pas incorporées et, par conséquent, ne devraient pas être comptées. L’analyse du rapport BD/PV pour trois animaux hétérozygotes de type sauvage et trois animaux hétérozygotes JAG1 montre comment les deux génotypes peuvent être facilement distingués en fonction du nombre de canaux biliaires.Il est important d’évaluer tous les vaisseaux portails pour les canaux biliaires. Il est particulièrement critique pour déterminer la densité des canaux biliaires s’il y a variabilité phénotypique dans tout le foie. Cette technique a été utilisée pour identifier un suppresseur génétique du phénotype biliaire dans un modèle de souris d’Helgason.Par conséquent, il peut être utile dans l’évaluation des modalités de traitement des modèles animaux de la maladie biliaire.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

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Biologie du développement

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