Name: determining bile duct density in the mouse liver
Uploaded: 2019-04-30T14:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determining Bile Duct Density in the Mouse Liver at JoVE.com

Die Autoren würdigen die Unterstützung der National Institutes of Health (NIH) (R01 GM084135 und R01 DK109982), einen Pilot/Feasibility Award des Texas Medical Center Digestive Disease Center unter NIH P30 DK56338 und einen Alagille Syndrome Accelerator Award von Die Medical Foundation.

Alle Tiere wurden in einer Barrieretieranlage am Baylor College of Medicine gemäß den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee und gemäß den genehmigten Tierprotokollen untergebracht.
1. Sammlung von Maus Lebergewebe
<ol><li>
Vorbereitung der Maus für die Leberernte
	<ol>
<li>Euthanisieren Sie die Maus mit Isofluran.</li>
		<li>Führen Sie zervikale Dislokation der Maus, um den Tod zu gewährleisten.</li>
		<li>Machen Sie einen Querschnitt etwa einen ...

<ol>
	<li>Zong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling+controls+liver+development+by+regulating+biliary+differentiation.">Notch signaling controls liver development by regulating biliary differentiation.</a> Development. 136 (10), 1727-1739 (2009).</li><li>Clotman, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+liver+cell+fate+decision+by+a+gradient+of+TGF&#946;+signaling+modulated+by+Onecut+transcription+factors.">Control of liver cell fate decision by a gradient of TGF&#946; signaling modulated by Onecut transcription factors.</a> Genes &amp; Development. 19 (16), 1849-1854 (2005).</li><li>Karpen, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Update+on+the+etiologies+and+management+of+neonatal+cholestasis.">Update on the etiologies and management of neonatal cholestasis.</a> Clin Perinatol. 29 (1), 159-180 (2002).</li><li>Roskams, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nomenclature+of+the+finer+branches+of+the+biliary+tree:+canals,+ductules,+and+ductular+reactions+in+human+livers.">Nomenclature of the finer branches of the biliary tree: canals, ductules, and ductular reactions in human livers.</a> Hepatology. 39 (6), 1739-1745 (2004).</li><li>Oda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+human+Jagged1+gene+are+responsible+for+Alagille+syndrome.">Mutations in the human Jagged1 gene are responsible for Alagille syndrome.</a> Nature Genetics. 16 (3), 235 (1997).</li><li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alagille+syndrome+is+caused+by+mutations+in+human+Jagged1,+which+encodes+a+ligand+for+Notch1.">Alagille syndrome is caused by mutations in human Jagged1, which encodes a ligand for Notch1.</a> Nature Genetics. 16 (3), 243 (1997).</li><li>Xue, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+lethality+and+vascular+defects+in+mice+lacking+the+Notch+ligand+Jagged1.">Embryonic lethality and vascular defects in mice lacking the Notch ligand Jagged1.</a> Human Molecular Genetics. 8 (5), 723-730 (1999).</li><li>Thakurdas, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jagged1+heterozygosity+in+mice+results+in+a+congenital+cholangiopathy+which+is+reversed+by+concomitant+deletion+of+one+copy+of+Poglut1+(Rumi).">Jagged1 heterozygosity in mice results in a congenital cholangiopathy which is reversed by concomitant deletion of one copy of Poglut1 (Rumi).</a> Hepatology. 63 (2), 550-565 (2016).</li><li>Hadchouel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paucity+of+interlobular+bile+ducts.">Paucity of interlobular bile ducts.</a> Seminars in Diagnostic Pathology. 9 (1), 24-30 (1992).</li><li>Emerick, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+of+Alagille+syndrome+in+92+patients:+frequency+and+relation+to+prognosis.">Features of Alagille syndrome in 92 patients: frequency and relation to prognosis.</a> Hepatology. 29 (3), 822-829 (1999).</li><li>Poncy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factors+SOX4+and+SOX9+cooperatively+control+development+of+bile+ducts.">Transcription factors SOX4 and SOX9 cooperatively control development of bile ducts.</a> Dev Biol. 404 (2), 136-148 (2015).</li><li>Hofmann, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jagged1+in+the+portal+vein+mesenchyme+regulates+intrahepatic+bile+duct+development:+insights+into+Alagille+syndrome.">Jagged1 in the portal vein mesenchyme regulates intrahepatic bile duct development: insights into Alagille syndrome.</a> Development. 137 (23), 4061-4072 (2010).</li><li>McCright, B., Lozier, J., Gridley, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+of+Alagille+syndrome:+Notch2+as+a+genetic+modifier+of+Jag1+haploinsufficiency.">A mouse model of Alagille syndrome: Notch2 as a genetic modifier of Jag1 haploinsufficiency.</a> Development. 129 (4), 1075-1082 (2002).</li><li>Andersson, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Model+of+Alagille+Syndrome+and+Mechanisms+of+Jagged1+Missense+Mutations.">Mouse Model of Alagille Syndrome and Mechanisms of Jagged1 Missense Mutations.</a> Gastroenterology. 154 (4), 1080-1095 (2018).</li><li>Loomes, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bile+duct+proliferation+in+liver-specific+Jag1+conditional+knockout+mice:+effects+of+gene+dosage.">Bile duct proliferation in liver-specific Jag1 conditional knockout mice: effects of gene dosage.</a> Hepatology. 45 (2), 323-330 (2007).</li><li>Brulet, P., Babinet, C., Kemler, R., Jacob, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+antibodies+against+trophectoderm-specific+markers+during+mouse+blastocyst+formation.">Monoclonal antibodies against trophectoderm-specific markers during mouse blastocyst formation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (7), 4113-4117 (1980).</li><li>Skalli, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+monoclonal+antibody+against+alpha-smooth+muscle+actin:+a+new+probe+for+smooth+muscle+differentiation.">A monoclonal antibody against alpha-smooth muscle actin: a new probe for smooth muscle differentiation.</a> J Cell Biol. 103 (6 Pt 2), 2787-2796 (1986).</li><li>Kamath, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+longitudinal+study+to+identify+laboratory+predictors+of+liver+disease+outcome+in+Alagille+syndrome.">A longitudinal study to identify laboratory predictors of liver disease outcome in Alagille syndrome.</a> Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 50 (5), 526 (2010).</li><li>Mouzaki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+life+predictive+markers+of+liver+disease+outcome+in+an+International,+Multicentre+Cohort+of+children+with+Alagille+syndrome.">Early life predictive markers of liver disease outcome in an International, Multicentre Cohort of children with Alagille syndrome.</a> Liver International. 36 (5), 755-760 (2016).</li><li>Shiojiri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+differentiation+of+bile+ducts+in+the+mammalian+liver.">Development and differentiation of bile ducts in the mammalian liver.</a> Microsc Res Tech. 39 (4), 328-335 (1997).</li><li>Crawford, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+intrahepatic+biliary+tree.">Development of the intrahepatic biliary tree.</a> Semin Liver Dis. 22 (3), 213-226 (2002).</li><li>Kaneko, K., Kamimoto, K., Miyajima, A., Itoh, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+remodeling+of+the+biliary+architecture+underlies+liver+homeostasis.">Adaptive remodeling of the biliary architecture underlies liver homeostasis.</a> Hepatology. 61 (6), 2056-2066 (2015).</li><li>Schaub, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+formation+of+the+biliary+system+by+TGFbeta-mediated+hepatocyte+transdifferentiation.">De novo formation of the biliary system by TGFbeta-mediated hepatocyte transdifferentiation.</a> Nature. 557 (7704), 247-251 (2018).</li><li>Sparks, E. E., Huppert, K. A., Brown, M. A., Washington, M. K., Huppert, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling+regulates+formation+of+the+three-dimensional+architecture+of+intrahepatic+bile+ducts+in+mice.">Notch signaling regulates formation of the three-dimensional architecture of intrahepatic bile ducts in mice.</a> Hepatology. 51 (4), 1391-1400 (2010).</li><li>Tanimizu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrahepatic+bile+ducts+are+developed+through+formation+of+homogeneous+continuous+luminal+network+and+its+dynamic+rearrangement+in+mice.">Intrahepatic bile ducts are developed through formation of homogeneous continuous luminal network and its dynamic rearrangement in mice.</a> Hepatology. 64 (1), 175-188 (2016).</li><li>Walter, T. J., Sparks, E. E., Huppert, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-dimensional+resin+casting+and+imaging+of+mouse+portal+vein+or+intrahepatic+bile+duct+system.">3-dimensional resin casting and imaging of mouse portal vein or intrahepatic bile duct system.</a> J Vis Exp. (68), e4272 (2012).</li><li>Popper, H., Kent, G., Stein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ductular+cell+reaction+in+the+liver+in+hepatic+injury.">Ductular cell reaction in the liver in hepatic injury.</a> J Mt Sinai Hosp N Y. 24 (5), 551-556 (1957).</li><li>Yimlamai, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippo+pathway+activity+influences+liver+cell+fate.">Hippo pathway activity influences liver cell fate.</a> Cell. 157 (6), 1324-1338 (2014).</li></ol>

Die Analyse der BD-Entwicklung und -Reparatur bei Mäusen ist ein wichtiges Instrument zur Untersuchung der Pathogenese und des Mechanismus cholestatischer Erkrankungen. Darüber hinaus hängt die Entwicklung neuer Therapien zum Teil von der Etablierung eines reproduzierbaren und vorzugsweise quantifizierbaren Phänotyps ab. Aktuelle Phänotypisierung in Mausmodellen beinhaltet in der Regel Serumchemie, Leberhistologie und Immunostainierung für zelltypspezifische Marker. Obwohl diese Techniken wertvolle Informationen ü...

Der Gallenbaum ist ein kritischer Teil der Säugetierleber, so dass der Durchgang der Galle von Hepatozyten in den Darm ermöglicht. Intrahepatische Gallengänge (BDs) werden durch Cholangiozyten gebildet, die sich von bipotenten Hepatoblasten durch Notch und TGF-Signalisierung1,2unterscheiden. Die richtige Spezifikation und Das Richtige Engagement von Cholangiocyten und deren Montage in ausgereifte BDs sind entscheidend für die Entwicklung des intrahepatischen Gallenbaums. Da die Leber während der Entwicklung oder bei der Organregeneration wächst, muss sich das Gallensystem entlang der Leber entwickeln, um eine ordnungsgemäße Gallendrainage zu gewährleisten. Darüber hinaus führen eine Reihe von syndromischen und nicht-syndromischen Erkrankungen zu einem Mangel an intrahepatischen BDs3. Darüber hinaus führen eine Reihe akuter und chronischer Lebererkrankungen zu sogenannten kanalulären Reaktionen in der Leber, die definiert sind als das Vorhandensein einer signifikanten Anzahl von Zellen, die Gallenmarker exprimieren, aber nicht notwendigerweise aus Gallenzellen oder Patent BDs4. Bei der Multisystem-Störung Alagille-Syndrom (ALGS), Haploinsuffizienz der Kerb Liganden gezackt1 (JAG1) führt zu schlechter BD-Bildung und Cholestase5,6. Unser Labor hat kürzlich gezeigt, dass eine zuvor generierte Jag1 heterozygote Mauslinie7 ein Tiermodell von BD-Mangel in ALGS8ist. In diesem Mausmodell von ALGS sind Cholangiozyten noch vorhanden. Sie verpflichten sich jedoch nicht zur Aufnahme in ausgereifte, patente BDs8. Daher erfordert die Analyse der Leber in einem Modell der BD-Knappheit mehr als das scheinbare Vorhandensein oder Fehlen von Cholangiocyten. Es ist wichtig, genau zu beurteilen, inwieweit reife BDs in der Leber vorhanden sind.
In der anatomischen Pathologie gibt es anerkannte quantitative Methoden zur Beurteilung, ob BD-Mangel existiert9. Zum Beispiel, Studien an ALGS bei menschlichen Patienten oft quantifizieren die BD zu Portal Vene (PV) Verhältnis durch die Analyse von mindestens 10 Portalgefäße pro Leberbiopsie9,10. Die Analyse der Form und des Gesamtvorhandenseins oder Fehlens von Patent-BDs, kombiniert mit Serumchemie, kann wertvolle Informationen über die BD-Entwicklung bei Mäusen11,12,13liefern. Jedoch, Mäuse können eine erhebliche Anzahl von BDs mit nur einem bescheidenen Anstieg des Serum Bilirubin-Spiegel8verlieren. Dementsprechend kann eine quantitative Methode, die die Anzahl der pro PV vorhandenen BDs bewertet, ein direkteres Maß für den Grad des BD-Mangels bei Mäusen liefern. In einem kürzlich veröffentlichten Bericht quantifizierten wir die Anzahl der BDs pro PV über alle Leberlappen hinweg und berichteten von einem signifikanten Rückgang des BD-PV-Verhältnisses bei Jag1+/– Tieren8. Im Laufe unserer Analyse stellten wir fest, dass trotz der signifikanten Variation des Grades der Entzündungsreaktion und der Kanalreaktionen das BD-PV-Verhältnis nicht viel Variabilitätaufweist 8. Darüber hinaus konnte die Quantifizierung des BD-PV-Verhältnisses nachweisen, dass das Entfernen einer Kopie des Glykosyltransferase-Gens Poglut1 in Jag1+/– Tiere ihren BD-Mangel deutlich verbessern kann8. In einem Jag1+/+ Hintergrund führt der bedingte Verlust von Poglut1 in vaskulären glatten Muskelzellen zu einem progressiven Anstieg der BD-Zahlen, der bescheiden ist (20-30%) bei P7, wird aber bei Erwachsenendeutlich 8. Auch diese Technik erlaubte es uns zu zeigen, dass selbst bei P7 die Zunahme der BD-Dichte bei diesen Tieren statistisch signifikant ist. Bemerkenswert ist, dass die erhöhte BD-Dichte in diesem Genotyp im Alter von vier Monaten auch durch Harzgussanalyse validiert wurde. 8 Diese Beobachtungen und andere Berichte, die die BD-Dichte in verschiedenen ALGS-Mausmodellen14,15 maßen, veranlassten uns, diese Methode in unsere Gesamtstrategie zur Analyse von Gallendefekten in verschiedenen Mutanten zu integrieren. und transgene Mäuse.
Hier beschreiben wir eine einfache Technik, die verwendet werden kann, um den Grad des BD-Mangels in Mausmodellen von Lebererkrankungen zu untersuchen (Abbildung 1). Bei dieser Methode wird die Co-Färbung mit den Cholangiozytenmarkern Cytokeratin (CK) 8 und CK19 (im Folgenden Wide-Spektrum CK, wsCK) verwendet, um BDs und ungekauzte Cholangiozyten in der Mausleber zu visualisieren. Ein Antikörper gegen alpha-glattes Muskelaktin wird der Färbung zur Kennzeichnung von Gefäßen hinzugefügt. Die systematische Analyse des BD-PV-Verhältnisses in einem Abschnitt, der alle Leberlappen abdeckt, stellt sicher, dass für jeden Genotyp eine große Anzahl von Pv-VVs analysiert wird. Da unsere Methode auf der Quantifizierung von BDs und PVs in 2D-Bildern beruht, ist sie nicht geeignet, die Auswirkungen einer gegebenen Mutation auf die 3D-Struktur des Gallenbaums oder die Integrität der kleinen Gallenschläuche zu untersuchen. Dennoch bietet es eine einfache und objektive Strategie für die Ermittler, die Gallenentwicklung in der Maus zu bewerten.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Isothesia (Isoflurane)</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>11695-6776-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desiccator</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td>16-800-552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% PFA</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50mL tube</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>339653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td>Decon Laboratories</td>
			<td>2401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% Ethanol</td>
			<td>Decon Laboratories</td>
			<td>2801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol</td>
			<td>Decon Laboratories</td>
			<td>2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoChoice</td>
			<td>VWR Life Sciences</td>
			<td>H103-4L</td>
			<td>clearing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omnisette Tissue Cassette</td>
			<td>Fisher HealthCare</td>
			<td>15-197-710E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macrosette</td>
			<td>Simport</td>
			<td>M512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraplast X-TRA</td>
			<td>McCormick Scientific</td>
			<td>39503002</td>
			<td>Parrafin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Mold</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>62528-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Microm</td>
			<td>HM 325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>C8H10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-Based Antigen Retrieval</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-3301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure Cooker</td>
			<td>Instant Pot</td>
			<td>Lux Mini</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mini Pap Pen</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyoxyethylene 20 Sorbitan Monolaurate (Tween-20)</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>X251-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octyl Phenol Ethoxylate (Triton-X-100)</td>
			<td>J.T. Baker</td>
			<td>X198-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CK8</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>TROMA-I</td>
			<td>Antibody Registry ID AB531826</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CK19</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>TROMA-III</td>
			<td>Antibody Registry ID AB2133570</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-&#945;SMA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A2547, Clone 1A4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-rat-Alexa488</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A21208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-mouse-Cy5</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>715-175-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22x50 micro cover glass</td>
			<td>VWR Life Sciences</td>
			<td>48393 059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMI6000 B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimtech Science</td>
			<td>05511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000</td>
			<td>Antifade Mounting Medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determining bile duct density in the mouse liver

Maus wird allgemein als Modellorganismus verwendet, um Gallenkrankheiten zu untersuchen. Um die Entwicklung und Funktion des Gallensystems zu bewerten, werden verschiedene Techniken verwendet, einschließlich Serumchemie, histologische Analyse und Immunostainierung für bestimmte Marker. Obwohl diese Techniken wichtige Informationen über das Gallensystem liefern können, stellen sie oft kein vollständiges Bild der Gallengang (BD) Entwicklungsfehler in der gesamten Leber dar. Dies ist zum Teil auf die robuste Fähigkeit der Mausleber zurückzuführen, die Galle auch bei Tieren mit erheblichen Beeinträchtigungen in der Gallenentwicklung zu entwässern. Hier stellen wir eine einfache Methode zur Berechnung der durchschnittlichen Anzahl von BDs vor, die jeder Portalvene (PV) zugeordnet sind, in Abschnitten, die alle Lappen mutierter/transgener Mäuse abdecken. Bei dieser Methode werden Lebern in einer stereotypen Weise montiert und geschnitten, um den Vergleich zwischen verschiedenen Genotypen und experimentellen Bedingungen zu erleichtern. BDs werden mittels Lichtmikroskopie von Cytokeratin-gefärbten Cholangiocyten identifiziert und dann gezählt und durch die Gesamtzahl der im Leberbereich vorhandenen PVs dividiert. Als Beispiel zeigen wir, wie diese Methode klar zwischen Wildtypmäusen und einem Mausmodell des Alagille-Syndroms unterscheiden kann. Die hier vorgestellte Methode kann keine Techniken ersetzen, die die dreidimensionale Struktur des Gallenbaums visualisieren. Es bietet jedoch eine einfache und direkte Möglichkeit, die BD-Entwicklung und den Grad der kanalulären Reaktionsbildung bei Mäusen quantitativ zu bewerten.

Wir haben bereits Gallendefekte bei Jag1+/– Tieren dokumentiert, einem Mausmodell von ALGS8. Um das BD-PV-Verhältnis zu bestimmen, haben wir P30-Mausleber geschnitten und für CK8 und CK19 (wsCK) zusammen mit dem Gefäßmarker SMA mitgefärbt. Wir haben dann alle PVs in jedem der Leberlappen abgebildet. Wie in Abbildung 2Adargestellt, haben wir PVs als "SMA-befleckte Gefäße" definiert, die benachbarte wsCK-Färbung (Pfeil...

Watch this Scientific Journal Video about Determining Bile Duct Density in the Mouse Liver at JoVE.com

Determining Bile Duct Density in the Mouse Liver

Wir präsentieren eine recht einfache und empfindliche Methode zur genauen Quantifizierung der Gallengangsdichte in der Mausleber. Diese Methode kann bei der Bestimmung der Auswirkungen von genetischen und ökologischen Modifikatoren und der Wirksamkeit potenzieller Therapien in Mausmodellen von Gallenerkrankungen helfen.

Bestimmung der Gallengangsdichte in der Mausleber

Mouse is broadly used as a model organism to study biliary diseases. To evaluate the development and function of the biliary system, various techniques ...

Dieses Protokoll ermöglicht es dem Prüfer, die Entwicklung des Gallengangs in Mausmodellen von Lebererkrankungen zu quantifizieren. Es ermöglicht auch die Bewertung der Auswirkungen von genetischen Modifikatoren auf die Gallengangentwicklung. Der Vorteil dieser Technik ist, dass es sich um eine einfache, empfindliche und quantitative Methode zur direkten Bewertung der Gallengangsentwicklung handelt.Zunächst, mit der Haut durch Zangen straff gehalten, verwenden Sie kleine Schere, um einen Querschnitt etwa einen Zoll unter dem Rippenkäfig einer eingeschläferten Maus zu machen. Setzen Sie die gesamte ventrale Oberfläche der Leber aus. Verwenden Sie eine kleine Schere, um die Bänder, die die Leber mit den anderen Organen im Bauch verbinden, sorgfältig zu durchschneiden.Dann durchschneiden Sie den gemeinsamen Gallengang, um die Leber vom Darm zu lösen. Halten Sie an der Gallenblase fest und entfernen Sie vorsichtig die Leber. Sofort in ein 50-Milliliter-Rohr geben, das drei Viertel mit 4% Paraformaldehyd gefüllt ist.Um das Lebergewebe zu fixieren, inkubieren Sie es in 4%PFA bei vier Grad Celsius für 48 Stunden. Nach einer Reihe von Ethanolwäschen die Leber dreimal für jeweils 30 Minuten bei Raumtemperatur mit Räummittel waschen. Um mit dem Einbetten zu beginnen, waschen Sie eine Gewebekassette dreimal in einer Gewebeform für 30 Minuten in Paraffinwachs, das auf 60 Grad Celsius vorgewärmt wird.Dann füllen Sie die Gewebeform mit Paraffinwachs auf drei Viertel Höhe und halten Sie es auf einem Heizblock bei 60 Grad Celsius. Legen Sie die Leber in die Form mit der ventralen Seite nach oben. Nachdem Sie die Form sorgfältig aus dem Heizblock entfernt haben, legen Sie die Oberseite der Kassette auf die Form.Mit heißem Flüssigparaffin abkühlen lassen und es über Nacht auf Raumtemperatur abkühlen lassen. Nachdem Sie den Leberblock aus der Form entfernt haben, verwenden Sie ein Mikrotome, um durch die oberflächliche Rückenseite der Leber zu sektionieren und fünf Mikrometerabschnitte zu machen. Überprüfen Sie die oberflächlichen Abschnitte unter einem Seziermikroskop, um sicherzustellen, dass die Abschnitte nicht geschoren oder gefaltet sind.Um Dias für die Immunhistochemie zu verarbeiten, wählen Sie einen Dia pro zu analysierendem Genotyp aus und waschen Sie ihn 15 Minuten lang in Xylol, 100 %Ethanol, 95 % Ethanol und schließlich 70 %Ethanol. Nachdem Sie die Rutsche in das ionisierte Wasser gewaschen haben, tauchen Sie sie in tris-basierte High pH-Antigen-Retrieval-Lösung ein. Dann erhitzen Sie es unter Druck in einem Schnellkochtopf für drei Minuten bei 10 Pfund pro Quadratzoll.Nachdem Sie die Folie auf Raumtemperatur abkühlen lassen, verwenden Sie einen PAP-Stift, um die Abschnitte auf der Folie zu skizzieren. Nach dem Waschen mit PBS Tween, blockieren Sie die Gewebeabschnitte durch Zugabe von 100 Mikroliter Blockierlösung pro Abschnitt und inkubieren bedeckt bei vier Grad Celsius für eine Stunde. 100 Mikroliter der verdünnten Antikörperlösung, die alle drei primären Antikörper enthält, auf jeden Abschnitt auftragen und über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren.Nach dem Waschen der Dias 100 Mikroliter der sekundären Antikörperlösung hinzufügen, die sowohl sekundäre Antikörper enthält, als auch eine Stunde bei Raumtemperatur inkubieren. Schließlich montieren Medium und einen Deckelschlupf auf die Dias auftragen. Verwenden Sie ein Fluoreszenzmikroskop, um 20x Bilder mit 1x Zoom pro Abschnitt aufzunehmen.Stellen Sie sicher, dass jede Portalvene in der Leber abgebildet ist. Erstellen Sie eine Kalkulationstabelle mit den folgenden Spalten:Tier-/Beispielnummer, Bildnummer, Anzahl der Portalvenen und Anzahl der Gallengänge. Identifizieren und zeichnen Sie die Anzahl der Portalvenen pro Bild für jedes Bild auf.Identifizieren Sie dann die augguktionskanäle in jedem Bild durch das Vorhandensein von Cholangiozyten, die ein definierbares Lumen umgeben. Diese Strukturen sollten durch Mesenchym von anderen Breitband-Cytokeratin-positiven Zellen getrennt und getrennt sein. Eine der größten Herausforderungen dieser Technik besteht darin, patente Gallengänge zu identifizieren.Um zu bestimmen, was ein Patentkanal ist, muss die Form des Kanals und die Zellen, die das Lumen umgeben, analysiert werden. Zählen Sie jeden Augenkanal des Patents und platzieren Sie ihn in derselben Spalte wie die Bildnummer, und wiederholen Sie ihn für jedes Portalvenenbild. Schließlich berechnen Sie die Summe aller Portalvenen und aller Gallengänge in der Leberprobe und berechnen Sie das Gallenkanal-Zuglas-Portal-Venenverhältnis für die Leberprobe.P30-Mausleber wurden für CK8 und CK19 zusammen mit dem Gefäßmarker alpha-SMA geschnitten und mitgefärbt, um das BD-PV-Verhältnis zu bestimmen. Wenn alle Portalvenen in jedem Leberlappen abgebildet sind, wurden Portalvenen als alpha-SMA-gefärbte Gefäße definiert, die benachbarte Breitspektrum-Cytokeratin-Färbunghaben haben. Die Alpha-SMA-Fleckenstrukturen ohne Breitspektrum-Cytokeratin waren zentrale Venen, die von der Analyse ausgeschlossen wurden.Patentkanäle haben ein deutlich definierbares Lumen, das von Breitspektrum-Cytokeratin-positiven Cholangioktyes umgeben ist und in der Regel durch Mesenchym von nahegelegenen Kanälen oder Cholangiozyten getrennt ist. Breitspektrum-Zytokeratin-positive Zellen, die kein definierbares Lumen haben, werden nicht auf die Gesamtzahl der Gallengänge angerechnet. Leberabschnitt von einem Wildtier zeigt eine Portalvene, die mit einem vollständig patentierten Kanal zusammen mit mehreren nicht inkorporierten Zellen verbunden ist.Repräsentative Lebersektion eines JAG1 heterozygoten Tieres zeigt, dass keine patenten Gallengänge um die drei Portalvenen vorhanden sind. Alle Breitspektrum-Zytokeratin-positiven Zellen sind hier nicht inkorporiert und sollten daher nicht gezählt werden. Die Analyse des BD-PV-Verhältnisses für drei Wildtyp- und drei JAG1-Heterozygot-Tiere zeigt, wie die beiden Genotypen anhand der Gallengangszahl leicht unterschieden werden können.Es ist wichtig, alle Portalgefäße auf Gallenwege zu prüfen. Es ist besonders wichtig für die Bestimmung der Gallengangsdichte, wenn es phänotypische Variabilität in der Leber gibt. Diese Technik wurde verwendet, um einen genetischen Unterdrücker des gallenhaften Phänotyps in einem Mausmodell von Helgason zu identifizieren.Daher kann es bei der Bewertung der Behandlungsmodalitäten von Tiermodellen von Gallenkrankheit nützlich sein.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analyse von Zebrafisch-Larven Skelettmuskel Integrität mit Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Stimulation of Notch Signaling in Mouse Osteoclast Precursors

Die Stimulation der Notch-Signalweg in Maus-Osteoklasten Precursors

Notch signaling is a key component of multiple physiological and pathological processes. The nature of Notch signaling, however, makes in vitro ...

Histological Analyses of Acute Alcoholic Liver Injury in Zebrafish

Histologische Analysen der akuten alkoholischen Leberverletzung in Zebrafisch

Alcoholic Liver Disease (ALD) refers to damage to the liver due to acute or chronic alcohol abuse. It is among the leading causes of alcohol-related ...

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

In-vitro- Wachstum der Maus Preantral Follikel in simulierter Schwerelosigkeit

14 day-old mouse ovarian tissue and preantral follicles isolated from same-aged mice were incubated in a simulated microgravity culture system. We ...

Quantifying Branching Density in Rat Mammary Gland Whole-mounts Using the Sholl Analysis Method

Quantifizierung der Verzweigungsdichte in Ratten-Mamma-Gland-Vollkonserven unter Verwendung der Sholl-Analysemethode

An increasing number of studies are utilizing the rodent mammary gland as an endpoint for assessing the developmental toxicity of a chemical exposure. The ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

Live Imaging der Maus Sekundärer Gaumen Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissektion, Immunofluorescent Färbung der Pilz Körper und Photorezeptor Neuronen im Gehirn Erwachsener Taufliege melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

A Novel Use of Three-dimensional High-frequency Ultrasonography for Early Pregnancy Characterization in the Mouse

Eine neue Verwendung des dreidimensionalen Hochfrequenz-Sonographie zur frühen Schwangerschaft Charakterisierung in der Maus

High-frequency ultrasonography (HFUS) is a common method to non-invasively monitor the real-time development of the human fetus in utero. The mouse is ...

A Familial Hypercholesterolemia Human Liver Chimeric Mouse Model Using Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocytes

Eine familiäre Hypercholesterinämie menschlichen Leber chimärer Maus-Modell mit induzierten pluripotenten Stammzellen gewonnenen Hepatozyten

Familial hypercholesterolemia (FH) is mostly caused by low-density lipoprotein receptor (LDLR) mutations and results in an increased risk of early-onset ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualisierung der Knoten und Notochordal Platte In Gastrulating Maus-Embryonen mittels Rasterelektronenmikroskopie und ganze Mount Immunfluoreszenz

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...